全 文 ：颈霉的乙酸乙酯萃取物发现其抑菌效果仍以丝状半知菌为主[ 8] 。本实验中 CR-9512菌株
所分泌的抗菌物质 , 具有相对限定的抗酵母特性 , 与上述虫草菌素和环孢菌素显著不
同。迄今 , 自然界中此类真菌的专一广谱抗酵母现象尚未见报道。
另外 , 经过 30d不间断观察 , 未见 CR-9512有产孢结构 , 据此可能不是宿主的原发
病原菌 (但显然与该虫草关系密切), 属共生抑或寄生待研究。
CR-9512菌株抗酵母的原因 、抗酵母物质的成分和结构尚待进一步的研究。
参 考 文 献
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＊国家自然科学基金重点资助项目 (No.39730010)
Project Granted by Chinese National Natural Science Fund (No.39730010)
收稿日期:2002-04-25 , 修回日期:2001-06-25
分离自杭子梢等 3个宿主的根瘤菌的表型分析＊
韩素贞1 , 2 陈文新1
(中国农业大学生物学院 北京 100094)1 (首都师范大学生物系 北京 100037)2
摘要:对 86 株分离自杭子梢 、 决明和菜豆的根瘤菌及 20 株已知参比菌进行了数值分类和全
细胞蛋白SDS-PAGE的表型分析。在数值分类聚类中 , 所有供试菌在 68%的相似性水平上
分为两群。群 I为快生和中慢生根瘤菌 , 群 II为慢生根瘤菌。群 I 在 85%的相似性水平上
又可分为 3 个亚群 , 群 II在 76%的相似性水平上分为 3 个亚群。蛋白电泳结果表明 , 群 I
在68%的相似性水平上 , 分为 4 个亚群 , 其中亚群 1 和亚群 2 相当于数值分类中的亚群 1 ,
亚群 3和亚群 4 与数值分类中的亚群 2和亚群 3 相对应;群 II 在59%的相似性水平上分为 3
个亚群 , 分别与数值分类中的亚群 3、 亚群 1 和亚群 2大致对应。这说明两种方法在分类上
得到的结果比较接近。正在通过进一步的实验确定两种方法一致的未与已知菌株聚在一起
的亚群的分类地位。研究结果还表明 , 三种宿主的根瘤菌存在着多样性。
关键词:根瘤菌 , 数值分类 , 全细胞蛋白 SDS-PAGE , 多样性
中图分类号:Q939.11 文献标识码:A 文章编号:0253-2654 (2003)02-0004-07
PHENOTYPIC ANALYSIS OF RHIZOBIA ISOLATED FROM THREE HOSTS
HAN Su-Zhen1, 2 CHEN Wen-Xin2
(Department of Biology of Capital Normal University , Beijing 100037)1
(College of Biological Science , China Agricultural University , Beijing 100094)2
Abstract:86 strains of rhizobia isolated from root nodules of Campylotropis , Cassia and Phaseolus were classified by nu-
merical taxonomy and SDS-PAGE of whole cell proteins.20 reference strains were included for comparison.The strains
formed 2 groups by numerical taxonomy at 68% similarity.Group I contained all of fast and medium-slow growing strains
and group II slow growing strains.Group I and II were divided into three subgroups at 85% and 76% similarity respec-
·4· 微生 物学 通报 2003年 30 (2)
DOI :10.13344/j.microbiol.china.2003.02.002
tively.The result of SDS-PAGE of whole cell proteins indicated that group I might be divided into four subgroups and
group II three subgroups at 68% and 59% similarity respectively.Ingroup I , subgroup 1 and 2 corresponded to subgroup
1 of numerical taxonomy , subgroup 3 and 4 to the other two subgroups 2 and 3 of numerical taxonomy respectively.In
group II , three subgroups corresponded basically to subgroup 3 , 1 and 2 of numerical taxonomy.It showed that we could
get close results by these two methods.The common subgroups of the two methods , which did not cluster with the estab-
lished, were being identified by further study.The results also suggested that diversity existed among the rhizobia of the
three hosts.
