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人工模拟鼠伤寒沙门氏菌在绿豆芽中的内化定殖能力及其消毒处理



全 文 :
人工模拟鼠伤寒沙门氏菌在绿豆芽中的内化定殖能力及其消毒处理
马文娟,石建春,冯秋实,李锦铨*,王小红
(华中农业大学食品科技学院,湖北 武汉 430070)

摘要:本研究以绿豆为作用载体,研究鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)在绿豆的不同发芽阶段在绿豆芽中
的内化定殖能力及其影响因素,在此基础上,采用紫外照射和化学消毒剂处理两种方法对定殖在绿豆芽中
的鼠伤寒沙门氏菌进行消毒处理,探索消除绿豆芽中定殖的鼠伤寒沙门氏菌的有效方法。结果表明:在绿
豆发芽前期的4个不同的时段(0-48h内):吸胀期(G1,0h)、萌动期(G2,0-12h)、发芽初期(G3,12-24h)、
发芽期(G4,24-48h),分别接种不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)(102、104、106、108CFU/mL)
时,鼠伤寒沙门氏菌在豆芽中的内化定殖能力不同,但在绿豆发芽的生长周期(约为144h)结束时,4个不
同接种时段的鼠伤寒沙门氏菌的内化量趋于相同。对绿豆芽中内化定殖的鼠伤寒沙门氏菌的消毒处理结果
表明,紫外照射消毒处理对内化定殖的鼠伤寒沙门氏菌有明显的去除效果,而次氯酸钠溶液和硝酸银溶
液浸泡处理对内化的鼠伤寒沙门氏菌的去除效果并不明显。
关键词:绿豆芽;鼠伤寒沙门氏菌;内化;消毒处理

Study on the Internalization Colonize Ability and Disinfection Treatment of Salmonella
Typhimurium in Mung Bean Sprouts by Artificial Contamination Method
MA Wen-juan, SHI Jian-chun, FENG Qiu-shi, LI Jin-quan*, Wang Xiao-hong
(College of Food Science and technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070, China)

Abstract: In this paper, the internalization colonize ability of Salmonella Typhimurium(ATCC14028)in mung
bean sprouts during the different germination stages were studied by artificial contamination method. On this basis,
two methods of ultraviolet irradiation and chemical disinfectant treatment were developed to eliminate internalized
Salmonella Typhimurium effectively. During the four different time periods (0-48 h) in pre-germination stage of
mung bean, these were expansion period(G1,0 h)、budding dates (G2,0-12 h)、early germination (G3,12-24 h)、
germination period(G4,24-48 h), Salmonella Typhimurium had different internalization colonize ability being
inoculated different concentrations (102、104、106、108 CFU/mL). Internalized quantity tended to be the same at the
end of the growth cycle (about 144 hours) of the mung bean sprouts. The results of disinfection treatment of
internalized Salmonella Typhimurium in mung bean sprouts showed that ultraviolet radiation disinfection could
effectively eliminate internalized Salmonella Typhimurium while dip-treatment in sodium hypochlorite solution
and silver nitrate solution had no obvious effect.
Keywords: Mung bean sprout; Salmonella Typhimurium; Internalization; Disinfection treatment
1中图分类号:TS252.1 文献标志码:A
食源性病原微生物污染造成的食源性疾病是当今世界上最严峻的食品安全问题之一[1-3]。沙门氏
菌作为常见食源性致病菌,引起的细菌性食物中毒事件占全国此类事件的 40%~60%,是食品安全检
测中的重点监测对象[4]。蔬菜是人类的基本食物来源之一,可提供人体健康所必需的维生素、膳食纤
维和矿物质等,在人们的膳食结构中具有特殊重要的地位。由于生鲜蔬菜能最大限度地保留营养元素,

项目:湖北省科技支撑计划(No. 2014BBB016);华中农业大学‘国家级大学生创新创业训练计划’
(No.2016105042016067)
作者简介:马文娟( 1991- ),女,硕士研究生,主要从事食品微生物与食品安全研究。
Email:1252539627@qq.com
*通讯作者:李锦铨( 1986-),男,博士,讲师,主要从事食品生物技术与安全研究。Email:
lijinquan@mail.hzau.edu.cn
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网络出版时间:2016-07-15 09:47:01
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20160715.0947.030.html

