全 文 ：中国农学通报 2011,27(15):297-300
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
植物源杀螨剂是防治农业害螨的有效方法，具有
高效和安全等优势[1-3]。寻找具有杀螨活性的植物种类
已成为当今研究热点之一[3-4]。已报道的植物材料，多
受到资源数量和生物量的限制，难以形成生产规模。
瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）为传统中药
材，属于生物入侵植物，在中国分布广、数量大，是重度
退化草原的主要种群。目前，已发现瑞香狼毒提取物
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30872029）；北京市自然科学基金重点项目（6071001）；北京市自然科学基金项目（6092007）；北京市教委重点
项目；北京市教委平台建设项目；北京市属高校人才强教深化计划资助项目（PHR20090516，PHR200906134）。
第一作者简介：梁为，男，1982年出生，北京人，在读博士，主要从事植物源农药研究。通信地址：102206北京市昌平区回龙观镇北农路7号北京农学
院研究生实验楼A104，Tel：010-80797308，E-mail：liang1wei@126.com。
通讯作者：王有年，男，1951年出生，北京人，教授，博士生导师，硕士，主要从事果品优质生态安全，发表研究论文100余篇，出版专著10余部。通信
地址：102206北京市昌平区回龙观镇北农路7号北京农学院，Tel：010-80799006，E-mail：wyn1951@126.com。
收稿日期：2010-12-07，修回日期：2011-01-23。
瑞香狼毒超临界CO2萃取物的杀螨毒力及机理初探
梁 为 1，马兰青 2，卜春亚 2，成 军 2，靳永胜 2，王有年 2，师光禄 2
（1北京林业大学，北京 100083；2北京农学院，农业部都市农业（北方）重点开放实验室，北京 102206）
摘 要：为了测定瑞香狼毒超临界CO2萃取物对朱砂叶螨的触杀毒力，并了解其作用机理，笔者采用玻片
浸渍法测定瑞香狼毒超临界CO2萃取物（SCE）对朱砂叶螨的触杀毒力，观察其对朱砂叶螨的致毒症状；
结果表明：SCE对朱砂叶螨24 h的触杀LC50值为2.411 mg/mL；中毒试螨表现出类似神经毒剂的致毒症
状，如兴奋、痉挛等。随后测定了 SCE对朱砂叶螨神经系统靶标酶（乙酰胆碱酯酶、单胺氧化酶、
Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶）活性的影响。结果表明，SCE能够显著抑制试螨乙酰胆碱酯酶、单胺
氧化酶、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性；据此推测，SCE对朱砂叶螨可能具有神经毒性。
关键词：瑞香狼毒；超临界萃取物；朱砂叶螨；酶活性；神经毒性
中图分类号：S436.6 文献标志码：A 论文编号：2011-0098
Preliminary Study on Toxicity of Supercritical Extract of Stellera chamaejasme L.
to Tetranychus cinnabarinus and its Acaricidal Mechanism
Liang Wei1, Ma Lanqing2, Bu Chunya2, Cheng Jun2, Jin Yongsheng2, Wang Younian2, Shi Guanglu2
(1Beijing Forestry University, Beijing 100083; 2Key Laboratory of Urban Agriculture (North),
Ministry of Agriculture, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206)
Abstract: In order to study the toxicity and possible lethal mechanism of supercritical extract of Stellera
chamaejasme L., the experiment was conducted. In this study, the contact toxicity of supercritical extract of
Stellera chamaejasme L. (SCE) to Tetranychus cinnabarinus was tested using slide dip method, and dynamic
toxicosis symptoms of SCE-exposed mites were also detailedly observed. The results showed that the contact
toxicity LC50 value of SCE to T. cinnabarinus was 2.411 mg/mL at 24th h post-treatment. Some typical
neurotoxic symptoms such as excitement and convulsions were observed in SCE-exposed mites. Subsequently,
the changes of activities of AChE, MAO, Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase after exposed to SCE were
assayed. The experiment showed that SCE could significantly inhibit the activities of AChE, MAO,
Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase. The results led us to believe that SCE may be a neurotoxin.