Key words:Rhizobia , Numerical Taxonomy , SDS-PAGE of Whole Cell Proteins , Diversity
杭子梢为灌木或半灌木 , 主要分布于我国西南部 , 较耐干旱 , 是水土保持的重要树
种 , 对土壤有改良作用。决明为灌木状草本 , 在我国各地都有栽培 , 种子可入药 , 有清
肝明目等功用。菜豆为草本 , 在我国常年栽种 , 除了嫩荚可以食用外 , 果实也有药用价
值。分离自杭子梢和决明的根瘤菌国内外研究很少 , 目前尚未确定分类地位 。分离自菜
豆的根瘤菌被定名为豌豆根瘤菌菜豆生物型 (Rhizobium leguminosarum bv.phaseoli)[ 1] ,
随着对它的遗传多样性的了解 , 人们从这个生物型中命名了 4个新种[ 2～ 4] 。我国地形复
杂 , 气候多样 , 但对分离自菜豆的根瘤菌的遗传多样性研究尚未开展。
数值分类是多元方差分析理论与计算机相结合的产物。它的应用 , 使对大量细菌进
行大量表型性状的分析比较成为可能 , 对菌株同源群的划分特别有效[ 5] 。1964年 Gra-
ham[ 6]首先用该法分析了根瘤菌及相关的种。此后 , 数值分类广泛应用于根瘤菌的分类
研究[ 7] 。全细胞蛋白 SDS-PAGE分析可以区分同一条件下培养的细胞蛋白组分 , 通过聚
类 , 同样可以对大量根瘤菌菌株进行初步分群[ 9 ,10] 。
本研究采用数值分类和全细胞蛋白 SDS-PAGE 的表型分析 , 初步考察来自杭子梢 、
决明和菜豆的根瘤菌的分类地位和多样性以及两种分群方法是否可以相互印证 。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
本试验共选用菌株 106株 , 其中参比菌 20株 , 分别属于 Agrobacterium 、 Bradyrhizobi-
um 、 Mesorhizobium 、 Rhizobium 、 Sinorhizobium 和Allorhizobium 6个属;供试菌 86株 , 来源
于云南 、 四川 、 江西 、安徽 、 湖北 、 天津 、 山西 、 陕西 、 甘肃 、 内蒙古自治区和青海
省 , 宿主植物为菜豆 (Phaseolus vulgaris)以及决明 (Cassia)和杭子梢(Campylotropis)两
个属中的部分种 (见表 1)。
表1 供试菌株一览表
菌 株 寄 主 来源 菌 株 寄 主 来源
CCBAU43159 Campylotropis delavayi 湖北 CCBAU43188 Cassia tora 湖北
CCBAU65052 Campylotropis delavayi 云南 CCBAU33061 Cassia tora 江西
CCBAR65053 Campylotropis delavayi 云南 CCBAU33115 Cassia tora 江西
CCBAU65054 Campylotropis delavayi 云南 CCBAU33162 Cassia tora 江西
CCBAU65108 Campylotropis delavayi 云南 CCBAU33215 Cassia tora 江西
CCBAU65161 Campylotropis delavayi 云南 CCBAU23158 Cassia tora 安徽
CCBAU65162 Campylotropis delavayi 云南 CCBAU23216 Cassia tora 安徽
CCBAU65163 Campylotropis delavayi 云南 CCBAU23221 Cassia tora 安徽
CCBAU65164 Campylotropis delavayi 云南 CCBAU65260 Cassia nomane 云南
接下页表格
·5·2003年 30 (2) 微 生物 学通 报
接上页表格
菌 株 寄 主 来源 菌 株 寄 主 来源
CCBAU65192 Campylotropis delavayi 云南 CCBAU61386 Cassia nomane 四川
CCBAU65193 Campylotropis delavayi 云南 CCBAU61390 Cassia nomane 四川
CCBAU65194 Campylotropis delavayi 云南 CCBAU61391 Cassia nomane 四川
CCBAU65195 Campylotropis delavayi 云南 CCBAU33227 Phaseolus vulgaris 江西
CCBAU65237 Campylotropis delavayi 云南 CCBAU23023 Phaseolus vulgaris 安徽
CCBAU65238 Campylotropis delavayi 云南 CCBAU23213 Phaseolus vulgaris 安徽
