全 文 ：Ｒesearch Paper 研究报告
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica
54(5) :498 － 508;4 May 2014
ISSN 0001 － 6209;CN 11 － 1995 /Q
http:/ / journals． im． ac． cn /actamicrocn
doi:10. 13343 / j． cnki． wsxb． 2014. 05. 004
基金项目:四川省科技支撑计划项目(2012ＲZ0018) ;国家自然科学基金(31070004)
* 通信作者。Tel:+ 86-28-8629117;Fax:+ 86-28-86290983;E-mail:cyxue2002@ aliyun． com
作者简介:徐开未(1971 －) ，女，四川泸县人，副教授，博士，主要从事生物固氮研究。E-mail:xkwei@ 126． com
收稿日期:2013-09-04;修回日期:2013-12-25
凉山州新银合欢根瘤菌的共生有效性及遗传多样性
徐开未，张小平，陈远学* ，古飞越，周德海，唐成义
四川农业大学资源环境学院，四川 成都 611130
摘要:【目的】研究分离自四川凉山州新银合欢根瘤菌的遗传多样性和共生有效性。【方法】采用 16S rＲNA
ＲFLP、BOX-PCＲ、AFLP、多位点持家基因序列的联合分析及无氮水培法对 33 株供试新银合欢根瘤菌的遗传
多样性和共生有效性进行研究。【结果】分析表明，3 种方法在属水平的分群结果具有较好的一致性，有 1 个
Mesorhizobium属的菌株、3 个 Bradyrhizobium属的菌株、3 个 Ｒhizobium 属的菌株，26 个相似度较高的菌株属
Sinorhizobium。16S rＲNA-recA-atpD-glnII 序列联合构建的新银合欢根瘤菌系统发育树表明，SCAU203、
SCAU211 可能分别是 Ｒhizobium 和 Bradyrhizobium 的新类群，另外 3 个代表菌株分别位于 Sinorhizobium、
Mesorhizobium、Bradyrhizobium分支，分别与 S． americanum、M． Plurifarium、Ｒ． huautlense 亲缘关系最近。无
氮水培接种试验筛选出 2 个共生固氮效果好、与不接种对照处理差异达显著水平的菌株 SCAU229 和
SCAU307，有 3 个菌株不仅不具共生有效性，甚至不利于宿主的生长，其余 84%的供试菌为低效或无效菌株。
【结论】凉山州新银合欢根瘤菌具有丰富的遗传多样性，分布于 4 个属:Ｒhizobium、Bradyrhizobium、
Mesorhizobium、Bradyrhizobium，79%为 Sinorhizobium属的菌株，优势菌群为 Sinorhizobium。该区的新银合欢根
瘤菌大多数的共生有效性差。
关键词:银合欢，根瘤菌，持家基因，遗传多样性，多位点基因序列分析，共生有效性
中图分类号:Q939 文章编号:0001-6209(2014)05-0498-11
凉山州位于四川西南部，地处四川盆地向青藏
高原、云贵高原的过渡地带，具西北高、东南底、切割
强烈、高低悬殊、地质结构破碎的地貌特征，辖有金
沙江、雅砻江和安宁河 3 条干热干旱河谷，位于长江
上游核心地带，是水土流失的严重地域，也是实施退
耕还林工程的重点区域。
银 合 欢 (Leucaena leucocephala )为 豆 科
(Leguminosae)含羞草亚科(Mimosoideae)银合欢属
(Leucaena)，多年生灌木或乔木，是一种具有多种用
途的热带优良植物，原产于中美洲沿海地区，广泛分
布于热带、亚热带地区。1961 年 8 月华南热带作物
研究所从中美洲引进了少量的萨尔瓦多型银合欢种
子，经试种发现其生长势和产量等均优于普通银合
欢，将其定名为新银合欢［1］。银合欢具有速生、抗
旱、耐贫瘠、耐干热的特点。凉山州尤其是干热河谷
恶劣的生态环境制约了许多树种的生长，“七五”期
间引进筛选 K8 型新银合欢为主要造林树种，仅在
凉山州宁南县干热河谷带的种植面积就在 10 万亩
以上［2］。该植物已成为该区天然林保护、退耕还林
工程的重要先锋树种。
徐开未等:凉山州新银合欢根瘤菌的共生有效性及遗传多样性． /微生物学报(2014)54(5)
根瘤菌—豆科植物形成的根瘤或茎瘤共生固氮
是最强的固氮体系，具有固氮量大、抗逆能力强等优
点，在农、林、牧业可持续发展，环境和生态的可持续
利用中具有重要作用。凉山州新银合欢从未接种根
瘤菌。目前对新银合欢共生的根瘤菌已有少量报
道，本课题组研究了金沙江干热河谷新银合欢根瘤
菌的表型多样性、用 rDNA ＲFLP、持家基因和共生
固氮基因序列等揭示其遗传多样性［3 － 4］，但其中仅
有 13 株分离自凉山州新银合欢［3 － 4］，而对凉山州新
银合欢的根瘤菌有效菌株的筛选、遗传多样性缺乏
更深入全面的认识。为此，在前期研究的基础
上［3 － 4］，本研究重新分离获得 20 个菌株，用 16S
rＲNA ＲFLP、BOX-PCＲ、AFLP 和多位点基因序列联
合分析技术，从不同角度研究凉山州这一特殊生境