又能提供新鲜口感,有些生鲜蔬菜还可以减少一些癌症和心血管疾病等慢性疾病的发生,因此,生鲜
蔬菜不论作为配菜、凉菜还是制作沙拉越来越受到广大群众青睐,如豆芽,生菜,香菜,黄瓜,番茄
等。然而,近年来一些研究表明,食源性病原微生物可以通过不同的途径进入到生鲜蔬菜中,并能在
其中定居和不断生长、繁殖后代,这种现象通常称为病原菌定殖,此类菌即称为“内化菌”[5-8]。低
浓度的次氯酸钠和硝酸银对果蔬的浸泡处理是最常见的表面化学消毒方法,能够有效杀灭果蔬表面的
微生物,有学者研究表明[9],用 2%的次氯酸钠和 1%的硝酸银分别对生鲜绿豆芽表面处理 30min 和
5min,可有效去除表面的沙门氏菌,但对已经内化进去的沙门氏菌起不到很好的杀菌效果。所以,一
般的清洗和消毒方法如次氯酸钠、硝酸银等消毒剂仅仅可以杀灭蔬菜表面的病原菌,而对于进入到蔬
菜内部的病原菌是无法清除的。又因为生鲜蔬菜仅经过很少的处理和加工,而且常常直接生吃或凉拌
后食用,食源性病原菌污染带来的风险非常大[9-13]。绿豆芽是绿豆种子萌发后长出数厘米长的幼芽,
可作为蔬菜食用,称之为豆芽菜,人类自古就有食用豆芽菜的习惯,现代人喜之更甚[14],但是随着对
绿豆芽消费的不断增加,以沙门氏菌为首导致的食物源性疾病的爆发频率也不断增加[15-17]。例如 2011
年 5 月由德国蔓延并不断扩散至瑞典、丹麦、荷兰与英国等国的“毒豆芽”事件,让欧洲一时陷入恐慌,
再一次给食源性疾病的防治敲响警钟。2011 年 6 月 13 日止,世界卫生组织(WHO)公布数据显示德国
34 人死亡,瑞典、丹麦、英国和荷兰在内的多个国家均已报告感染病例,全球共有 3255 例感染或者
疑似感染病例[18]。
本研究以绿豆为作用载体,在绿豆发芽前期的 4 个不同时段(0-48h 内),采用人工污染方式,
接种不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028),并在绿豆发芽的整个周期(绿豆的发芽周期约 144h)
间隔取样分析,采用平板计数法,研究鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)在绿豆芽中的内化定殖能力。
在此基础上,采用紫外照射和化学消毒剂处理两种方法对定殖在绿豆芽中的鼠伤寒沙门氏菌进行消毒
处理,探索消除定殖在绿豆芽中的鼠伤寒沙门氏菌的有效方法,为有效控制生鲜蔬菜中的内化病原菌
提供科学依据和指导。

1 材料与方法

1.1 材料
鼠伤寒沙门氏菌 ATCC14028:实验室冷藏保存;绿豆:购于武汉市洪山区梧桐路中百超市;白
沙:购于武汉市洪山区南湖大道花木城市场。
1.2 仪器与药品
生化培养箱 SPX-250B 型,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;离心机 eppendorf centrifuge
5417R,艾本德中国有限公司;紫外灯 TUV15W G15T8,Philips。
TSB 胰蛋白胨大豆肉汤培养基、TSA 大豆酪蛋白琼脂培养基、LB 培养基,青岛高科园海博生物技术
有限公司;硝酸银、无水乙醇、次氯酸钠等,国药集团化学试剂有限公司。
1.3 方法
1.3.1 鼠伤寒沙门氏菌 ATCC14028 的活化及悬菌液的制备
取鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)平板(4℃下保存),无菌条件下挑取少许菌落于 10mL LB 中,
37℃、120r/min 培养 10h。将培养液转移至 50mL 离心管中,6000r/min 离心 10min 后,用 PBS 重复
洗涤菌体三次,获得菌悬液。用平板计数法计数菌悬液的细菌浓度,然后将其稀释至浓度为 102、104、
106、108CFU/mL 备用。
1.3.2 无菌绿豆芽的准备
1.3.2.1 绿豆种子表面消毒处理
挑选表面完整无褶,颗粒饱满大小相当的绿豆种子 20 颗,置于洁净干燥的烧杯中,加入 80%酒
精浸泡 10s,倾出酒精后加入 1%硝酸银溶液浸泡 5min,最后用 1:1 体积无菌水清洗三次[19-21],于室
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温下干燥 1h 备用。
1.3.2.2 绿豆发芽前期 4 个不同时段(0-48h 内)样品的准备
用无菌镊子将经消毒处理的绿豆转移至已灭菌装有 50g 白沙的三角锥形瓶中,添加 15mL 无菌水
使刚好没过白沙及绿豆,加塞封口,置于 28℃的恒温箱中避光培养。在绿豆的发芽过程中,为了便
于研究鼠伤寒沙门氏菌在绿豆芽中的定殖情况,我们将绿豆发芽的前期分为 4 个不同的时段(0‐48h
内):吸胀期(G1,0h)、萌动期(G2,0-12h)、发芽初期(G3,12-24h)、发芽期(G4,24-48h),具
体如图 1 所示。在经历上述发芽前期的 4 个不同时段后,绿豆继续在 28℃的恒温箱中避光培养进行
发芽,绿豆从种子发芽到可以食用阶段的整个生长周期约为 144h。