CCBAU65155 Campylotropis prainii 云南 CCBAU33033 Phaseolus vulgaris 江西
CCBAU65156 Campylotropis prainii 云南 CCBAU33053 Phaseolus vulgaris 江西
CCBAU65157 Campylotropis prainii 云南 CCBAU33056 Phaselous vulgaris 江西
CCBAU65158 Campylotropis prainii 云南 CCBAU33154 Phaseolus vulgaris 江西
CCBAU65201 Campylotropis prainii 云南 CCBAU33148 Phaseolus vulgaris 江西
CCBAU65202 Campylotropis prainii 云南 CCBAU33173 Phaseolus vulgaris 江西
CCBAU30130 Campylotropis macrocarpa 天津 CCBAU43213 Phaseolus vulgaris 湖北
CCBAU30206 Campylotropis macrocarpa 天津 CCBAU43184 Phaseolus vulgaris 湖北
CCBAU30233 Campylotropis macrocarpa 天津 CCBAU43160 Campylotropis delavayi 湖北
CCBAU23195 Phaseolus vulgaris 安徽
CCBAU81433 Phaseolus vulgaris 青海 Agarobacteria tumefacien
CCBAU03136 Phaseolus vulgaris 山西 IAM13129T 日本
CCBAU03286 Phaseolus vulgaris 山西 A.rubi
CCBAU03029 Phaseolus vulgaris 山西 IAM13569T 日本
CCBAU03244 Phaseolus vulgaris 山西 Bradyrhizobium japonicum
CCBAU71181 Phaseolus vulgaris 陕西 USDA6T Glycine max 美国
CCBAU71197 Phaseolus vulgaris 陕西 B15 Glycine max
CCBAU73083 Phaseolus vulgaris 甘肃 Bradyrhizobium elkani
CCBAU73381 Phaseolus vulgaris 甘肃 USDA76T Glycine max 美国
CCBAU73353 Phaseolus vulgaris 甘肃 Mesorhizobium loti
CCBAU01367 Phaseolus vulgaris 内蒙古 NZP2213 Lotus corniculatus 新西兰
CCBAU01163 Phaseolus vulgaris 内蒙古 Mesorhizobium huakuii
CCBAU01012 Phaseolus vulgaris 内蒙古 CCBAU2609T Astragalus sinicus 中国
CCBAU65416 Phaseolus vulgaris 云南 A106 Astragalus sinicus 中国
CCBAU65408 Phaseolus vulgaris 云南 Mesorhizobium tianshanense
CCBAU65300 Phaseolus vulgaris 云南 AIBS Glycyrrhia apal lradiflora 新疆
CCBAU65275 Phaseolus vulgaris 云南 6 Glycyrrhia apal lradiflora 新疆
CCBAU65266 Phaseolus vulgaris 云南 Mesorhizobium ciceri
CCBAU65265 Phaseolus vulgaris 云南 USDA3378T Cicer aretimum 美国
CCBAU65257 Phaseolus vulgaris 云南 Rhizobium et li
CCBAU65250 Phaseolus vulgaris 云南 CFN42T Phaseolus vulgaris 墨西哥
CCBAU65214 Phaseolus vulgaris 云南 Rhizobium leguminosarum
CCBAU65150 Phaseolus vulgaris 云南 USDA2370 Pisum sativum 美国
CCBAU65122 Phaseolus vulgaris 云南 Rhizobium gallicum
CCBAU65121 Phaseolus vulgaris 云南 USDA2918 Phaseolus vulgaris 美国