新银合欢根瘤菌的遗传多样性，进一步揭示其亲缘
关系和为进化奠定基础。同时初步筛选高效菌株，
对该生境退化生态系统的植被恢复与重建工程具有
积极的生态学意义。
1 材料和方法
1. 1 材料
本试验共 48 个菌株，其中 15 个为参比菌株(图
1)，33 个未知菌分离自四川省凉山州的 4 个县 8 个
乡镇的新银合欢属植物。33 个未知菌株全部用于
BOX-PCＲ和 AFLP指纹图谱分析;用于共生有效性
分析的未知菌 20 株(其余 13 个未知菌已经回接试
验证实能使原宿主结瘤［3］);用于 16S rＲNA ＲFLP
分析的有 22 个未知菌和 15 个为参比菌株。未知菌
株编号、来源及研究方法见表 1。
表 1 供试菌株
Bacterial Strains tested
isolate source or region elevation /m method
SCAU290 Hulukou Town Ningnan County LP 790 a，b，c，d
SCAU291 Hulukou Town Ningnan County LP 790 a，b，c，d
SCAU292 Hulukou Town Ningnan County LP 790 a，b，c，d
SCAU293 Jinxing Town Ningnan County LP 920 a，b，c，d
SCAU194 Jinxing Town Ningnan County LP 920 b，c
SCAU294 Hulukou Town Ningnan County LP 720 a，b，c，d
SCAU195 Hulukou Town Ningnan County LP 720 b，c
SCAU196 Hulukou Town Ningnan County LP 720 b，c
SCAU295 Hulukou Town Ningnan County LP 1280 a，b，c，d
SCAU197 Hulukou Town Ningnan County LP 1280 b，c，e
SCAU296 Hulukou Town Ningnan County LP 1280 a，b，c，d
SCAU297 Hulukou Town Ningnan County LP 1280 a，b，c，d
SCAU199 Dachong Town Huidong County LP 720 b，c
SCAU298 Dachong Town Huidong County LP 720 a，b，c，d
SCAU299 Dachong Town Huidong County LP 720 a，b，c，d
SCAU300 Pisha Town Ningnan County LP 1170 a，b，c，d
SCAU301 Pisha Town Ningnan County LP 1170 a，b，c，d
SCAU302 Pisha Town Ningnan County LP 1170 a，b，c，d
SCAU303 Pisha Town Ningnan County LP 1170 a，b，c
SCAU202 Pisha Town Ningnan County LP 1170 b，c，e
SCAU304 Pisha Town Ningnan County LP 1170 a，b，c
SCAU203 Pisha Town Ningnan County LP 1170 b，c，e
SCAU204 Pisha Town Ningnan County LP 1110 b，c
SCAU305 Pisha Town Ningnan County LP 1110 a，b，c，d
SCAU306 Puji Town Puge County LP 1190 a，b，c，d
SCAU307 Puji Town Puge County LP 1190 a，b，c，d
SCAU205 Puji Town Puge County LP 1190 b，c
SCAU308 Puji Town Puge County LP 1190 a，b，c，d
SCAU309 Xiaoliao Town Xichang City LP 1480 a，b，c，d
SCAU310 Xiaoliao Town Xichang City LP 1480 a，b，c，d
SCAU209 Xiaoliao Town Xichang City LP 1480 b，c，e
SCAU211 Xiaoliao Town Xichang City LP 1480 b，c，e
SCAU311 Xiaoliao Town Xichang City LP 1480 a，b，c，d
LP:Liangshan Prefecture;a:16S rＲNA PCＲ-ＲFLP;b:BOX-PCＲ;c:AFLP;d:Symbiotic efficiency;e:Concatenated sequence analysis of 16S
rＲNA-recA-atpD-glnII．
994
Kaiwei Xu et al． /Acta Microbiologica Sinica(2014)54(5)