Key words: Stellera chamaejasme L.; supercritical extract; Tetranychus cinnabarinus; enzyme activity;
neurotoxicity
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对农业害螨具有触杀毒性和杀卵毒性[5-7]，但有关瑞香
狼毒超临界CO2萃取物（SCE）杀螨毒性和机理的报道
较少。因此，笔者通过研究 SCE 对朱砂叶螨
（Tetranychus cinnabarinus）的触杀毒力和致毒症状，测
定其对几种神经系统靶标酶活性的影响，以期为明确
SCE杀螨机理提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验时间、地点
实验于2009年3月—9月在北京农学院农业部都
市农业（北方）重点开放实验室内完成。
1.2 供试材料
采用江苏南通市华安超临界萃取有限公司的
HA221-50-06型超临界CO2萃取设备，CO2气体由北京
亥普北分气体工业有限公司提供，纯度≥99.5%。将
100 g狼毒干粉装入萃取釜，以无水乙醇为夹带剂。根
据预实验结果，设定参数为：CO2流量21 L/h，萃取压力
30 MPa，萃取温度 46°C，分离温度 45°C、分离压力
5.5 MPa。待各项参数达到要求时开泵，每20 min从分
离釜收集萃取物，至不再有萃取物流出为止[8]。所得
产物即为瑞香狼毒超临界CO2萃取物（SCE）。
朱砂叶螨（Tetranychus cinnabarinus）由农业部都
市农业（北方）重点开放实验室提供，为室内饲养的敏
感品系。实验室内用芸豆幼苗饲养。饲养环境为温度
（25±1）℃，相对湿度（60±10）%，光照L:D=18 h:6 h。
1.3 实验方法
1.3.1 触杀毒力测定 称取不同质量的SCE，加入100 μL
吐温80，用去离子水定容至10 mL，超声波溶解，即为待
测药液。待测药液设 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL
共 6个浓度，各浓度处理重复测定 3次。将 100 μL吐
温80用去离子水定容至10 mL作为对照。
采用玻片浸渍法并稍作改进[9]。将双面胶带粘贴
于玻片一端，揭去上面的纸片，用零号毛笔挑取个体大
小一致、颜色鲜艳的活泼雌成螨，将其背部粘在双面胶
带上，不可粘住螨足、口器及须肢，保证螨足自由活动，
每片粘30头。粘好的玻片在双目解剖镜下检查，剔除
不活动、受伤和粘的不合格的螨，将供试螨浸入待测药
液中轻轻摇动约5 s后取出，用吸水纸条小心吸去螨体
周围的多余药液。在与1.2中同等的饲养条件下培养
24 h后，在双目解剖镜下统计螨虫死亡率，用毛笔轻触
螨体，以螨足不动者为死亡。按Abbot公式计算校正
死亡率。
1.3.2 症状观察 采用叶蝶浸渍法[10]。将洗净的平展的
芸豆叶片置于水培养台上，每个叶片均挑入个体大小
一致、颜色鲜艳的活泼雌成螨 30头。待螨稳定后，夹
取叶片浸入待测药液中5 s，用吸水纸小心吸去多余药
液。叶片边缘用湿棉条围住，以防螨体逃逸。每0.5 h
观察 1次成螨的活动及反应状况，24 h记录 48次。待
测药液浓度为3 mg/mL，以去离子水加1%体积吐温80
溶液为对照。
1.3.3 酶液制备及测定 试螨采用1.3.1中的方法，用浓
度为3 mg/mL的药液处理。取处于不同中毒阶段的雌
成螨 150头，加 0.25 mL预冷生理盐水，冰浴匀浆，4℃
下10000 r/min离心15 min，上清液作为酶源待测。
乙酰胆碱酯酶、单胺氧化酶、Na +-K +-ATP酶、
Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均使用南京建成生物研究所的
测试盒进行测定，重复3次。
1.3.4 酶源蛋白含量测定 采用考马斯亮蓝G-250法[11]
测定酶源蛋白含量。
1.3.5 数据处理 试验数据采用 SPSS15.0统计分析软
件分析。酶的比活力按下式计算。
酶的比活力[U/mg]=酶活力单位/酶源蛋白含量
酶活力单位[U]=(ΔOD×V)/(e×L)
式中：ΔOD为每分钟光吸收的变化值(OD/min)；V
为酶促反应体积（mL）；e 为产物的消光系数
（1.36×10-10 L/(μmol·cm)）；L为比色杯的光程（cm）。
2 结果与分析
2.1 触杀毒力
采用玻片浸渍法测定 SCE对朱砂叶螨的触杀毒