CCBAU65104 Phaseolus vulgaris 云南 Rhizobium giardinii
CCBAU65075 Phaseolus vulgaris 云南 USDA2914 Phaseolus vulgaris 美国
CCBAU65027 Phaseolus vulgaris 云南 Rhizobium tropici
CCBAU65034 Cassia leschenaultiana 云南 CIAT899T Phaseolus vulgaris 哥伦比亚
CCBAU65035 Cassia leschenaultiana 云南 Sinorhizobium meliloti
CCBAU65036 Cassia leschenaultiana 云南 USDA1002T Medicago sativa 美国
CCBAU65037 Cassia leschenaultiana 云南 102F28 Medicago sativa 美国
CCBAU30142 Cassia nomane 云南 USDA205T Medicago sativa 美国
CCBAU23169 Cassia occidenlalisl 云南 Allrhizobium
CCBAU43109 Cassia tora 湖北 LMG11875T Neptunia natans 比利时
T:Type strains, CCBAU:Culture Collection of Beijing Agricultural University , NZP:Division of Scientific and Indust rial Re-
search , Palmerston , New Zeland , USDA:The United States Department of Agriculture , IAM:Institution of Applied Microbiology ,
The University of Tokyo , Tokyo , Japan , LMG:Collection of the Laboratorium voor Microbiologie en Microbiele Genetics , Rijksuni-
versiteit , B-9000 , Gent , Belgium , CIAT:CIAT Rhizobium Collect ion of Colombia
·6· 微生 物学 通报 2003年 30 (2)
1.2 数值分类
1.2.1 性状测定:对供试菌进行了 129 项表型性状的测定[ 8] 。
1.2.2 聚类:性状编码 、聚类方法等按文献 [ 8] 描述 ,用平均连锁法(UPGMA)聚类 。
1.3 全细胞蛋白 SDA-PAGE分析
快生 、 慢生根瘤菌分别用超声波[ 9 ,10] 和煮沸法[ 11]制备蛋白样品 , 除了分离胶的浓
度为 12.5%外 , 其他试剂的配制 、 制胶 、 电泳 、 结果统计分析和聚类均按文献 [ 9 ,
10] 操作 。
2 结果
2.1 数值分类结果
对供试菌株所测定的 129项表型性状数据 , 去除 12项全同性状 , 采用平均连锁法
进行聚类 , 获得了数值分类树状图 (图 1 , 图中不包括未聚群的供试菌)。
从图上可以看出 , 在 67%的相似性水平上 , 供试菌分为两大群:群 I和群 II。群 I
为快生和中慢生根瘤菌 , 群 II为慢生根瘤菌。
群 I 在85%的相似性水平上主要分为 3个亚群:亚群 1包括 25株供试菌 , 21株来
自杭子梢 , 4株来自菜豆 。21株分离自杭子梢的根瘤菌除 1株来自湖北外 , 其余皆来自
云南;4株分离自菜豆的根瘤菌中 , 2株来自陕西 , 1株来自青海 , 1株来自甘肃。亚群
2有 8 株菌 , 2 株来自菜豆 , 4 株来自决明 , 2 株为土壤杆菌参比菌株 IAM13129 (A-
grobacterium tumefaciens)和 IAM13569 (A.rubi)。其中的未知菌株皆来自云南 。亚群3有
9株菌 , 皆分离自菜豆。这一群菌 , 除 1株来自内蒙外 , 其余皆来自云南。亚群 1和亚
群3没有与已知参比菌株聚在一起 , 可能是新的表观群 。
群 II在 76%的相似性水平上主要分为 3个亚群。亚群 1包括 8个菌株 , 7株分离自
决明 , 1株分离自菜豆 , 来自四川 、 云南 、江西 、安徽和湖北 。亚群 2包括 13株菌 , 6
株分离自菜豆 , 3株分离自决明 , 1株分离自杭子梢 , 主要来自江西和湖北;其余 3 株
为参比菌株USDA6 (Bradyrhizobium japonicum)、 USDA76 (B.elkanii)和 B15 (B.japon-
icum);亚群3包括 6株菌 , 4株分离自决明 , 2株分离自菜豆 , 来自江西和安徽 。亚群1
和亚群3没有与已知菌聚在一起 , 可能是新的表观群。