1. 2 根瘤菌的分离与回接结瘤试验
将采回的根瘤进行表面消毒后，无菌镊子压碎
根瘤，在加有刚果红的 YMA 平板上划线接种，28℃
条件下培养，随时观察生长情况，将不同时间出现的
具有典型根瘤菌菌落特征的菌落在 YMA 平板上进
行多次稀释平板分离和纯化，纯化后进行革兰氏染
色镜检为阴性、短杆状、无芽孢的转接于 YMA 斜
面，28℃培养好后于 4℃冰箱保藏备用，并用 25%左
右的甘油 － 70℃超低温冰箱保藏。
回接试验用水培法，在光照室进行。选择粒大、
饱满的原宿主种子表面消毒后，28℃催芽，待主根长
到 2 cm －3 cm左右，须根未长出移栽入 250 mL 的
无氮营养液水培器。同时接种供试菌的菌悬液 1
mL。菌悬液制作:各取斜面菌试管一支，加入无菌
水4 mL，刮洗菌苔，制成菌悬液，将根沾上菌悬液，
插入水培器小孔内，每瓶 1 株。用无菌移液管每瓶
加 1 mL菌液。然后种子周围用原来孔内的棉花塞
紧，防止尘埃落入瓶内，造成污染。光照室(控温 22
－ 24℃，光照强度 2700 － 3000 lux，日照时间 12 －
14 h)培养 56 d。培养期间及时补充营养液。各处
理重复 3 次。收获后称子叶以上部分干重，计数总
瘤数。利用 EXCEL2010 和 SPSS15. 0 软件进行数据
统计分析。差异显著性检验用 LSD法(P = 0. 05)。
1. 3 总 DNA的提取
总 DNA的提取，见文献［3］。
1. 4 16S rＲNA ＲFLP
以总 DNA为模板，用通用引物 P1 和 P6［3］扩增
16S rDNA。PCＲ 反应用 Bio-ＲAD MyCyclerTM仪器。
扩增反应程序及产物检测方法同［3］。
16S rＲNA PCＲ-ＲFLP 选用 4 种限制性内切酶:
MspⅠ、TaqⅠ、HaeⅢ和 HinfI。酶切反应体系:5 μL
PCＲ扩增产物，6 U 限制性内切酶，37℃(TaqⅠ为
65℃)保温 6 － 10 h，用含 EB的 3%琼脂糖凝胶进行
电泳(80 V，3. 5 h)，用凝胶成像系统记录成像，图像
保存为 JPG 形式。按照每个菌株的酶切条带所在
位置的不同划分酶切类型，只有 4 种酶切条带都分
别相同的菌株划分至同一酶切类型。
1. 5 BOX-PCＲ
用 BOXAIＲ 引物(5’-CTACGGCAAGGCGACG
CTGACG-3’)。扩增反应体系:2 × PCＲ Mix 10 μL，
BOXAIＲ引物(30 pmol /μL)0. 32 μL。扩增反应程
序同文献［5］。PCＲ产物用 2%琼脂精凝胶 60 V电
泳分离 4 h，凝胶成像系统扫描。
1. 6 AFLP分析
酶切片段连接用的 2 个接头、PCＲ 扩增用的具
有 2 个选择性碱基的 Eco 和 Mse 引物与文献［5］同。
取 5 － 8 μL 供试 DNA 样品，用 EcoＲ I 和 Mse I 酶
切，用 T4 DNA连接酶将酶切片段 与 Eco 连接头和
Mse连接头连接后，用 Eco 和 Mse 引物进行 PCＲ 扩
增。酶切连接及 PCＲ 扩增程序按陈强等［5］的方法
进行。初步检测 PCＲ 产物用 0. 8%的琼脂糖凝胶。
取 4 μL的 PCＲ 产物与等体积的上样缓冲液混合，
90℃变性 5 min，用 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、
银染、固定、干燥，扫描凝胶。
1. 7 多位点基因序列的联合分析
选择 4 个位点的持家基因 16S rＲNA、recA、atpD
和 glnII序列进行联合系统发育树构建。部分代表
菌株 4 个基因的单个基因序列在文献［3 － 4］已作
报道。其余菌株的 4 个基因序列扩增的通用引物、
反应体系、扩增程序、测序、在 NCBI 上获取代表菌
株的方法及基因序列号的获得方法等同文献
［3 － 4］。
4 个基因联合系统发育树的构建:先将 16S
rＲNA、atpD、recA、glnII 4 个持家基因的序列分别用
MEGA5 比对，以最小长度为标准剪齐，将剪齐后的
序列保存为 FASTA 格式。以记事本格式打开将 4
个序列拼接在一起，用 MEGA5 软件中的邻接法
(Neighbor-joining)进行联合系统发育树的构建，自
展值(bootstrap)1000。
1. 8 电脉指纹图谱的处理
16S rＲNA ＲFLP、BOX-PCＲ 和 AFLP 的电脉图
谱转化成计算机可识别的数值“0”和“1”，用软件
NTSYS2. 1 中的平均连锁聚类法将结果转化为
UPGMA聚类树状图。
2 结果
2. 1 供试菌株的共生有效性
本研究用无氮水培法初步检测了 20 个供试菌
的共生有效性(表 1)。从表 1 知，供试的 20 个菌株
中，有一个菌株(SCAU309)不与原宿主结瘤，但菌
落特点极似根瘤菌，其余 19 个菌株处理的平均结瘤
量为 8. 3 个 /株。仅有 2 个(10%)菌株与原宿主共
生有效性好，其植株干重比 CK增 36%以上，达极显
005
徐开未等:凉山州新银合欢根瘤菌的共生有效性及遗传多样性． /微生物学报(2014)54(5)
著水平;结瘤量 10 － 11 个 /株。另外还有 3 个菌株
