全 文 ：北方药学 2016年第 13卷第 4期
大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌体外抑制作用及对质粒的
消除作用△
黄轶凡1 张国华 2 林亮君 1 丘 敏 1（1.中山市西区医院 中山 528401；2.中山市小榄人民医院 中山 528415）
摘要：目的：探讨大叶桉精油对ESBLs肺炎克雷伯菌体外抑制作用及对质粒的消除作用。方法：采用牛津杯法和逐个检出法分别检
测大叶桉精油对 ESBLs肺炎克雷伯菌的抑制作用和对质粒的消除作用。结果：大叶桉精油对 ESBLs肺炎克雷伯菌的抑制作用显
著，MIC值为 5ml/L，对 ESBLs肺炎克雷伯菌作用 24h和 48h质粒的消除率分别为 35.4%和 55.2%。结论：大叶桉精油对 ESBLs肺
炎克雷伯菌有显著抑制作用和质粒消除作用。
关键词：大叶桉 质粒消除 ESBLs肺炎克雷伯菌
中图分类号：R563.1 文献标识码：B 文章编号：1672-8351（2016）04-0109-02
Inhibition and plasmid elimination effect of volatile oil of Eucalyptus robusta on ESBLs klebsiella pneumoniae
Hunag Yifan1 Zhang Guohua2 Lin Liangjun1 Qiu Min1（1.Western Hospital of Zhongshan City，Zhongshan Guangdong Province 528401，
China；2.Xiaolan People’s Hospital of Zhongshan City，Zhongshan Guangdong Province 528415，China）
Abstract：Objective：To study the inhibition and plasmid elimination of volatile oil of Eucalyptus robusta on ESBLs klebsiella
pneumoniae（KPN）. Methods：The inhibition and plasmid elimination of volatile oil in ESBLs KPN were determined by Oxford cup and
one-by-one detection methods, respectively. Results：The growth of ESBLs KPN was obviously inhibited by volatile oil, with the MIC of
5 mL/L. The plasmid elimination rates were 35.4% at 24 h and 55.2% at 48 h.Conclusion：The volatile oil of Eucalyptus robusta
possesses the significant inhibition and plasmid elimination on ESBLs KPN.
Key words:Eucalyptus robusta Plasmid elimination ESBLs klebsiella pneumonia
近年来，随着抗生素大量应用，细菌的耐药问题逐渐变成全
球性的问题。超广谱 β-内酰胺类抗生素的不合理应用，导致细
菌产生了由质粒介导的超广谱 β-内酰胺酶（ESBLs），从而对 β-
内酰胺类抗生素耐药，其所含耐药基因可由质粒、整合子或转
座子介导在不同菌种之间进行重排或转移，导致多重耐药[1]。据
报道，我国不同地区 14所医院临床分离菌中，克雷伯菌属产
ESBLs的百分率平均为 41.4%[2]，北京某医院的细菌监测报告显
示，其院内产肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae）产 ESBLs率
达 56.1%[3]，受 ESBLs肺炎克雷伯菌引发的肺部感染已成为临床
治疗的一个难题。目前研究认为，ESBLs酶的产生耐药与耐药质
粒的介导密切相关。因此，质粒消除或抑制是当前解决 ESBLs
耐药菌耐药性的研究热点。前期研究表明大叶桉精油具有良好
的广谱抑菌作用[4，5]，本文进一步从大叶桉精油对 ESBLs肺炎克
雷伯菌质粒的消除作用进行探讨，以期寻找可靠有效的 ESBLs
肺炎克雷伯菌质粒消除剂提供依据。
1 实验材料
1.1供试菌株：ESBLs肺炎克雷伯菌，为中山市中医院检验科微
生物室临床分离菌株；质控肺炎克雷伯菌标准菌株
（ATCC4352），购于南京便诊生物科技有限公司；实验操作在中
山市中医院检验科微生物室完成。
1.2 药物：大叶桉由广州至信药业有限公司提供，经鉴定为桃金
