全 文 ：用 SSR研究栲树群体遗传结构
徐立安＊　李新军＊　潘惠新　邹惠渝　尹佟明　黄敏仁＊＊
(南京林业大学林木遗传和基因工程国家林业局重点实验室 , 南京 210037)
摘要:　利用微卫星(SSR)分子标记对福建省内 4 个栲树(Castanopsis fargesii Franch.)群体遗传结构进行了研究。
SSR标记揭示了栲树群体丰富的遗传变异:平均等位基因数 A=9.0 ,平均有效等位基因数 Ne=4.8 , 平均期望杂合
度 He=0.65 , 而群体具有较低的 Fst值(Fst=0.031)。SSR每个位点的等位基因频率分布在栲树群体间都存在显著
或极显著差异 ,表明根据 SSR等位基因频率分布亦能了解群体的分化。 SSR标记使栲树群体中一些稀有等位基因
得以表现 , 54个 SSR等位基因中有 15 个等位基因仅出现在 1个或 2个群体中 , 且频率较低 ,在遗传多样性保护中更
应注重保护这些稀有的等位变异。
关键词:　微卫星;栲树;群体遗传结构;等位基因频率
中图分类号:Q941.2　　　文献标识码:A　　　文章编号:0577-7496(2001)04-0409-04
Study on Population Genetic Structure in Castanopsis fargesii
with Microsatellite Markers
XU Li_An＊ , LI Xin_Jun＊ , PAN Hui_Xin , ZOU Hui_Yu , YIN Tong_Ming , HUANG Min_Ren＊＊
(Key Laboratory of Forest Tree Genetic Engineering , Nanjing Forestry University , Nanjing 210037 , China)
Abstract:　Genetic structure of four populations in Castanopsis fargesii Franch.in Fujian Province was stud-
ied with microsatellite(SSR)markers.A high level of genetic variation was detected in the populations of C.
fargesii by using SSR with A=9.0 , Ne=4.8 , He=0.65 and the population differentiation coefficient(Fst)
was only 0.031.The distributions of alleles of all loci were significantly different among the populations of C.
fargesii , and the population differentiation could be found according to the distributions of SSR alleles.Some
rare alleles in the populations of C.fargesii were revealed by SSR:Fifteen of 54 alleles appeared in one or
two populations with lower frequencies;conservation of these rare alleles is of great importance.
Key words:　microsatellite;Castanopsis fargesii;population genetic structure;allele frequency
　　遗传多样性的研究是遗传资源保存的前提条
件 ,有效的保存策略应该结合各层次的遗传变异研
究[ 1 , 2] 。遗传变异的研究经历了从形态学 、细胞学 、
生理生化逐步发展到分子水平 。微卫星又称简单重
复序列(SSR),是近年来发展起来的分子标记 ,被广
泛应用于遗传图谱构建 、QTL 定位 、亲本鉴定 、群体
遗传结构分析等[ 3-5] 。由于 SSR标记为共显性标
记 ,且具有丰富的多态性 、PCR扩增结果重现性高等
特点 ,集中了其他分子标记的优点 ,被认为是研究群
体遗传变异最好的标记方法[ 6 , 7] 。然而 ,我国利用
SSR标记研究群体遗传变异还很少 ,在林木中尚未
见报道。
壳斗科栲属(Castanopsis)树种是我国南 、中亚热
带常绿阔叶林的主要组成树种 ,而栲树(C.fargesii)
是栲属的重要树种之一 。长期以来 ,由于毁林垦荒 、
造林树种单一等因素 ,使我国的阔叶林 、特别是亚热
带常绿阔叶林树种资源及其遗传资源遭到严重破
坏 。在我国以栲树为优势种 、构成一定规模的群体
已很少见。本研究以福建省内保存较好的 4个栲树
群体为研究对象 ,应用 SSR标记对栲树群体的遗传
结构进行研究 ,为栲树遗传资源的保存提供依据 。
1　材料和方法
1.1　供试材料
在福建省内选择了建殴万木林自然保护区(群
体1 , 北纬 27°03′, 东经 118°17′)、福建省洋口林场
(群体 2 ,北纬 26°52′,东经 117°53′)、沙县罗卜岩自
然保护区(群体3 ,北纬 26°26′,东经 117°44′)和邵武
收稿日期:2000-06-19　接受日期:2000-07-31
基金项目:国家自然科学基金农业倾斜项目(39770628)。 Supported by the National Natural Science Foundation of China(39770628).
＊并列第一作者。 First coauthor.
＊＊通讯作者。Author for correspondence.