(SCAU290、SCAU306、SCAU310)不仅不具共生有效
性，甚至显著不利于植株的生长，其植株的干重甚至
比 CK低 28% －52%，差异达显著或极显著水平，其
结瘤量 8. 7 － 12. 0 个 /株。其余 15 个菌株，植株干
重与 CK 的差异不显著，结瘤量 5. 0 － 15. 0 个 /株。
本研究表明，共生有效性好的菌株结瘤量是中等水
平，结瘤量过低或过高的菌株的有效性差;但结瘤量
中等的菌株也有无效菌株甚至是明显不利于植物生
长的菌株。植株的干重与结瘤量呈正相关(r =
0. 196)，但未达显著水平。综上，菌株的有效性不
宜仅用结瘤量来衡量。
表 2 供试菌株共生有效性及 16S rＲNA ＲFLP限制性酶切图谱类型
Table 2 Symbiotic traits and 16S rＲNA ＲFLP characteristics of rhizobia isolated from L． leucacephala in Liangshan Prefecture
isolates No．
symbiotic trait PCＲ-ＲFLP of 16S
plant shoot dry
weight (g /plant)a，b
No． of nodule
(per plant)
16S rＲNA ＲFLP
patternc
16S rＲNA
genotyped
SCAU307 63. 8 ± 10. 4 +＊＊ 10 ± 4. 6 + * aaaa i
SCAU299 62. 4 ± 8. 6 +＊＊ 11. 0 ± 4. 0 + * aaaa i
SCAU305 57. 0 ± 10. 9 ns 6. 3 ± 4. 2 + * aaaa i
SCAU291 53. 2 ± 7. 5 ns 4. 3 ± 2. 3 ns aaaa i
SCAU300 52. 2 ± 8. 1 ns 7. 7 ± 3. 8 + * aaaa i
SCAU294 50. 7 ± 11. 4 ns 15. 3 ± 7. 6 + * aaaa i
SCAU295 50. 3 ± 2. 4 ns 7. 3 ± 1. 5 + * aaaa i
CK 45. 8 ± 2. 9 ns 0. 0 ± 0. 0 － －
SCAU292 44. 8 ± 6. 5 ns 8. 3 ± 3. 2 + * aaaa i
SCAU296 42. 9 ± 6. 4 ns 7. 3 ± 3. 1 + * aaaa i
SCAU302 40. 6 ± 3. 3 ns 11. 3 ± 4. 5 + * aaaa i
SCAU298 39. 3 ± 6. 6 ns 13. 0 ± 4. 0 + * aaaa i
SCAU311 38. 3 ± 8. 4 ns 11. 3 ± 1. 2 + * cacb ii
SCAU308 38. 0 ± 5. 1 ns 5. 7 ± 2. 5 ns aaaa i
SCAU301 35. 9 ± 8. 6 ns 5. 7 ± 3. 1 ns aaaa i
SCAU309 35. 0 ± 4. 4 ns 0. 0 ± 0. 0 ns bbbb iii
SCAU297 34. 8 ± 6. 4 ns 5. 0 ± 2. 0 ns aaaa i
SCAU293 34. 7 ± 4. 8 ns 6. 0 ± 3. 0 + * aaaa i
SCAU306 33. 0 ± 7. 0 － * 12 ± 5. 2 + * aaaa i
SCAU290 32. 2 ± 2. 2 － * 8. 7 ± 3. 5 + * aaaa i
SCAU310 20. 8 ± 4. 0 － * 9. 7 ± 4. 7 + * cacb ii
a Data presented as average ± standard deviation from three replicates． b + * ，－ * and ns indicates an increase，a decrease or a non-significant difference
in plant shoot dry weight according to the LSD test (* at 0. 05 level) ，respectively． c Each letter refers to a restriction pattern obtained with enzymes
HaeIII，HinfI，MspI and TaqI，respectively． d The 16S rＲNA genotypes of Leucaena rhizobia represent combination of restriction patterns obtained by
enzymes used (HaeIII，HinfI，MspI and TaqI)． CK:uninoculated control．
2. 2 16S rＲNA PCＲ-ＲFLP分析
供试的 33 个菌株中，有 11 个菌株的 16S rＲNA
PCＲ-ＲFLP文献［3］已作报道。本研究对余下的 22
个菌株进行 16S rＲNA PCＲ-ＲFLP分析。
用引物 P1 和 P6 扩增供试菌株的 16S rＲNA，均