娘科 Eucalyptus robusta Smith的干燥叶。
1.3 试剂与仪器：MH琼脂培养基（江门市凯林贸易有限公司）；
无菌空白药敏试纸（OXOID）；吐温-80（广州化学试剂厂）；
XSW-CJ-2A标准型净化工作台（吴江市津化设备总厂）；LRH-
250A生化培养箱（广东省医疗器械厂）；DL-ZD1浊度仪（珠海
迪尔生物工程有限公司）；LMQR-4060型立式灭菌器（山东新华
医疗器械股份有限公司）；针筒式滤膜过滤器（Millipore）。
2 实验方法
2.1 MRSA菌悬液的制备：ESBLs肺炎克雷伯菌经平板分离培养
24h后，用无菌接种环挑取数个菌落置于生理盐水稀释液中，用
浊度仪校正浓度至 0.5麦氏标准液。
2.2大叶桉精油制备：大叶桉剪碎后用水蒸气蒸馏法固液比 1:6
提取挥发油，无水硫酸钠干燥备用。
2.3大叶桉精油抑菌活性实验[6]：大叶桉精油用 1%的吐温 80无
菌水溶液（针筒式滤膜过滤器过滤除菌）稀释成 150.00、100.00、
60.00、40.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.20mL/L 的大叶桉精油稀
释液，用微量移液器吸取 30μL各浓度大叶桉精油均匀涂布于
无菌空白药敏纸片，两面各 15μL。纸片吸透药液后贴于接种了
ESBLs肺炎克雷伯菌 MH平板上，做好标记，置于 37℃恒温培养
箱中培养 24h。以平板中贴浸 30μL有 1%吐温-80无菌水液（针
筒式滤膜过滤器过滤除菌）的纸片为空白对照。用游标卡尺测量
各组抑菌圈直径，每组实验重复 3次，结果取平均值。
判断标准：不敏感（≤6.25mm，—），低度敏感（≤7mm，+），
中度敏感（>7mm，++），高度敏感（≥15mm，+++）。
抑菌率计算公式：抑菌率（%）=[（药液抑菌圈平均直径—空
白纸片直径）/空白纸片直径]×100%。
2.4大叶桉精油对 ESBLs肺炎克雷伯菌最低抑菌浓度（MIC）的
测定 [7] ：用 1%的吐温 80 水溶液稀成 150.00、100.00、60.00、
40.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.20mL/L 大叶桉挥发油稀释液。
用医用无菌棉签蘸取 0.1%的 ESBLs肺炎克雷伯菌悬液接种于
MH（Mueller-Hinton Agar）琼脂平板中，用无菌棉签涂匀后，移取
0.2mL 各浓度挥发油稀释液加于接种了 MRSA 菌的 MH 平板
中，用无菌棉签均匀涂布，倒置于恒温培养箱中培养 24h。观察
ESBLs肺炎克雷伯菌生长情况，有菌落生长为阳性（+），未见菌
落生长为阴性（-），以不生长 ESBLs肺炎克雷伯菌菌落的精油
最低浓度为大叶桉精油的 MIC值。实验以 1%的吐温 80无菌水
溶液作对照，重复 3次，记录结果。
2.5庆大霉素和红霉素对 ESBLs肺炎克雷伯菌的 MIC测定：将
庆大霉素（Gm）和红霉素（Em）用倍比稀释法分别配制成 128、
256、512和 1024μg/mL，MIC测定方法同“2.4”[7]。
2.6大叶桉精油对 ESBLs肺炎克雷伯菌的质粒消除作用
2.6.1抗生素选择培养基的制备：将 1/2 MIC浓度的庆大霉素和
红霉素分别加入 LB培养基，配制成质粒消除的选择性培养基，
现用现配。
2.6.2质粒消除实验：用无菌棉签蘸取 0.1%的 ESBLs肺炎克雷
伯菌悬液接种于 MH平板中，用无菌棉签涂匀后，移取 0.2mL小
于 MIC值浓度的大叶桉精油稀释液加于接种了 ESBLs肺炎克
·实验研究·
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北方药学 2016年第 13卷第 4期
雷伯菌的 MH平板中，用无菌棉签均匀涂布，倒置于 37℃恒温
培养箱中培养 24h。选取菌落数在 200～300个的平板，采用逐个
检出法分别接种在配制好的选择培养基上和普通培养基平板
上。37℃下培养 24h和 48h，观察平板上的菌落数量并记录结
果。以不加药液的培养基作空白对照，以 SDS（十二烷基硫酸钠）
作为阳性对照组，每组重复 3次，取其平均值[7]。
2.6.3质粒消除的结果判定：在不含抗生素的平板上生长而在含
抗生素的选择平板上不生长，即为质粒消除子（需在选择培养基
平板上进行复试确认）[7]。
质粒消除率（%）=A/B×100%
A：在不含抗生素的普通培养基平板上生长而在含抗生素
的选择性培养基平板上不生长的菌落数；B：在不含抗生素的普
通培养基平板上生长的菌落数。
2.7 统计学方法：采用 SPSS19.0软件进行 X2检验，以 P<0.05为
差异有统计学意义。
3 实验结果与分析
3.1大叶桉精油对 ESBLs肺炎克雷伯菌抑菌活性影响：大叶桉
精油稀释浓度≥40mL/L对 ESBLs肺炎克雷伯菌呈高度敏感性，