图 1 绿豆发芽前期的 4 个不同时段(0-48h 内)
Fig. 1 4 Different stages in early growing progress of Mung bean sprouts(0-48h)
1.3.3 鼠伤寒沙门氏菌在绿豆芽中内化定殖能力的研究
1.3.3.1 鼠伤寒沙门氏菌人工污染绿豆芽样品的准备
按 1.3.2.2 方法准备好绿豆发芽前期 4 个不同时段(0‐48h 内)的样品,按照每瓶 4mL 的接菌量,
将 1.3.2.1 活化的鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)菌悬液接种到培养有不同时段的吸胀期(G1,0h)、
萌动期(G2,0-12h)、发芽初期(G3,12-24h)、发芽期(G4,24-48h)绿豆芽的样品中。接种完毕后,
置于 28℃恒温箱中继续避光培养,并在绿豆从种子发芽到可以食用的整个生长周期(约为 144h)的
不同时间段,取出一定量的样品,备用,每个样品做三个平行,即每 24h 进行取样和平板菌落计数,
用来研究不同接种浓度的鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)在绿豆的不同发芽时期在绿豆芽中的内化定
殖能力。以接种量 102CFU/mL 为例,鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)在绿豆发芽前期的接种时间和
绿豆芽样品的取样时间见表 1。
表 1 鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)(接种量 102CFU/mL)在绿豆发芽前期的接种时间和绿豆芽样品的取样时间
Table 1 The inoculation time of SamonellaTyphimuriumATCC14028 (quantity of 102CFU/mL) in the early germination and the
sampling time of mung bean sprouts
接种时期
绿豆芽样品的取样时间(h)
24h 48h 72h 96h 120h 144h
吸胀期(G1,0h) + + + + + +
萌动期(G2,12h) – + + + + +
发芽初期(G3,24h) – + + + + +
发芽期(G4,48h) – – + + + +
注:“+”表示取样,“–”表示不取样
1.3.3.2 绿豆芽样品的表面消毒处理
将装有不同发芽阶段鼠伤寒沙门氏菌人工污染的绿豆芽样品(1.3.3.1 方法制备)的三角瓶从 28℃
恒温箱中取出,用无菌镊子从中取出两根绿豆芽,分别置于 10mL 无菌 EP 管中,用 80%酒精溶液浸
吸胀期
(G1,0h)
萌动期
(G2,0-12h)
发芽初期
(G3,12-24h)
发芽期
(G4,24-48h)
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泡处理 10s,1% AgNO3处理 5min,最后用等体积无菌水清洗三次,备用[22-24]。该方法可有效去除粘
附在绿豆芽表面的沙门氏菌,而无法清除已经内化定殖在绿豆芽内部的沙门氏菌。
1.3.3.3 绿豆芽中内化定殖鼠伤寒沙门氏菌的计数
将1.3.3.2制备得到的表面消毒处理的绿豆芽中加入500μL的PBS缓冲液,无菌匀浆棒匀浆,并进行
10倍次梯度稀释。吸取100μL三个不同稀释倍数的稀释液于TSA平板上,并用无菌涂布棒涂布均匀。
将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养18h后进行菌落计数,以观察鼠伤寒沙门氏菌在绿豆芽中的内化
定殖能力。实验中,每份绿豆芽样品平行取样,并重复3次,菌落平板计数严格遵循计数规则。
1.4 绿豆芽中内化定殖鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)的消毒处理
1.4.1 绿豆芽中内化定殖鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)样品的准备
分别按 1.3.2.1 方法准备鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)的菌悬液和 1.3.2.1 方法准备表面消毒处
理的绿豆种子。用无菌镊子将经消毒处理的绿豆转移至已灭菌装有 50g 白沙的三角锥形瓶中,添加
15mL 无菌水使刚好没过白沙及绿豆,接种 106CFU/mL 鼠伤寒沙门氏菌后加塞封口,置于 28℃的恒
温箱中避光培养 144h。144h 后,取一定量的绿豆芽样品,按 1.3.3.2 的方法首先进行绿豆芽样品的表
面消毒处理,然后再按下面 1.4.2 中的 3 种消毒方法分别处理。
1.4.2 绿豆芽中内化定殖鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)样品的 3 种消毒处理
将 2.4.1 得到的已表面消毒处理的绿豆芽样品,按下列 3 种方法分别进行处理,观察这 3 种消毒
方法对绿豆芽中内化定殖鼠伤寒沙门氏菌的处理效果。消毒方法如下[25]:
紫外线照射处理:将紫外处理箱提前开灯照射10min。然后将绿豆芽样品放入无菌空培养皿中,
开盖置于紫外处理箱中灯下垂直照射的同一位置以获取同等的照射强度,分别照射处理10min,20min,
30min。
次氯酸钠溶液消毒处理:分别用不同浓度(0.005%,0.01%,0.02%)(m/v)的次氯酸钠溶液对
绿豆芽样品进行浸泡处理10min。
硝酸银溶液消毒处理:分别用不同浓度(0.500%,1.00%,2.00%)(m/v)的硝酸银溶液对绿豆
芽样品进行浸泡处理10min。
1.4.3 3 种消毒方法处理后的绿豆芽样品中残留内化定殖鼠伤寒沙门氏菌的计数
将1.4.2中3种消毒方法处理后的绿豆芽用无菌水清洗三次,按1.3.3.3方法进行内化定殖鼠伤寒沙
门氏菌的计数,同时以未进行消毒处理的绿豆芽样品做空白对照。