产生一条约 1. 5 kb的 DNA片段。扩增产物分别用
4 种限制性内切酶(HaeIII、HinfI、MspI 和 TaqI)酶切
后，经 2%琼脂糖凝胶电泳分离后成像，部分酶切结
果如图 1 所示。供试 22 个菌株，分别得到 3 种
HaeIII、2 种 HinfI、3 种 MspI、2 种 TaqI限制性内切酶
酶切图谱类型。4 种限制性内切酶酶切图谱类型的
组合见表 2 和图 1。从表 2 和图 1 可以看出，分离
自凉山州的 22 株菌具有 3 种 16S rＲNA遗传图谱类
型，且其中大部份菌株(19 个，86%)属 i型。
为了更全面地反映凉山州新银合欢根瘤菌 16S
rＲNA PCＲ-ＲFLP，将前期分离到的在文献［3］已报
道 16S rＲNA PCＲ-ＲFLP 的 11 个菌株，与参比菌株
一起建立聚类分析树状图(图 1)。结果表明，33 个
凉山州新银合欢根瘤菌分成 5 个 16S rＲNA 遗传图
谱类型，所有菌株在 67%的相似水平上分成快生根
瘤菌和慢生根瘤菌 2 个分支。绝大多数菌株(30
株，91%)形成快生根瘤菌分支，且大多数(26 株，
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图 1． 16S rＲNA PCＲ-ＲFLP 聚类图
Figure 1． UPGMA dendrogram constructed based on the ＲFLP analysis of PCＲ-amplified 16S rＲNA genes of the Leucaena rhizobia using
4 restriction endonucleases (MspI，HinfI，HaeIII and TaqI)．
79%)与供试 Sinorhizobium 参比菌构成 1 个分支。
仅 1 个菌株(SCAU202A)属Mesorhizobium，各有 3 个
菌株分属于 Bradyrhizobium和 Ｒhizobium。可见。凉
山州新银合欢根瘤菌遗传多样性丰富，其优势种群
为中华根瘤菌(Sinorhizobium)。
虽 79%的未知菌属 Sinorhizobium，且它们的
4 种酶切图谱完全相同，均属 16S rＲNA 遗传图谱
类型 i，但它们分离自凉山州的 3 个县，海拔高度
720 m － 1280 m 的范围内的新银合欢。因 16S
rＲNA 基因的相似性很高，无法很好地区分该属
内不同的种，即 16S rＲNA PCＲ-ＲFLP 分辨率低，
没能很好地体现其多样性。于是选择更能体现
属内种间多样性的另一个分子标记方法 BOX-
PCＲ 进行分析。
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2. 3 BOX-PCＲ指纹分析
图 2． BOX-PCＲ指纹图谱聚类树状图
Figure 2． UPGMA dendrogram derived from BOX-PCＲ． Based on 16S ＲFLP，the isolates in boldface and underline were
assigned to Mesorhizobium，in boldface and italics to Bradyrhizobium，In boldface to Ｒhizobium，and the others to
Sinorhizobium．
如图 2 所示，BOX-PCＲ 的分群结果与 16S
rＲNA PCＲ-ＲFLP 在属水平上一致。33 个未知菌在
56%相似水平将 Ｒhizobium 菌株分开，形成分支 1;
64%的相似水平将 Mesorhirobium 菌株分离出来，形
成分支 2;75% 的相似水平又将 Bradyrhizobium 分
开;而属 Sinorhizobium的 26 个菌株的 16S rＲNA 遗
传图谱类型完全相同，但在 BOX-PCＲ分析中形成 4
个 BOX-PCＲ 遗传图谱类型(I，II，III，IV)，在
BOX-PCＲ指纹图谱聚类树状图中分成两个分支(分
支 4 和 5)。在相似度为 97%时，分成了 8 个 BOX
表观群，比 16S rＲNA ＲFLP表现出的遗传多样性丰
富。分支 5 的 23 个菌株中有 22 个的 BOX 指纹图
谱相同，属 BOX 遗传图谱 I 型，这些菌株分离自不
同县不同海拔高度，而 BOX-PCＲ 也未能将其分开，
于是再选择 AFLP分子标记技术研究它们的遗传多
样性。
2. 4 AFLP指纹分析
AFLP的指纹图谱见图 3，其 AFLP 指纹图谱聚
类结果见图 4，全部 33 个供试菌株在属水平上的分
群结果与 16S ＲFLP和 BOX是一致的。全部菌株在
97%的相似水平上分成 26 个 AFLP 群。26 个中华
根瘤菌(根据 16S rＲNA ＲFLP的分群结果)，具有 24
个 AFLP遗传图谱类型，分成 20 个 AFLP表观群，说
明凉山州新银合欢根瘤菌的优势菌群中华根瘤菌
(Sinorhizobium)具有丰富的遗传多样性。同时也表
明 AFLP指纹分析对相关性较高菌株的分群具有较
