全 文 ：• 91 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2015年1月第30卷第1期 CJTCMP , January 2015, Vol . 30, No. 1
PITC柱前衍生HPLC法测定茺蔚子中游离和水解
氨基酸的含量
郭俊国，解孝锋，毕宏生
（山东中医药大学眼科研究所，山东省中西医结合眼病防治重点实验室，济南 250002）
摘要：目的：建立PITC柱前衍生HPLC法同时测定茺蔚子药材中游离和水解氨基酸含量的方法。方法：采用
超声法提取游离氨基酸，6mol/L盐酸水解茺蔚子蛋白，以PITC为柱前衍生试剂，采用HPLC法测定茺蔚子药材中氨
基酸的峰面积并计算其含量。结果：18种氨基酸的分离良好，空白无干扰，线性关系良好，精密度RSD在0.25%-
1.38%之间，重复性RSD在0.47%-1.86%之间，稳定性RSD在0.32%-1.68%之间，平均回收率在95.48%-101.48%之
间且RSD均小于5%，游离和水解氨基酸的含量分别为0.4525%、10.0293%。结论：该方法简便、快捷，能准确地
测定茺蔚子中游离和水解氨基酸的含量，为茺蔚子的质量控制提供了理论依据。
关键词：异硫氰酸苯酯；茺蔚子；高效液相色谱法；游离氨基酸；水解氨基酸
基金资助：国家自然科学基金（No.81072961，No.81001577）
Determination of free and hydrolysis amino acids in Motherwort fructus by PITC
pre-column derivation and HPLC method
GUO Jun-guo, XIE Xiao-feng, BI Hong-sheng
( Eye Institute, Shandong University of TCM, Shandong Provincial Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western
Medicine for Prevention and Therapy of Ocular Diseases, Jinan 250002, China )
Abstract: Objective: To establish a PITC pre-column derivation and HPLC-DAD method for the determination of free
and hydrolysis amino acids in Motherwort fructus. Methods: The free amino acids were extracted by ultrasonic and the protein
was hydrolyzed by 6mol/L of hydrochloric acid. Phenyl isothiocyanate (PITC) was the pre-column derivating reagent, and the
content of amino acids was determined with HPLC method. Results: Separation of 18 kinds of amino acids was good, the blank
had no interference, and the linear relationship was good. The RSD of precision was between 0.25% and 1.38%, the repeatability
was between 0.47% and 1.86%, the stability was between 0.32% and 1.68%, the sample recovery rate was between 95.48% and
101.48%, and the RSD was less than 5%. The content of free amino acid and hydrolytic amino acid was 0.4525% and 10.0293%
respectively. Conclusion: The method could be used to test the content of free amino acid and hydrolytic amino acid accurately,
simply and readily, which could provide a theoretical basis for the quality control of Motherwort fructus.
Key words: PITC; Motherwort fructus; HPLC; Free amino acid; Hydrolytic amino acid
Fund assistance: National Natural Science Foundation of China (No.81072961, No.81001577)
·论著·
通讯作者：毕宏生，山东省济南市英雄山路48号山东中医药大学眼科研究所，邮编：250002，电话：0531-58859696
E-mail：hongshengbi1@163.com
茺蔚子具有清肝明目、活血调经的功效[1]。茺蔚
子含有生物碱、脂肪酸、挥发油、氨基酸及微量元
素[2]，临床上眼科可用于肝经热盛所致的一切内外障