植　物　学　报　2001 , 43(4):409-412 　 　 　 　 　 　 　
Acta Botanica Sinica
红灯林场(群体 4 ,北纬 27°21′,东经 117°29′)4个栲
树(Castanopsis fargesii Franch.)群体 。除群体 4为人
工促进更新的纯林外 ,其余 3个群体均为与其他常
绿阔叶树种组成的混交林 。1997年 10月在每群体
至少采集 30株栲树的种子 ,各采种母树间相隔50m
以上。种子经沙藏处理 ,翌年春播种 。成苗后每个
半同胞家系取一个体(生长处于平均水平),采 1 ～ 2
个叶片用于提取 DNA 。由于各群体种子成苗率存
在差异 ,最终 4群体能用于作 SSR分析的个体数分
别为 20 、22 、31和 23个。
1.2　总 DNA提取
DNA提取参考 Doyle和 Doyle[ 8]的 CTAB 法。提
取液中加入1%巯基乙醇和 1%PVP。
1.3　SSR扩增
以4个栲树个体对 18对来源于栎属中已成熟
应用的 SSR引物[ 9]进行了扩增筛选(重复 2次),共
有11对引物扩增出了谱带。从中选出 6对扩增条
带清晰且具明显多态的 SSR 引物用于本研究(表
1)。
扩增反应都在 PE9700 PCR扩增仪上进行 。反
应体系参见 Barreneche 等[ 3] ,加入 dATP [ α_33P dATP
1μCi]约0.1μL ,总体积 15μL ,各引物的退火温度见
表 1。电泳分析在 BIO_RAD凝胶测序仪(Sequi_Gen
GT 38 cm×50 cm)上进行 。
1.4　数据分析
将以等位基因平均数(A)、有效等位基因数
(Ne)、平均观察杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)、
固定指数(F)、F 统计量(Fst)等参数 ,以及等位基因
频率及其分布等 ,对群体遗传结构进行分析;数据分
析主要借助软件包POPGENE(http//www.ualberta.
表 1　SSR引物序列及退火温度
Table 1　The primer sequence and annealing temperature of SSR
Locus Primer name Primer sequence
Annealing
temperature(℃)
1 SsrQpZAG1/5 F:GCTTGAGAGTTGAGATTTGT 55
B:GCAACACCCTTTAACTACCA
2 SsrQpZAG9 F:GCAATTACAGGCTAGGCTGG 50
B:GTCTGGACCTAGCCCTCATG
3 SsrQpZAG16 F:CTTCACTGGCTTTTCCTCCT 59
B:TGAAGCCCTTGTCAACATGC
4 SsrQpZAG46 F:CCCCTATTGAAGTCCTAG 48
B:TCTCCCATGTAAGTAGCT
5 SsrQpZAG110 F:GGAGGCTTCCTTCAACCTACT 50
B:GATCTCTTGTGTGCTGTATTT
6 SsrQpZAG119 F:GATCAGTGATAGTGCCTCTC 48
B:GATCAACAAGCCCAAGGCAC
ca/ ～ fyeh/ index.htm)。
2　实验结果
6对引物在栲树群体中都扩增出了较清晰的谱
带 ,并且具有很好的重复性 ,图 1为其中两对引物扩
增出的部分谱带。从图 1中可看出 SSR标记在栲树
群体中表现出很高的多态性 。
2.1　基因多样性
采用的 6个SSR标记都表现为多态。从表 2中
可见 ,SSR引物能扩增出 3 至 16个等位基因 ,平均
每个引物扩增出 9个 ,平均有效基因 4.82个 。对 4
个群体各位点的基因型频率的平衡分析表明 ,除了
群体3第 3个位点基因型频率存在显著不平衡外 , 4
群体的其他位点都处于平衡状态 。4群体的 Ho 和
He分别为 0.688和 0.654。4个栲树群体中 , A 、N e 、
Ho 和He 4种参数值在群体间有一定差异 ,不过未达
显著水平 。6个位点中除了位点4固定指数为正值
图 1.　引物SsrQpZAG16和 SsrQpZAG110 在栲树群体中扩增出的多态图谱。
Fig.1.　SSR polymorphism in the population of Castanopsis fargesii with SsrQpZAG16(A)and SsrQpZAG110(B).