高的参考价值，分辨率比 16S rＲNA ＲFLP 和 BOX-
PCＲ高。
2. 5 多位点基因序列的联合分析
多位点基因序列分析(Multilocus Sequence
Analysis，MLSA)是对细菌的染色体上不同位点的多
305
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个保守基因序列的同源性分析，以确定各种细菌的
亲缘关系和分类地位。目前已被用于根瘤菌种群的
划分及种内遗传多样性和系统发育研究［4，6 － 7］。
根据 16S rＲNA ＲFLP、BOX-PCＲ 及 AFLP 指纹
图谱的聚类 结 果，选 取 分 属 于 Sinorhizobium、
Bradyrhizobium、Mesorhizobium、Ｒhizobium 代表菌株 5
个，选染色体上的 16S rＲNA、recA、atpD、glnII 4 个不
同位点的持家基因进行 MLSA 分析。4 个基因的联
合系统发育树构建的参比菌株的选择:将同一代表
菌株的每个基因序列在 NCBI 上比对，选择与 4 个
基因相似度高的模式菌株作为建树的参比菌株。与
代表菌株 SCAU209 的 16S rＲNA、recA、atpD、glnII 序
列相似度最高的种是 Ｒ． huautlense，但 Ｒ． huautlense
模式种无 glnII基因序列的报道，于是联合系统发育
树构建中，选择与 SCAU209 的 4 个基因相似度最高
的 Ｒ． huautlense CCBAU65679 代替该种的模式菌株
进行联合建树(图 5)。用 Mega5 先对每个持家基因
的代表菌株和参比菌株的序列进行比对分析，比对
完成后删除序列两端不能完全对齐的碱基，用这个
方法，获得 16S rＲNA、recA、atpD、glnII 序列分别为
1319、387、406、507 nt。然后每个菌株按 16S rＲNA-
recA-atpD-glnII的顺序获得联合系统发育树构建的
2619nt序列。从图 5 可知，5 个代表菌株的属水平
如前述的 16S rＲNA ＲFLP、BOX-PCＲ 及 AFLP 指纹
图谱的聚类结果。代表菌株 SCAU197 与 S．
americanum LMG 22684T以 97. 4 %的相似度聚在一
起。SCAU202 与 M． plurifarium OＲS 1032T的相似
度最高(96. 2 %)。SCAU211 与所选择的 5 个
Bradyrhizobia 模 式 菌 株 构 成 姊 妹 分 支，说 明
SCAU211 可能是 Bradyrhizobium 的一个新类群。两
个 Ｒhizobium代表菌株形成两个分支，SCAU209 与
Ｒ． huautlense CCBAU65679 以 99. 6 %相似度聚在
一起。SCAU203 却与另外 3 个模式菌 Ｒ． gallicum
KACC 10719T、Ｒ． yanglingense CCBAU71623T、Ｒ．
mongolense USDA 1844T形成姊妹分支，SCAU203 也
可能是 Ｒhizobium 的一个新类群。
3 讨论
凉山州新银合欢根瘤菌遗传多样性丰富，但
Sinorhizobium为优势类群，33 个供试菌株中，有 1 株
属于 Mesorhizobium、3 株属于 Bradyrhizobium、3 株属
图 3． 部分供试菌株的 AFLP 指纹图谱
Figure 3． AFLP fingerprints for the part of tested isolates．
Lane1 － 13:SCAU304，SCAU310，SCAU203，SCAU204，
SCAU305，SCAU303，SCAU307，SCAU205，SCAU308，
SCAU309，SCAU310，SCAU209，SCAU311．
于 Ｒhizobium，26 个(79%)菌株属于 Sinorhizobium
属的菌株。这与我们前期工作报道的四川攀枝花市
银合欢根瘤菌类似［3］，已报道的 20 个攀枝花市银合
欢根瘤菌中，分别仅有 1 株 Mesorhizobium 和 1 株
Ｒhizobium属的菌株，18 株属于 Sinorhizobium属的菌
株，未发现 Bradyrhizobium 属的菌株。Wang 等［8］已
报道过广东 9 个和福建 6 个银合欢根瘤菌，广东省
有 9 个菌株分布在 3 个属:Mesorhizobium(5 株)、
Sinorhizobium(3 株)、Bradyrhizobium(1 株) ;福建省
的 6 株分布在 3 个属:Mesorhizobium (3 株)、
Agrobacterium(2 株)、Sinohizobium(1 株);可见，广
东、福建省的银合欢根瘤菌以 Mesorhizobium 属的菌
株占优势。Wang 等［9］报道的 150 株来自墨西哥的
银合欢根瘤菌中，有 95 株属 Sinorhizobium，无
Bradyrhizobium属的菌株。综上，银合欢根瘤菌与生
态环境的关系密切，可能如 Tian 等［10］、Li 等［11］、
Zhang等［12］研究的大豆根瘤菌相似，即具有一定的
生物 地 理 学 分 布 规 律，且 银 合 欢 根 瘤 菌 中
