全 文 ：白花与紫花丁香 ISSR-PCR鉴别研究
思彬彬，赵海燕，刘海涛 (北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川 750021)
摘要 ［目的］探索用 ISSR分子标记方法在核酸分子水平上鉴别白花与紫花丁香。［方法］从 100条 ISSR引物中筛选合适的引物对白
花和紫花丁香 2个样品进行 PCR扩增及电泳分析，寻找特征位点。［结果］有 3条 ISSR引物扩增出较为明显的多态性特征条带，可单独
应用于白花和紫花丁香的鉴别。［结论］ISSR作为一种简便、可靠的分子标记方法，可用于不同花色丁香的鉴别。
关键词 丁香;ISSR;鉴别
中图分类号 S685． 26 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)32 －15579 －02
Identification of Syringa oblata by Inter-Simple Sequence Repeat Markers
SI Bin-bin et al (College of Biological Science and Engineering，Beifang University for Nationalities，Yinchuan，Ningxia 750021)
Abstract ［Objective］To identify Syringa oblata by inter-simple sequence repeat markers．［Method］Primers suitable for routine analysis were
screened from 100 inter-simple sequence repeat primers，then，they were used in PCR and separated of 2 samples of Syringa oblata．［Results］
Three of the one-hundred primers amplified polymorphic bands and suitable for the identification of Syringa oblata．［Conclusion］Inter-simple se-
quence repeat markers provide a quick，reliable molecular marker for identification of Syringa oblata．
Key words Syringa oblata;ISSR;Identification
基金项目 北方民族大学资助项目(2010Y045)。
作者简介 思彬彬(1977 － ) ，女，宁夏银川人，讲师，硕士，从事植物病
理学研究，E-mail:sibinbin115@ 163． com。
收稿日期 2012-08-27
木犀科丁香属丁香(Syringa oblata)是一种主要被用作
观赏的落叶灌木或小乔木植物［1］，其具有温中降逆、散寒止
痛、温贤助阳等功能，同时还可清热解毒、立湿退黄，用于急
性痢疾、黄疸型肝炎、火眼等疾病的治疗［1］。
ISSR(Inter-simple sequence repeat)分子标记是 Zietk-
iewicz等［2］于 1994年创建的，具有多态性高、稳定性好、产物
特异性强等特点［3］，目前已被广泛应用于植物的品种鉴定、
遗传作图、基因定位、分类与进化等诸多领域［4 －7］。
笔者探索利用 ISSR方法选择合适的引物对不同花色丁
香进行分析和鉴定，试图在 DNA 分子水平上对其差异性进
行研究。
1 材料与方法
1． 1 材料 供试材料为丁香叶片，采自北方民族大学。IS-
SR引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供的序列，由上
海生物工程公司合成。PCR 反应相关试剂购自北京全式金
生物工程有限公司，PCR 反应在 GeneAmp PCR system 9700
PCR仪上进行。
1． 2 方法
1． 2． 1 基因组 DNA的提取。以丁香叶片为材料，采用改良
的 CTAB法提取其基因组 DNA。用 1． 0%琼脂糖电泳和核酸
检测仪检测提取的 DNA质量浓度，并稀释至 10 ng /μl，－ 20
℃保存。
1． 2． 2 ISSR-PCR反应体系和程序。根据前期试验所得，扩
增反应为 25 μl体系，包括 dNTP mix(2 mmol /L)2． 0 μl，10 ×
buffer(Mg2 +)2． 5 μl，引物(10 pmol /L)1． 0 μl，模板 DNA 2
μl，Taq DNA polymerase(5 U /μl )0． 5 μl，最后用 ddH2O补足
至 25 μl。PCR扩增程序为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 45
s，退火 90 s，72 ℃延伸 90 s，41个循环;72 ℃延伸 7 min，4 ℃
保存。PCR产物采用 1． 0%琼脂糖凝胶(含 0． 05%溴化乙
锭)检测，电极缓冲液为 1 × TAE，检测电压为 5 V /cm，电泳
结束后在凝胶成像分析仪上观测分析并照相。
注:M． 5 000 bp DNA Marker;编号 1 ～ 16 分别为 B812、Z812、
B813、Z813、B821、Z821、B825、Z825、B828、Z828、B834、Z834、
B843、Z843、B852、Z852，其中奇数编号为白花丁香，偶数编
号为紫花丁香。
图 1 初级引物筛选 PCR电泳图谱(A)
注;M． 5 000 bp DNA Marker;编号 1 ～ 12 分别为 B824、Z824、
B826、Z826、B827、Z827、B829、Z829、B830、Z830、B835、Z835，
其中奇数编号为白花丁香，偶数编号为紫花丁香。
图 2 初级引物筛选 PCR电泳图谱(B)
2 结果与分析
试验中初次筛选的引物为 100 个。利用上述反应体系
和反应程序，采用丁香 DNA模板同色混合的方法，组合成应
用于引物筛选的模板 DNA，即白花丁香和紫花丁香。用不同
引物对模板进行扩增，从100个 ISSR引物中共筛选出了3个
谱带清晰、差异明显、结果稳定且重复性好的引物(图1和