眼病。常与青葙子、石决明、草决明等配伍治肝热头
痛、目赤肿痛；与川芎、赤芍、桃仁配伍治眼内出血、
瘀久不散[3]。茺蔚子中富有多种氨基酸，多数为人体
必需氨基酸，氨基酸含量可作为衡量茺蔚子产品质
量的指标之一。氨基酸衍生试剂的发展，使柱前衍
生法分析氨基酸得到了广泛应用[4-6]，但用其检测茺
蔚子中游离氨基酸和水解氨基酸的研究笔者未见报
道。本实验通过PITC柱前衍生HPLC法建立了充蔚
子中游离和水解氨基酸含量测定的方法，为茺蔚子
及其相关产品中氨基酸的定量分析提供实验基础。
材料
1. 仪器 戴安U-3000液相色谱仪（UltiMate
3000 Pump, UltiMate 3000 AUtosampler, UltiMate
拼版1.indd 91 2014-12-25 16:24:05
• 92 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2015年1月第30卷第1期 CJTCMP , January 2015, Vol . 30, No. 1
3000 RS Column Compartment, UltiMate 3000 Diaode
Array Detector）；MS205DU十万分之一天平（德国梅
特勒公司）；EL204电子天平（德国梅特勒有限公
司）；FW135高速粉碎机（北京市永光明医疗器械有
限公司）；101-1Y红外烘箱（杭州蓝天化验仪器厂）。
2. 试药 茺蔚子（山东建联盛嘉中药有限公
司，批号：120901，经山东中医药大学中药鉴定教研
室周凤琴教授鉴定为唇形科植物益母草Leonurus
japonicus Houtt.的干燥成熟果实）；18种氨基酸
对照品（中国药品生物制品检定所，批号：140627-
200805）；PITC（Sigma，精确代码：101196157）；乙
腈（色谱级，美国天地试剂公司）；醋酸钠、三乙胺及
其它试剂均为分析纯。
方法与结果
1. 对照品及供试品溶液的制备
1.1 对照品溶液的制备 分别精密称取经五氧
化二磷干燥过夜的18种氨基酸对照品适量，分别置
10mL棕色容量瓶中，用0.1mol/L的盐酸定容，即得各
对照品溶液。分别精密吸取18种氨基酸各1mL置25mL
的棕色容量瓶中，用0.1mol/L的盐酸定容，即得。
1.2 游离氨基酸的制备 将茺蔚子药材在60℃
的烘箱中干燥8h，高速粉碎机粉碎，过40目药筛。精
密称取1.0g，置三角烧瓶中，加50%甲醇50mL，称定
重量，超声处理30min，用50%甲醇补足减失的重量，
滤过，即得。
1.3 水解氨基酸的制备 精密称取茺蔚子药材
粉末0.1g，置玻璃安剖中，加入5mL 6mol/L盐酸充入
氮气后烧结封口，移入烘箱中150℃加热1h，取出放
冷，3 000r/min离心10min，取3mL于水浴蒸干后加入
2mL 0.1mol/L盐酸溶解，4℃ 12 000r/min离心10min，
取上清液即得水解氨基酸。
2. PITC衍生方法
2.1 衍生试剂A 精密量取0.3mL PITC，置于25mL
棕色量瓶中，用乙腈稀释至刻度，浓度为0.1mol/L，摇
匀，4℃保存，作为PITC的乙腈溶液。
2.2 衍生试剂B 精密量取1.3mL三乙胺，置于10
mL棕色量瓶中，用乙腈稀释至刻度，浓度为0.1mol/L，
摇匀，作为三乙胺的乙腈溶液。
2 .3 衍生步骤 取空白、对照品和供试品溶
液各200μL，加入衍生试剂A 100μL，衍生试剂B
100μL，混匀，室温放置1h，加入正己烷600μL，充
分震摇混匀后，放置10min，取下层溶液，用0.45μm
滤膜滤过，备用。
3. 色谱条件与系统适用性 色谱柱：Atlantis
dC18 Column（4.6mm×150mm，3μm Waters），流
动相A为75%乙腈，流动相B为12 .6g醋酸钠加水
925mL溶解后，加入70mL乙腈，冰醋酸调节pH值
为6.5，梯度洗脱（洗脱程序为0min，0%A；5min，
4%A；15min，7%A；16min，23%A；25min，45%A；
28min，55%A；30min，100%A；35min，0%A）。流
速为0.8mL/min，检测波长为254nm，柱温30℃，进
样量5μL。衍生化后的空白、对照品和供试品溶液
的色谱图见图1。
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
A
7
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
D
1 2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
C
1
2
3 5
6 8
9
10
1112
13
14
15
16
17
18
4
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
B
1
2 3
4
5 6
7 8 9
10
11
1213
14
1516
17
18
图1 空白溶液、氨基酸对照品及茺蔚子药材HPLC谱图
注：A.空白溶液；B.18种氨基酸对照品溶液；C.茺蔚子游离氨
基酸溶液；D.茺蔚子水解氨基酸溶液；1.门冬氨酸（asp）；2.谷氨酸
（glu）；3.丝氨酸（ser）；4.甘氨酸（gal）；5.组氨酸（his）；6.精氨酸
（arg）；7.苏氨酸（thr）；8.丙氨酸（ala）；9.脯氨酸（pro）；10.酪氨酸
（tyr）；11.缬氨酸（val）；12.甲硫氨酸（met）；13.胱氨酸（cys）；14.