抑菌圈在 15mm以上，抑菌率均大于 140%；大叶桉精油稀释浓
度 5～20mL/L对 ESBLs肺炎克雷伯菌呈中度敏感性，抑菌圈在
8.33～10.93mm，抑菌率在 33.28%～74.88%；大叶桉精油稀释浓度
低于 5mL/L对 ESBLs肺炎克雷伯菌呈低度敏感性，抑菌圈小于
8.33mm，抑菌率小于 33.28%，详见表 1。
表 1 大叶桉精油对 ESBLs肺炎克雷伯菌抑菌活性影响结果
注：“-”：抑菌圈≤6.25mm；“+”：抑菌圈≤7mm；“++”：抑菌
圈>7mm；“+++”：抑菌圈≥15mm。
3.2大叶桉精油对 ESBLs肺炎克雷伯菌最低抑菌浓度（MIC）的
测定：大叶桉精油浓度≥5ml/L培养皿均未见 ESBLs肺炎克雷
伯菌生长，故大叶桉精油对 ESBLs 肺炎克雷伯菌的 MIC 为
5mL/L，详见表 2。
表 2 大叶桉精油对 ESBLs肺炎克雷伯菌 MIC测定结果
注：“-”：无菌落生长；“+”：有菌落生长。
3.3两种抗生素对 ESBLs肺炎克雷伯菌最低抑菌浓度（MIC）的
测定结果：庆大霉素和红霉素在 1024mg/mL浓度以上的培养皿
均未见 ESBLs肺炎克雷伯菌生长，故庆大霉素和红霉素对 ES－
BLs肺炎克雷伯菌的 MIC值均大于 1024mg/mL，该剂量下可用
于质粒消除实验，详见表 3。
表 3 两种抗生素对 ESBLs肺炎克雷伯菌 MIC的测定结果
注：“-”：无菌落生长；“+”：有菌落生长。
3.4大叶桉精油对 ESBLs肺炎克雷伯菌的质粒消除的结果：大
叶桉精油作用于 ESBLs肺炎克雷伯菌 24h和 48h质粒的消除
率分别为 35.4%和 55.2%，表现出较好的质粒消除作用，其消除
效果跟时间呈相关性，作用时间延长对质粒消除效果越好，差异
有统计学意义（P<0.05），详见表 4。
表 4 大叶桉精油作用 24h对 ESBLs肺炎克雷伯菌质粒的消除率
4 讨 论
现代研究表明，高温培养、溴化乙啶、紫外照射及 SDS（十二
烷基硫酸钠）均具有良好的 R质粒消除作用，但这些方法要么
毒副作用强，要么操作性差，较难在临床应用[8]。中草药中清热
解毒的药物大部分具有较好的抗菌作用，而从中发掘天然无毒
高效的质粒消除剂是当前的热点。已有研究发现黄连、紫花地
丁、艾叶等对大肠埃希菌质粒具有消除作用 [9]，黄柏和甘草对
MRSA菌质粒也有消除作用，作用 48h质粒消除率近 30%[7]。组
方清肺汤对耐药质粒的消除率为 45%，与西药联用对肺炎克雷
伯菌 R质粒的消除率为 37.5%，有助于恢复和增强耐药菌株对
抗生素的敏感性[10]。大叶桉是南方经济树种，植株高大，从中提
取出来的大叶桉精油含量高，具有很好的研究开发价值。研究
发现，大叶桉精油在抗炎、抗菌、抗氧化等方面均有较好的药理
作用[11]。本文采用牛津杯法和逐个检出法分别检测大叶桉精油
对 ESBLs肺炎克雷伯菌的抑制作用和对质粒的消除作用，结果
显示大叶桉精油对 ESBLs肺炎克雷伯菌具有较好的抑制作用，
其 MIC为 5mL/L，作用 24h和 48h对 ESBLs肺炎克雷伯菌质粒
的消除率分别为 35.4%和 55.2%，并随时间延长质粒消除作用
增强，是较理想的质粒消除剂，具有研究开发价值。
参考文献
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△基金项目：中山市卫生局医学科研立项（2015A020418）
大叶桉精油/浓度（mL/L）
ESBLs肺炎克雷伯菌
150 100 60 40 20 10 5 2.5 1.2 空白对照
- - - - - - - + + -
大叶桉精油/ 浓度（ml/L）
150 100 60 40 20 10 5 2.5 1.2 空白对照
抑菌圈/mm 23.52 19.45 17.64 15.12 10.93 9.52 8.33 6.82 6.25 6.25
敏感度 +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ + - -
抑菌率/% 276.32 211.2 182.24 141.92 74.88 52.32 33.28 9.12 0 -
大叶桉精油浓度/（mg·mL-1） 庆大霉素（Gm） 红霉素（Em）
空白对照
256
512
1024
2048
+++
+++
++
-
-
+++
+++
++
-
-
组别
挑选
菌落/
个
质粒消除[菌落数（消除率/%）]
24h 48h
Gm Em 合计 Gm Em 合计
大叶桉精油 500 83（16.6） 94（18.8） 177（35.4） 119（23.8） 157（31.4） 276（55.2）
SDS 500 235（47.0） 104（20.8） 339（67.8） 268（53.6） 163（32.6） 431（86.2）
空白对照 500 0 0 0 0 0 0
110