2 结果与分析

2.1 同一浓度鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)在绿豆发芽前期4个不同时段(0-48h内)接种时在绿
豆芽中的内化定殖能力分析
以绿豆为作用载体,采用人工污染的方式,在绿豆发芽前期 4 个不同时段(0-48h 内)接种同一
浓度的鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028),比较相同浓度的鼠伤寒沙门氏菌在绿豆发芽不同时期中的内
化定殖能力,以掌握鼠伤寒沙门氏菌内化定殖于绿豆芽组织中的关键时期,结果如图 2 所示。


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图 2 ATCC14028 在绿豆芽中的内化定殖能力与接种时期的关系
Fig. 2 The relationship between internalization ability and inoculum period of ATCC14028
图 2 中 A、B、C、D 分别表示鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)的接种浓度为 102、104、106、108CFU/mL。
由图 2A 可知,当鼠伤寒沙门氏菌浓度为 102CFU/mL 时,在绿豆发芽前期的发芽初期(G3)接种,鼠伤
寒沙门氏菌的内化能力最强,内化菌量可以达到 104CFU/g;当鼠伤寒沙门氏菌浓度为 104CFU/mL 时,
在绿豆发芽前期的吸胀期(G1)、萌动期(G2)、发芽初期(G3)接种,鼠伤寒沙门氏菌的内化菌量变
化不大,均约为 105CFU/g(图 2B);当鼠伤寒沙门氏菌浓度为 106CFU/mL 时,在绿豆发芽前期的吸
胀期(G1)接种,内化菌量最大,可达 107CFU/mL 左右(图 2C);当鼠伤寒沙门氏菌浓度为 108CFU/mL
时,鼠伤寒沙门氏菌的内化菌量依次是 G1>G2>G3>G4(图 2D)。但在绿豆发芽的生长周期(约为
144h)结束时,4 个不同接种时段的鼠伤寒沙门氏菌的内化量趋于相同。
2.2 不同浓度鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)在绿豆发芽前期(0-48h内)同一接种时段时在绿豆芽
中的内化定殖能力分析
以绿豆为作用载体,采用人工污染的方式,在绿豆发芽前期(0-48h 内)的同一接种时段接种不
同浓度的鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028),比较不同浓度鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)在绿豆发
芽过程中在绿豆芽中的内化定殖能力,结果如图 3 所示。