Sinorhizobium菌株分布更广泛。
凉山州新银合欢根瘤菌以 Sinorhizobium为优势
菌 群，而 广 东、福 建 省 的 银 合 欢 根 瘤 菌 以
Mesorhizobium菌株占优势。可见，共生固氮效果好
的优良菌株筛选应从当地生境中进行选择。本研究
的从 20 个供试菌株中筛选出 2 个共生固氮效果好、
与未接种对照(CK)差异达显著水平的菌株
SCAU229 和 SCAU307。从表 1 和前面的分析知，有
405
徐开未等:凉山州新银合欢根瘤菌的共生有效性及遗传多样性． /微生物学报(2014)54(5)
图 4． AFLP 指纹图谱聚类树状图
Figure 4． UPGMA dendrogram obtained from AFLP． Based on 16S ＲFLP，the isolates in boldface and underline
were assigned to Mesorhizobium，in boldface and italics to Bradyrhizobium，In boldface to Ｒhizobium，and the
others to Sinorhizobium．
3 个菌株不仅不具共生有效性，甚至显著不利于宿
主的生长，其余 84%的供试菌为低效或无效菌株，
由上可见，生产用菌株的筛选，匹配性和有效性的研
究尤其重要。
对于根瘤菌的遗传多样性的研究，指纹图谱的
方法是常用技术［5，11 － 14］。本研究用了 16S rＲNA
ＲFLP、BOX-PCＲ和 AFLP技术。基于基因组水平的
AFLP和 BOX-PCＲ技术比持家基因的 ＲFLP的分辨
率高，这与前人的研究一致［14 － 15］。本研究认为
AFLP比 BOX-PCＲ 技术具有更高的分辨能力。同
样的 33 个供试菌株，分别有 8 个 BOX、31 个 AFLP
遗传图谱类型;在 97 %的相似水平上二者分别形成
8 个 BOX、26 个 AFLP 表观群;33 个菌株产生 25 条
BOX-PCＲ(400 － 1600 bp范围)、118 条 AFLP(100 －
1000 bp)指纹条带;再结合图 3 和图 4，本研究的
BOX-PCＲ、AFLP指纹图谱的聚类，在属和种水平具
有较好的一致性，也具有较好的属种水平的分辨能
力，但在同种或同一亚种不同菌株间的差异分型方
面，AFLP比 BOX-PCＲ 更可靠，是高分辨率的分开
型方法。
SCAU211 和 SCAU203 可 能 分 别 是
Bradyrhizobium 和 Ｒhizobium 的 新 类 群。在 16S
rＲNA-recA-atpD-glnII序列联合构建的新银合欢根
瘤菌系统发育树中，SCAU203 与 Ｒhizobium 的 3 个
种的 模 式 菌 株 构 成 姊 妹 分 支;SCAU211 与
Bradyrhizobium的几个种的模式菌也构成姊妹分支，
SCAU211 的 16S rＲNA、recA、atpD、glnII 4 个基因的
序列在文献［3 － 4］中已报道，与 SCAU211 的 4 个基
505
Kaiwei Xu et al． /Acta Microbiologica Sinica(2014)54(5)
图 5． 以 16S rＲNA-recA-atpD-glnII序列联合构建的系统发育树
Figure 5． Phylogenetic tree based on the concatenated sequences of 16S rＲNA (1319 nt)，recA (387 nt) ，atpD (406 nt)and
glnII (507 nt)sequences． GenBank accession numbers in boldface were newly determined as a result of this study． Bootstrap
confidence leves≥50% (1000 replicates)are indicated at the internodes． The scale bar represents 2 % nucleotide substitutions．
因相似度最高模式菌分别是 B． japonicum USDA 6T
(相似度 99. 6 %)、B． liaoningense USDA 3622T
(95. 1 %)、B． betae LMG 21987T (96. 1 %)、B．
canariense LMG 22265T(96. 0 %);可见，以 SCAU211
为代表的新银合欢根瘤菌可能是 Bradyrhizobium 属
的新类群;同时发现，这 4 个位点的持家基因普遍发
生着基因横向水平转移现象，基因水平转移可能在
其核心基因组的进化中起着重要作用，这与 Tian
等［10］报道的大豆根瘤菌中，基因重组(包括横向基
因转移)在根瘤菌的核心基因组的进化中发挥了主
导作用类同。当然，这两个类群是否为新种，还需要
后续工作如 DNA-DNA杂交、交叉结瘤、表型多样性
等试验结果进一步确证。