410　 植　物　学　报　　Acta Botanica Sinica 43 卷
外 ,其他都为负值 ,平均-0.068 ,表明栲树天然群体
中杂合体略高于期望值 ,但未达到统计显著水平。
表 2　栲树的遗传多样性与群体分化
Table 2　Genetic diversity and degree of differentiation among the
four populations of Castanopsis fargesii
A Ne Ho He F Fst
Locus
1 5 2.16 0.719 0.539 -0.3410 0.022
2 12 5.73 0.844 0.830 -0.0222 0.037
3 16 8.14 0.917 0.882 -0.0450 0.025
4 6 2.57 0.542 0.615 0.1140 0.043
5 12 9.11 0.927 0.895 -0.0414 0.029
6 3 2.20 0.177 0.166 -0.0733 0.033
Average 9 4.82 0.688 0.654 -0.0681 0.031
Population
1 7.7 4.43 0.658 0.646
2 6.7 3.56 0.682 0.608
3 8.0 4.50 0.667 0.640
4 7.2 4.30 0.746 0.685
图 2.　SSR等位基因频率在 4个栲树群体中的分布。
Fig.2.　Distribution of SSR allele frequency in the four populations(P1 , P2 , P3 , P4)of Castanopsis fargesii.
a.SsrQpZAG16.b.SsrQpZAG9.c.SsrQpZAG110.
2.2　群体分化
群体间的遗传分化常采用Wright的 Fst统计量
来度量 。各位点的 Fst统计量变化不大(0.025 ～
0.043),平均 0.031(表 2),即群体间变异占总变异
的 3.13%,大多数变异(96.87%)存在于群体内 。
由于 SSR位点常有多个等位基因 ,我们对各位
点的等位基因在 4个群体中的分布情况进行了分
析 ,发现有 22个等位基因(占总数 40.7%)不是 4个
群体所共有。其中 7个等位基因只出现在其中的 3
个群体(如图 2a中的第 4个等位基因),12个等位基
因只出现在 2个群体(如图 2a 中的第 15个等位基
因),而有3个等位基因仅仅在 1个群体中出现(如
图 2c中的第11个等位基因)。只是这些等位基因在
群体中出现的频率较低(大多在 1个群体中仅出现
1 ～ 2次)。各位点的不同等位基因频率的分布在 4
个群体间亦存在差异(图 2)。如图 2 所示 ,许多等
位基因的频率在 4个群体间差异较大 ,如图 2a 中的
第 7 、8个等位基因 , 图 2b中的第7 、11个等位基因 ,
图 2c中的第 6 、7个等位基因 ,共有 10个等位基因
(占 18.5%)的频率在 4 群体间差异达显著水平(P
<0.05)。经卡方检验 ,所有位点的等位基因频率分
布在群体间都存在显著(P <0.05)或极显著(P <
0.01)差异(表 3)。
表 3　SSR等位基因频率在栲树不同群体的分布检验
Table 3　Test of distributions of SSR allele frequency among popu-
lations of Castanopsis fargesii
Locus Chi_square df Probability
1 33.48 12 0.025＊
2 61.83 33 0.002＊＊
3 69.23 45 0.012＊
4 32.40 15 0.006＊＊
5 50.06 33 0.029＊
6 14.43 6 0.025＊
＊ P<0.05;＊＊ P<0.01.
3　讨论
3.1　栲树 SSR多态性
SSR标记能揭示栲树群体丰富的遗传多态性。
在栲树 4个群体中 ,每个 SSR位点 A=9 ,最多达 16
个等位基因;Ho =0.69 , He=0.65。国外以 SSR研
究林木群体遗传变异也获得了相似的结果。
Steinkellner等[ 9]在栎属研究中获得的 2个参数为 A
=9 , Ho =0.84;Pfeiffer 等[ 10]在挪威云杉中为 A =
13 ,He=0.79;Dayanandan等[ 11]在山杨中为 A=7.3 ,
Ho=0.46;Brondani等[ 4]在桉属中为 A =16.3 , He=
4 期 徐立安等:用 SSR研究栲树群体遗传结构 411　
0.86。可以看出 ,栲树群体的遗传多样度偏低 。说
明由于栲树资源的减少 ,可能已使福建省内栲树遗
传变异水平有所下降 ,因而保护现有的栲树遗传资
源是十分迫切和重要的。
3.2　SSR等位基因频率与群体分化
许多研究结果表明 , Fst值揭示的林木的群体分
化程度远远小于种源试验得到的形态 、生长等特征
上的分化 , 即有其局限性[ 12] 。栲树的 Fst值仅为
0.031 ,从 Fst值来看群体分化程度较低 。而利用
SSR标记高度多态性的等位基因进行分析 ,发现每
个位点各等位基因的频率在 4个群体的分布都存在
显著或极显著差异(表3;图 2)。说明根据SSR等位
基因频率分布的情况 ,在每个位点上都能明显地看
出栲树4个群体的分化 ,这也是 SSR标记在群体遗
传变异分析中的优势所在。SSR还能揭示群体中的
稀有等位基因 ,栲树 54个 SSR等位基因中有 15 个
等位基因(占27.8%)仅在其中1 ～ 2群体中出现 ,也
就是说有 27.8%的 SSR等位基因变异是各群体独
特的或稀有的 ,也从某一方面反映了群体间的分化 。
这些独特的或稀有的等位基因在多样性保护方面更
具重要意义 。它提醒人们 ,某些栲树群体或个体的
消失可能使一些栲树的等位变异在地球上灭绝。不
过 ,为了科学地制定栲树遗传资源保护策略 ,应该在
主要分布区范围内研究更多的群体 ,以及对每个群
体研究更多的个体(每群体 30 ～ 50个个体),以期获
得更全面的栲树遗传信息 。
本研究 SSR引物原用于栎属的研究[ 9] 。引用
的18对引物有 11对在栲树中扩增出了谱带 ,表明
SSR引物在栎属与栲树间具有一定的保守性。研究
的6对 SSR引物在栎属的 Quercus petraea 与栲树中