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(32):15579 － 15580 责任编辑 朱琼琼 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.32.148
注:M． 5 000 bp DNA Marker;1 ～6编号中奇数为白花丁香，偶数
为紫花丁香。
图 3 引物 825验证图谱
注:M． 5 000 bp DNA Marker;1 ～6编号中奇数为白花丁香，偶数
为紫花丁香。
图 4 引物 826验证图
2) ，即引物 825、826、835。用这 3 个引物分别对白花丁香和
紫花丁香进行扩增，均扩增出了特异条带(图 3、4、5) ，由图
可知，以上 3个特异引物扩增谱带清晰、差异明显，均能很好
的鉴别白花丁香和紫花丁香。
3 讨论
ISSR分子标记技术因其操作简单、重现性好等优点而
广泛应用于同一品种不同花色植物遗传关系和遗传多样性
等方面的研究。笔者在该研究中尝试利用 ISSR方法对同一
植物不同花色进行分子标记鉴别分析。试验选用了 100条
ISSR引物进行分析鉴别，最终筛选到 3条引物可用于不同花
色品种的鉴定，其余引物扩增的条带均不同程度出现均一
化、多态性不够明显等现象。虽然目前分子标记技术主要限
于基础领域的研究，与植物花色实践结合较少，但在不久的
将来，ISSR分子标记技术对观赏花卉的种质资源鉴定、辅助
育种、优良性状基因筛选等方面将会产生深远影响。
注:M． 5 000 bp DNA Marker;1 ～6编号中奇数为白花丁香，偶数
为紫花丁香。
图 5 引物 835验证图
参考文献
［1］鹿萍，薛培凤．丁香及其丁香属植物的研究进展［J］．赤峰学院学报，
2010(8):19 －20．
［2］ ZIETKEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D． Genome fingerprinting by
simple sequence repeats (SSR)－ anchored polymerase chain reaction am-
plification［J］． Genomics，1994，20:176 －183．
［3］钱书，葛颂，洪德元．采用RAPD和 ISSR标记探讨中国疣粒野生稻的遗
传多样性［J］．植物学报，2000，42(7):741 －750．
［4］周延清，景建洲，李振勇，等．怀区地黄遗传多样性的 ISSR鉴定［J］．中
草药，2005，36(2):257 －261．
［5］罗玥佶，伍贤进，彭帅，等． 12种翻白草种质资源遗传多样性的 ISSR分
析［J］．中草药，2008，39(5):748 －751．
［6］王翀，周天华，杨雪，等． ISSR-PCR鉴别绞股蓝属7种植物［J］．中草药，
2008，39(4):588 －591．
［7］邹喻平，葛颂，王晓东．系统与进化植物学中的分子标记［M］．北京:科
学出版社，2001:40．
［8］WANG C W，SUN X Q，YANG B Y． Establishment and optimization of IS-
SR －PCR reaction system for Cymbidium ensifolium(Linn．)Sw［J］． Agri-
cultural Science ＆ Technology，2010，11(3):
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
37 －40．
(上接第 15574页)
等进行了预测和分析，发现梨 PAL的氨基酸序列无跨膜结构
域和质体转运肽，定位于细胞质基质。有研究发现，细胞间
质部分 PAL活性最高。这也间接地验证了文中定位预测的
可能性。该研究明确了 PAL蛋白的二级结构以随机卷曲和
α －螺旋为主，三维建模成功。这些重要生物学参数的获得
为进一步研究 PAL的酶学性质和梨的木质化机制奠定了理
论基础。
参考文献
［1］王乃栋，张丽霞，向勤珵，等．茶树多酚氧化酶基因的生物信息学分析
及原核表达［J］．茶树科学，2011，31(1):33 －39．
［2］康晓慧，雷桅，张梅．水稻苯丙氨酸解氨酶的生物信息学分析［J］．湖南
师范大学自然科学学报，2010，33(4):89 －94．
［3］谭洪花，曹尚银，房经贵．枣果实中苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列
分析［J］．经济林研究，2011，29(1):15 －20．
［4］石海燕，张玉星．木质素合成中关键酶基因的分子特征［J］．中国农学
通报，2011，27(5):288 －291．
［5］程水源，杜何为，许锋，等．银杏苯丙氨酸解氨酶基因的克隆和序列分
析［J］．林业科学研究，2005，18(5):573 －577．
［6］张成岗，贺福初．生物信息学方法与实践［M］．北京:科学出版社，2002．
［7］张夏南，杨绍兰，王成荣，等．“黄金梨”果实木质素合成途径相关酶基
因的克隆及其在果实发育中的表达分析［J］．园艺学报，2011，38(S1):
2469．
［8］CHEN Y P，CHEN Y F，CHEN Q Z，et al． Cloning，Characterization and
Expression of a Phenylalanine Ammonialyase Gene(M －PAL)from Plan-
tain［J］． Journal of Tropical and Subtropical Botany，2007，15(5):421 －
427．
［9］BENKERT P，BIASINI M，SCHWEDE T． Toward the estimation of the ab-
solute quality of individual protein structure models［J］． Bioinformatics，
2011，27(3):343 －350．
［10］付鑫，李祥龙，周荣艳，等． 14个物种 RPSA基因编码区生物信息学分
析［J］．湖北农业科学，2012，51(2):389 －392．
［11］王凤德，李利斌，李化银，等．大白菜 GIF蛋白家族的生物信息学分析
［J］．山东农业科学，2012，44(1):1 －5．
08551 安徽农业科学 2012 年