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Kaiwei Xu et al． /Acta Microbiologica Sinica(2014)54(5)
Symbiotic efficiency and genetic diversity of the rhizobia
isolated from Leucaena leucocephala in Liangshan
Prefecture
Kaiwei Xu，Xiaoping Zhang，Yuanxue Chen* ，Feiyue Gu，Dehai Zhou，Chengyi Tang
College of Ｒesource and Environment，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，Sichuan Province，China
Abstract:［Objective］We analyzed the symbiotic efficiency and genetic diversity of rhizobia isolated from Leucaena
leucocephala in Liangshan Prefecture of SichuanProvince． ［Methods］We studied genetic diversity of these isolates with
16S rＲNA ＲFLP，BOX-PCＲ and AFLP fingerprinting，and constructed phylogenetic tree based on the concatenated
sequences of the four housekeeping genes 16S rＲNA，recA，atpD and glnII． The nodulation ability and the symbiotic
efficiency of the isolates were tested by plant inoculation assay on their original host plant． ［Ｒesults］Genetic diversity
and phylogenetic tree indicate that 26 isolates were assigned as Sinorhizobium，3 Bradyrhizobium，3 Ｒhizobium and 1
Mesorhizobium． SCAU203 might represent a new Ｒhizobium group，SCAU211 might represent a new Bradyrhizobium
group，the other three representative strains were located in three phylogenic branches and closely related to S．
americanum，M． plurifarium and Ｒ． huautlense，respectively． In the nodulation and symbiotic efficiency assay，only 2 of
the 20 isolates promoted the growth of L． leucocephala，but 3 isolates had a growth slowing effect on the host，while the
other isolates (84%)were ineffective on symbiotic nitrogen fixation． ［Conclusion］The majority of rhizobia isolated from
L． leucocephala in Liangshan Prefecture were ineffective on symbiotic nitrogen fixation．
Keywords:Leucaena leucocephala，rhizobia，housekeeping genes，genetic diversity，multilocus sequence analysis，
symbiotic efficiency
( 本文责编: 张晓丽)
Supported by the Science and Technology Support Project of Sichuan Province of China (2012ＲZ0018)and by National Natural Science Foundation
of China (31070004)
* Corresponding author． Tel:+ 86-28-8629117;Fax:+ 86-28-86290983;E-mail:cyxue2002@ aliyun． com
Ｒeceived :4 September 2013 /Ｒevised:25 December 2013
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