力。结果表明，SCE对朱砂叶螨有明显的触杀毒性，其
毒力回归方程为 y=3.627x–1.386，24 h的 LC50值为
2.411 mg/mL（95%置信限2.219~2.666 mg/mL），LC90值
为5.440 mg/mL（95%置信限4.520~7.131 mg/mL）。可
见，SCE对朱砂叶螨的触杀毒性高于已报道的瑞香狼
毒提取物[2-4,7]。
2.2 致毒症状
观察发现，朱砂叶螨经 SCE处理后 30 min左右，
试螨开始表现兴奋症状，四处爬动，并急剧产卵。1 h
后大部分试螨运动减少，螨足高频颤抖，表现为强烈的
痉挛症状。2~4 h后转为轻度痉挛，螨足大动作的屈
伸。约5 h后，部分试螨体躯侧卧，螨足微颤，表现为麻
痹症状。6 h后，大部分试螨死亡，死螨表皮皱缩，体色
黯淡。对照组 0~18 h间，试螨正常取食，步态平稳；
18~24 h间，试螨正常爬动、取食，吐丝并在丝上产卵。
可见，经 SCE处理后，朱砂叶螨表现的中毒症状
与神经毒剂有相似之处，如兴奋、痉挛等。因此，针对
神经系统靶标酶进行下一步研究。
2.3 对乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的影响
乙酰胆碱酯酶（AChE）能够催化乙酰胆碱水解为
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梁 为等：瑞香狼毒超临界CO2萃取物的杀螨毒力及机理初探
胆碱和乙酸，在神经冲动传递过程中起重要作用 [5]。
测定不同中毒时期 SCE对朱砂叶螨AChE活性的影
响，结果表明：SCE对朱砂叶螨AChE有明显地抑制作
用。由表1可知，在兴奋期、痉挛期和麻痹期，AChE活
性均显著低于对照（P<0.05，下同），并且不同中毒阶段
间的AChE活性也达到显著差异。其中，AChE活性在
兴奋期降幅最大，为对照的 0.764倍；痉挛期的AChE
活性较兴奋期显著下降，为对照的0.617倍，较兴奋期
下降 19.200%；麻痹期的AChE活性较痉挛期显著下
降，为对照的0.499倍，较痉挛期下降19.142%。可见，
SCE对朱砂叶螨AChE的抑制率随中毒程度的加深而
增加。
2.4 对单胺氧化酶（MAO）活性的影响
单胺氧化酶（MAO）可使儿茶胺类神经递质失活，
造成神经传导阻断[12]。SCE对朱砂叶螨MAO活性影
响见表2。由表2可知，在兴奋期，MAO活性为对照的
0.763倍，但未达到显著差异；痉挛期的MAO活性与对
照和兴奋期相比显著下降，为对照的0.393倍，较兴奋
期下降48.474%；麻痹期的MAO活性显著低于对照和
兴奋期，分别为对照的0.482倍和兴奋期的0.633倍；麻
痹期的MAO活性较痉挛期略有上升，但未达到显著
差异，这可能是由于SCE激活了试螨体内保护酶系引
起的。总体上，SCE对朱砂叶螨的MAO活性有一定
的抑制作用。
2.5 对Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响
SCE对朱砂叶螨Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响见
表 3。由表 3可知，SCE对试螨体内Ca2+-Mg2+-ATP酶
活性有明显抑制作用。在兴奋期、痉挛期和麻痹期，
Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均显著低于对照，分别为对照的
0.416倍、0.438倍和 0.034倍。随中毒程度的加深，
Ca2+-Mg2+-ATP酶活性略有波动，但总体上为下降趋
势。其中，痉挛期的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性略有增加，
较兴奋期增加 5.315%，但未达到显著差异；此后，麻
痹期的酶活性又有所下降。但在兴奋期、痉挛期和麻
痹期三者之间，Ca2+-Mg2+-ATP酶活性不存在显著差
异。
2.6 对Na+-K+-ATP酶活性的影响
SCE对朱砂叶螨Na+-K+-ATP酶活性影响见表 4。
由表 4可知，在兴奋期、痉挛期和麻痹期，SCE对试螨
体内Na+-K+-ATP酶活性均有明显抑制作用，各阶段酶
活性分别为对照的0.709倍、0.672倍和0.555倍。随中
毒程度的加深，Na+-K+-ATP酶活性呈下降趋势。其
中，兴奋期的Na+-K+-ATP酶活性显著低于对照，为对
照活性的 0.709倍；痉挛期的Na+-K+-ATP酶活性较兴