平均每对引物都能扩增出 9个等位基因 ,表现为很
丰富的多态性。不过 ,相同引物扩增出的片段长度
在两属间有差异 ,这些差异有待于通过序列测定找
到准确答案 。由于 SSR标记丰富的多态性 ,使我们
能从更细微或更深层次研究群体的遗传变异 ,加上
SSR标记扩增结果的高重复性 ,使其不失为研究遗
传变异的理想分子标记;SSR表现出的一定保守性 ,
预示 SSR标记在栲树遗传变异研究中具有广阔的
应用前景 。
参考文献:
[ 1] 　Millar C I , Westfall R D.Allozyme markers in forest genet-
ic conservation.New Forests , 1992 , 6:347-371.
[ 2] 　Marshall D R.Crop genetic resources:current and emerg-
ing issues.Brown A H D , Clegg M T , Kahler A L , Weir B
S.Plant Population Genetics , Breeding and Genetic Re-
source.Sunderland:Sinauer , 1989.367-388.
[ 3] 　Barreneche T , Bodenes C , Lexer C , Trontin J F , Fluch S ,
Streiff R, Plomion C , Roussel G , Steinkellner H , Burg K ,
Favre J M , Glossl J , Kremer A.A genetic linkage map of
Quercus robur L.(pedunculate oak)with RAPD , SCAR,
microsatellite , isozyme and rDNA markers.Theor Appl
Genet , 1998 , 97:1090-1103.
[ 4] 　Brondani R P V , Brondani C , Tarchini R , Grattapaglia D.
Development characterization and mapping of microsatellite
markers in Eucalyptus grandis and E.urophylla.Theor
Appl Genet , 1998 , 97:816-827.
[ 5] 　Xiong L_Z(熊立仲), Wang S_P(王石平), Liu K_D(刘
克德), Dai X_K(戴先凯), Saghai Maroof M A , Hu J_G
(胡锦国), Zhang Q_F(张启发).Distribution of simple
sequence repeat and AFLP markers in molecular linkage
map of rice.Acta Bot Sin(植物学报), 1998 , 40:605-
614.(in Chinese with English abstract)
[ 6] 　Powell W , Morgante M , Andre C , Hanafey M , Vogeel J ,
Rafalski A.The comparison of RFLP , RAPD , AFLP and
SSR(microsatellite)markers for germplasm analysis.Mol
Breed , 1996 , 12:225-238.
[ 7] 　Russell J R, Fuller J D , Macaulay M , Hatz B G , Jahoor
A , Powell W , Waugh R.Direct comparison of levels of ge-
netic variation among barley accessions detected by RFLPs ,
AFLPs , SSRs and RAPDs.Theor Appl Genet , 1997 , 95:
714-722.
[ 8] 　Doyle J J , Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure for
small quantitives of fresh leaf tissue.Phytochem Bull ,
1987 , 19:11-15.
[ 9] 　Steinkellner H , Fluch S , Turetschek E , Lexer C , Streiff R,
Kremer A , Burg K , Glossl J.Identification and characteri-
zation of (GA/CT)n_microsatellite loci from Quercus pe-
traea.Plant Mol Biol , 1997 , 33:1093-1096.
[ 10] 　Pfeiffer A , Olivieri A M , Morgante M.Identification and
characterization of microsatellite in Norway spruce (Picea
abies K.).Genome , 1997 , 40:411-419.
[ 11] 　Dayanandan S , Rajora O P , Bawa K S.Isolation and char-
acterization of microsatellites in trembling aspen (Populus
tremuloides).Theor Appl Genet , 1998 , 96:950-956.
[ 12] 　Yi N_J(易能君), Shi J_S(施季森), Wang M_X(王明
庥).Genetic diversity and multilocus structure in forest
trees.Chinese Biodiversity(生物多样性), 1996 , 4:153-
159.(in Chinese with English abstract)
(葛颂编委推荐)(责任编辑:梁　燕)
412　 植　物　学　报　　Acta Botanica Sinica 43 卷