2.2 全细胞蛋白 SDS-PAGE结果
将从每株菌的电泳图谱上得到的 85个数据用平均连锁法进行聚类 , 结果见树状图
(图 2和图 3)。
从图 2可以看出 , 供试的 76株快生菌和中慢生菌 (数值分类中的群 I)在 68%的相
似性水平上 , 主要可分为 4个亚群。亚群 1和亚群 2相当于数值分类的亚群 1 , 亚群 3
和亚群4分别与数值分类中的另外两个群相当 。亚群 3与数值分类中的亚群 2相比少了
已知种 A.tumefaciens IAM 13129和 A.rubi IAM 13569。亚群 4有一半的菌株与数值分类
中的亚群 3相同。数值分类中未曾聚群的菌株在这里也是彼此分开的 。这些结果和数
值分类的结果比较一致。
从图 3可以看出 , 供试的 27株慢生菌 (数值分类中的群 II)在 59 %的相似性水平
上 , 也可以分为 3个亚群 , 它们基本上分别与数值分类中的亚群 3 、 亚群 1和亚群 2相
对应 。
·7·2003年 30 (2) 微 生物 学通 报
图1 数值分类树状图
3 讨论
3.1 分离自杭子梢 、决明和菜豆的根瘤菌的初步分类地位
一般认为 , 数值分类中80%左右的相似性水平为种的分群水平 , 而全细胞蛋白电泳
中的分群水平没有具体标准 , 因而只作为辅助性的分群手段 , 与数值分类相互印证 。
·8· 微生 物学 通报 2003年 30 (2)
图 2 群 I蛋白电泳结果聚类树状图
图 3 群 II蛋白电泳结果聚类树状图
·9·2003年 30 (2) 微 生物 学通 报
无论是数值分类还是全细胞蛋白电泳的分群结果 , 都表明 25株来自杭子梢的根瘤
菌有 1株是慢生菌 , 其余 24株是快生菌 。在数值分类中 , 24株快生菌中有 21株聚在群
I中的亚群 1 , 3 株没有 聚群。在全细胞蛋白电泳中 , 来自杭子梢的根瘤菌聚在亚群 1
和亚群2 。这两种分群方法都表明快生根瘤菌有可能是新的分类单元 , 它们确切的分类
地位有待进一步用 DNA同源性试验考察确定。
在数值分类中 , 21株分离自决明的根瘤菌有 6 株是快生菌 , 其余 15 株为慢生菌 。
其中 13株慢生菌分别聚在群 II的亚群 1 、 2和 3中 , 有 2株没有聚群。亚群 2还包括已
知参比菌 USDA6 (B.japonicum)、 USDA76 (B.elkanii)和 B15 (B.japonicum)。聚在亚
群1和亚群 3的菌株可能是新的分类单元 , 这些结果有待进一步考察 。全细胞蛋白电泳
结果与数值分类结果基本吻合 。
40株分离自菜豆的根瘤菌 , 在数值分类中 , 30株为快生菌 , 其中有 14株分别聚在
亚群 1 、 2和 3中 , 其余 16株单独分散 , 没有聚群 。亚群 3不与任何已知参比菌聚群 ,
有可能是一个新群 , 它的确切分类地位有待 DNA同源分析来决定。10株分离自菜豆的
慢生根瘤菌 , 1株聚在群 II的亚群 1中 , 6株聚在亚群 2中 , 2株聚在亚群 3中 , 1株不
成群 。全细胞蛋白电泳的结果基本上也是这样。
3.2 分离自杭子梢 、决明和菜豆的根瘤菌的多样性
近十年来 , 随着对分离自菜豆的根瘤菌的多样性的了解 , 人们开始对它们产生了重
新分类的兴趣 。目前已从分离自菜豆的根瘤菌中 , 命名了 4个新种 , R .tropici [ 2]和 R.etli
[ 3]分离自非洲和中美洲 , R.gallicum 和R.giardinii[ 4]分离自欧洲 。有人认为 , 分离自菜豆
根瘤菌的多样性与基因横向转移和环境条件如 pH 、氮素的含量等因素有关[ 12 ,13] 。
本试验中 , 分离自菜豆的 40株菌 , 有快生和慢生之分;在数值分类中 , 4株快生菌
与分离自杭子梢的根瘤菌聚在群 I 的亚群 1 , 3株快生菌与分离自决明的根瘤菌聚在亚
群2 , 3株慢生型与分离自决明的根瘤菌聚在群 II的亚群 1和亚群 3。来自北方内蒙古自
治区的快生根瘤菌和来自南方云南的快生根瘤菌都聚到了群 I的亚群 3 , 来自云南的快
生根瘤菌聚到了不同的群中。这说明 , 我国分离自菜豆的根瘤菌也有着多样性 。分离自
杭子梢和决明的根瘤菌也有同样的情况 。
3.3 两种方法的相互印证
数值分类可以很好地将快生与慢生根瘤菌的菌株区分开来 , 并且可在种的水平上分
群 , 还可以得到各个群的鉴别特征 。虽然工作量大 , 但仍是一种可靠的分群方法。
全细胞蛋白电泳操作方法简单 , 如果严格控制操作条件 , 得到的结果与数值分类有
很好的一致性;加上可以用计算机应用软件处理蛋白指纹图谱 , 是一种快速 、 较可信的
分群方法。在本研究中 , 用这两种方法对根瘤菌进行表型分析 , 得到的群基本上是相对
应的 , 结果比较一致 。
参 考 文 献
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·10· 微生 物学 通报 2003年 30 (2)