奋期下降 5.226%，但未达到显著差异。麻痹期的
Na+-K+-ATP酶活性显著低于痉挛期，比痉挛期活性下
降17.391%。
3 结论
研究表明，SCE对乙酰胆碱酯酶、单胺氧化酶、
Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶均具有显著地抑制
效果。以上 4种酶均属于重要的神经系统标靶酶。
SCE通过抑制神经系统标靶酶的活性，导致试螨体内
神经递质的积累。因此，机体会迅速出现反应，使试螨
表现出兴奋、痉挛和麻痹等中毒症状。据此推测，SCE
对朱砂叶螨可能具有神经毒性。
中毒阶段
对照
兴奋期
痉挛期
麻痹期
酶比活力/(U/mg)
0.491±0.017 a
0.375±0.003 b
0.303±0.007 c
0.245±0.001 d
抑制率/%
—
23.490
38.270
50.065
表1 朱砂叶螨AChE活性的变化
注：表中数字以（平均值±标准误）表示，数字后相同小写字母表示
经Duncan’s新复极差检验差异不显著（P0.05水平），酶源蛋白标准曲线
y=0.004638-0.002552x（R=0.9974）。下同。
中毒阶段
对照
兴奋期
痉挛期
麻痹期
酶比活力/(U/mg)
17.609±3.924 a
13.432±0.789 a
6.921±1.199 b
8.496±0.736 b
抑制率/%
—
23.720
60.696
51.753
表2 朱砂叶螨MAO活性的变化
表3 朱砂叶螨Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的变化
中毒阶段
对照
兴奋期
痉挛期
麻痹期
酶比活力/(U/mg)
1.222±0.246 a
0.508±0.003 b
0.535±0.049 b
0.042±0.008 b
抑制率/%
—
58.398
56.194
67.090
表4 朱砂叶螨Na+-K+-ATP酶活性的变化
中毒阶段
对照
兴奋期
痉挛期
麻痹期
酶比活力/(U/mg)
1.403±0.124 a
0.995±0.019 b
0.943±0.034 b
0.779±0.026 c
抑制率/%
—
29.093
32.751
44.473
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4 讨论
大多数杀螨剂是通过干扰神经系统来发挥致死作
用。而且，中毒特征多表现为战栗、痉挛、麻痹或是其
他行为上的改变。神经细胞间的化学信息传递主要依
靠神经递质的合成与分解，如乙酰胆碱、伽马氨基丁
酸、真硝铵等。Mark等[13]已证明乙酰胆碱等神经递质
是杀螨剂的靶标。本研究中，试螨中毒症状与神经毒
剂有相似之处。因此，笔者对神经系统中 4种重要的
酶系进行测定。
研究表明，SCE对AChE的抑制率达到 50.065%，
与传统的 AChE 抑制剂相当 [14]。乙酰胆碱酯酶
（AChE）长时间地被抑制，能够引起乙酰胆碱过度积
累，造成神经突触传递阻断[12]。而且，AChE活性随中
毒程度的加深而显著下降。可以推测，AChE可能是
SCE的主要靶标。
MAO、Ca2 +-Mg2 +-ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性也
受到SCE的抑制。MAO活性下降能够导致儿茶胺类
神经递质的积累，引起试螨体内神经传导的阻断，使试
螨表现出兴奋、抽搐等症状[12]。Ca2+-Mg2+-ATP酶活性
降低，能够导致细胞内Ca2+滞留，引起各种谷氨酸盐及
其他神经递质的释放，并产生大量自由基，使细胞形成
不可逆转地功能退化 [15-16]。Na+-K+-ATP酶活性降低，
能够导致细胞内Na+离子流受抑制，细胞吸水，继而肿
胀坏死[14]。以上 3种酶能够被SCE抑制，但抑制程度
与中毒程度间没有良好的伴随关系。这可能与 SCE
激活试螨体内解毒酶系，缓解了SCE的毒性有关[5]。
可见，SCE的杀螨作用机理可能较为复杂，使朱砂
叶螨死亡的原因可能不止一种，有待进一步研究。研
究结果还有待于通过电生理试验和更为精确的酶学试
验来进一步确证。由于SCE致死机理的复杂性，可以
推测SCE引起害螨抗药性的机率较小。而且，在SCE
的制备过程不需要有机溶剂参与，对环境和人员的影
响小，具有进一步开发利用的潜力。
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