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图 3 ATCC14028 的内化能力与接种浓度的关系
Fig.3 The relationship between internalization ability and inoculum concentration of ATCC14028
图 3 中 A、B、C、D 分别表示鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)在绿豆发芽前期(0‐48h 内)的吸
胀期(G1)、萌动期(G2)、发芽初期(G3)、发芽期(G4)的同一时段接种时的内化能力结果。由图
3A 可知,鼠伤寒沙门氏菌在绿豆芽中的内化能力与其接种浓度基本呈正相关,当接种浓度为
108CFU/mL 时,绿豆芽生长第 72h 到第 120h 时,内化量最高可达到 107CFU/mL 左右。由图 3B 可知,
当鼠伤寒沙门氏菌浓度为 102CFU/mL,在绿豆芽发芽的前 96h 中,鼠伤寒沙门氏菌基本未内化到绿豆
芽中,在第 120h、144h 时才有约 104CFU/g 的鼠伤寒沙门氏菌内化到绿豆芽中。从整体上来说,随着
鼠伤寒沙门氏菌接种浓度的加大,绿豆芽中内化的菌量也随之增加,接种浓度为 108CFU/mL 时,菌
的内化能力最强。图 3C 表明,102、104、106CFU/mL 这 3 个接种浓度对应的绿豆芽中鼠伤寒沙门氏
菌的内化量差别不大,约为 105CFU/g;但均低于接种浓度为 108CFU/mL 的内化菌量。图 3D 表明,
在发芽期(G4)接种时,鼠伤寒沙门氏菌浓度为 108CFU/mL 时内化能力最强,接种浓度为 106CFU/mL
的次之。
2.3 绿豆芽中内化定殖鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)的消毒处理
在销售和食用前对已收获的新鲜农产品进行消毒处理是必不可少的。本研究中,在绿豆芽的发芽
过程中人工污染鼠伤寒沙门氏菌(106CFU/mL),以模拟绿豆芽发芽过程中受到病原菌污染的状态,
采收后通过3种消毒方法对比处理已经内化了沙门氏菌的绿豆芽,探索消除内化定殖在绿豆芽中的鼠
伤寒沙门氏菌的有效方法,实验结果如图4所示。

图 4 绿豆芽中内化定殖鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)的消毒处理
Fig.4Disinfection of salmonella in mung bean sprouts after irrigation with contaminate water
紫外线照射是一种传统的非热杀菌方法,公众接受度高。由图4可知,采用紫外照射消毒处理,
对收获后绿豆芽中内化定殖的鼠伤寒沙门氏菌有明显的去除效果。绿豆芽中内化的鼠伤寒沙门氏菌从
紫外线照射的10min之后开始显著降低,当紫外线照射处理30min内化鼠伤寒沙门氏菌可减少约4 log
CFU/g。低浓度的次氯酸钠溶液和硝酸银溶液浸泡处理是常见的表面化学消毒处理方法,能够有效杀
灭果蔬表面的微生物,但图4的实验结果表明,采用次氯酸钠溶液和硝酸银溶液浸泡处理,对收获后
绿豆芽中内化的鼠伤寒沙门氏菌的去除效果并不明显,其原因有待于进一步研究。

3 结 论

本实验采用人工模拟污染实验,研究了鼠伤寒沙门氏菌在绿豆芽中的内化定殖能力及影响因素。
结果表明:当鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)接种浓度为102CFU/mL时,在绿豆发芽前期(0-48h内)
中发芽初期(G3,12-24h)的内化能力最强。当接种浓度大于104CFU/mL时,在绿豆发芽前期的吸胀
期内化能力最强,发芽期最弱。当接种浓度为108CFU/mL时,鼠伤寒沙门氏菌的内化定殖量最高可达
到1.1×107CFU/g。对同一浓度鼠伤寒沙门氏菌在绿豆发芽前期4个不同时段(0-48h内)接种时在绿豆
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芽中的内化定殖能力分析可知,在吸胀期,鼠伤寒沙门氏菌内化程度基本与接种浓度呈正相关。出现
这一现象的原因可能是在该阶段接种,沙门氏菌与绿豆芽接触的时间周期最长,并且绿豆种子在发芽
初期会迅速吸水,沙门氏菌会随着水分进入种子内,随着绿豆芽的生长在其组织中定植与繁殖;对不
同浓度鼠伤寒沙门氏菌在绿豆发芽前期(0-48h内)同一接种时段时在绿豆芽中的内化定殖能力分析
可知,鼠伤寒沙门氏菌在绿豆芽中的内化能力与其接种浓度近似呈正相关,随着鼠伤寒沙门氏菌接种
浓度的加大,绿豆芽中内化的菌量也随之增加,其中接种浓度为108CFU/mL时,菌的内化能力最强。
对绿豆芽中内化定殖的鼠伤寒沙门氏菌的消毒处理结果表明,紫外照射消毒处理对内化定殖的鼠伤寒
沙门氏菌有明显的去除效果,但不能完全清除,而次氯酸钠溶液和硝酸银溶液浸泡处理对内化的鼠伤
寒沙门氏菌的去除效果并不明显。此结果表明,食源性病原菌一旦污染新鲜农产品很难完全消除,传
统的消毒方法虽然可以减少表面微生物数量,但不能消除已内化定殖在农产品内部的病原微生物,食
用该类新鲜农产品具有一定的安全风险。

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