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＊国家自然科学基金资助项目 (No.39770509)
Project Granted by Chinese National Science Fund (No.39770509)
国家 “ 863” 中试项目 (No.Z18-03-29)
收稿日期:2002-05-24 , 修回日期:2002-07-30
SZZ-Harpin融合蛋白在苏云金芽孢杆菌中的表达及活性测定＊
余榕捷1 洪 岸1 庞 义2 余健秀2 董 春3
(暨南大学生物工程研究所 广州 510632)1
(中山大学生物防治国家重点实验室 广州 510630)2 (华南农业大学农学院 广州 510632)3
摘要:PCR扩增编码SZZ短肽与植物过敏素 (harpin)融合蛋白的 1.5kb 基因片段 , 克隆到苏
云金杆菌 (Bacillus thuringiensis , Bt)表达载体 pHZB1 上 , 并置于晶体蛋白 cry1类基因的启
动子下游 , 从而构建表达质粒 pHSZH。将表达载体 pHSZH 电激转化晶体缺陷型的 BtK-CryB
菌株 , 获得工程菌 Bt-pHSZH。SDS-PAGE蛋白分析和生物测定结果显示 , 培养 48h 的 Bt-pH-
SZH 明显表达 SZZ-Harpin 融合蛋白 , 表达产物具有诱导烟草过敏反应和系统性获得抗性的功
能。
关键词:植物过敏素 , SZZ-Harpin 融合蛋白 , 苏云金杆菌 , 过敏反应 , 系统性获得抗性
中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:0253-2654 (2003)02-0011-05
EXPRESSION AND BIOLOGICAL ASSAY OF SZZ-HARPIN FUSION
PROTEIN IN BACILLUS THURINGIENSIS
YU Rong-Jie1 PANG Yi2 YU Jian-Xiu2 DONG Chun3 HONG An1
(Institute of biological engineering , Jinan University , Guangzhou 510632)1
(State key laboratory of biological control , Zhongshan University , Guangzhou 510630)2
(South China Agricultural University , Guangzhou 510632)3
Abstract:A 1.5 kb gene which encodes the SZZ-Harpin fusion proteinwas cloned into the expression vector pHZB1 of
Bacillus thuringiensis and located on the downstream of cry1 promoter.The recombinant expression plasmid pHSZH was
then transferred into BtK-CryB strainby electroporation , and an engineered Bt strain Bt-pHSZHwas obtained.SDS-PAGE
indicated that the SZZ-Harpin fusion protein was obviously expressed in Bt-pHSZH cultured for 48 hours.The results of
bioassay showed that the fusion proteinhad the ability of eliciting hypersensitive response(HR).And the strain Bt-pH-
SZH was able to trigger the systemic acquired resistance(SAR)in tobacco.
Key words:Harpin , SZZ-Harpin fusion protein , Hypersensitive response(HR), Systemic acquired resistance(SAR)
Harpin蛋白是梨火疫欧文氏菌 (Erwinia amylovora)产生的一种能引起植物过敏反应
(hypersensitive response , 简称 HR)和诱导植物系统性获得抗性 (systemic acquired resis-
tance , 简称 SAR )的诱导因子[ 1] 。Harpin蛋白是由 385个氨基酸组成的酸性蛋白 , 具热
·11·2003年 30 (2) 微 生物 学通 报