异亮氨酸（iso）；15.亮氨酸（leu）；16.苯丙氨酸（phe）；17.色氨酸
（trp）；18.赖氨酸（lys）。
4. 方法学考察
4.1 线性关系考察 分别精密吸取18种氨基酸
混合对照品0.5、1、2、3、4、5mL置10mL棕色容量瓶
中，用0.1mol/L的盐酸定容，衍生后测定，记录色谱
图。以质量浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制
标准曲线，得回归方程，结果见表1。
4.2. 精密度试验 取混合对照品溶液，衍生后
测定，按照确定的色谱条件，连续进样6次。记录色
谱图。计算18种氨基酸对照品的RSD值，考察其精密
度。18种氨基酸的RSD在0.25%-1.38%之间，说明仪
器性能良好。
4.3. 稳定性试验 取混合对照品溶液，衍生后
测定，于0、2、4、8、16、24h进样6次。记录色谱图。
18种氨基酸的RSD在0.32%-1.68%之间，说明供试品
溶液在24h之内稳定性良好。
4.4. 重复性试验 取茺蔚子药材粉末两组各6
份，按照确定的方法制备供试品溶液，衍生后进样分
析，考察其重复性。18种游离和水解氨基酸的RSD在
0.47%-1.86%之间，说明此方法检测茺蔚子中氨基
酸，具有很好的可重复性。
拼版1.indd 92 2014-12-25 16:24:07
• 93 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2015年1月第30卷第1期 CJTCMP , January 2015, Vol . 30, No. 1
表3 茺蔚子药材中游离和水解氨基酸的含量（n=3，%）
氨基酸 游离氨基酸 水解氨基酸 氨基酸 游离氨基酸 水解氨基酸 氨基酸 游离氨基酸 水解氨基酸
asp 0.0720 0.1576 ala 0.0240 0.0530 leu 0.0370 0.0273
glu 0.0401 0.0063 pro 0.0150 0.0265 phe 0.0255 0.0162
ser 0.0128 0.0337 tyr 0.0275 0.0352 trp 0.0108 0.0388
gal 0.0092 0.0257 val 0.0138 0.0449 lys 0.0212 0.1007
his 0.0397 0.0784 met 0.0105 0.0400
arg 0.0568 4.3154 cys 0.0177 1.9898 总计 0.4525 10.0293
thr - 3.0180 iso 0.0187 0.0218
表2。18种氨基酸的加样回收率试验RSD均小于5%，
平均回收率在95.48%-101.48%之间，表明本方法对
样品的定量分析结果准确度高。
5. 含量测定 取茺蔚子药材粉末两组各3份，一
组精密称取1.0g，制备茺蔚子游离氨基酸溶液。另一
组精密称取0.1g，制备茺蔚子水解氨基酸溶液。分别
取200μL，衍生后进样分析。茺蔚子药材中游离和水
解18种氨基酸的含量见表3。
讨论
氨基酸HPLC分析常用的衍生化试剂主要有
PITC、2,4-二硝基氟苯、邻苯二甲醛、氨基苯甲酯
类、萘二甲醛等[7]。因PITC柱前衍生常规UV检测器
可检测，文章采用PITC柱前衍生法测定茺蔚子中氨
基酸的含量。对衍生试剂A、衍生试剂B的用量、衍生
时间及正己烷的用量等试验条件进行了优化，当衍
生试剂A和B的用量为100μL，衍生时间60min时，衍
生完全且副产物少，产物稳定、单一。本实验还考查
了Acclaim 120A C18色谱柱、Acclaim 120A C18色谱柱
（DIONEX）和Atlantis dC18 Column（Waters）等色谱
柱，发现Atlantis dC18 Column上18种氨基酸的分离度
和峰型较好，且分析时间较短。
本实验对茺蔚子药材中的游离氨基酸和水解氨
基酸的含量进行了测定，结果发现茺蔚子水解氨基
酸中含有人体必需的18种氨基酸，氨基酸的总含量
氨基酸 平均回收率 RSD 氨基酸 平均回收率 RSD 氨基酸 平均回收率 RSD
asp 96.43 3.38 thr 98.04 3.72 cys 98.99 3.04
glu 95.48 4.29 ala 99.13 2.91 iso 101.48 2.59
ser 98.82 3.65 pro 100.32 2.53 leu 100.30 2.82
gal 97.55 2.87 tyr 97.87 3.07 phe 99.49 2.38
his 96.89 3.78 val 99.35 1.98 trp 96.26 2.55
arg 95.98 4.03 met 97.67 2.69 lys 97.89 2.94
表2 加样回收率试验结果（n=6，%）
表1 18种氨基酸的线性方程、线性范围和相关系数
氨基酸 线性方程 线性范围（mg/mL） 相关系数
asp y=70.93x-0.141 0.01146-0.1146 0.9997
glu y=61.45x-0.117 0.01249-0.1249 0.9998
ser y=130.6x+0.114 0.01210-0.1210 0.9999
gal y=160.19x-0.099 0.01555-0.1555 0.9999
his y=77.22x+0.094 0.01395-0.1395 0.9999
arg y=71.40x-0.246 0.01013-0.1013 0.9997
thr y=107.3x-1.037 0.01876-0.1876 0.9998
ala y=125.3x-0.106 0.01164-0.1164 0.9999
pro y=99.79x+0.176 0.01332-0.1332 0.9998
tyr y=61.77x+0.008 0.01136-0.1136 1.0000
val y=150.27x+0.013 0.00861-0.0861 1.0000
met y=75.51x-0.002 0.00931-0.0931 1.0000
cys y=58.58x-0.001 0.01414-0.1414 0.9999
iso y=90.48x+0.014 0.01320-0.1320 1.0000
leu y=88.845x+0.003 0.01081-0.1081 1.0000
phe y=105.1x-0.236 0.01059-0.1059 0.9999
trp y=70.55x-0.072 0.01146-0.1146 0.9999
lys y=122.82x+0.027 0.01349-0.1349 1.0000
4.5. 加样回收率试验 精密吸取水解氨基酸6份
各100μL，分别准确加入100μL的氨基酸对照品溶
液，衍生后测定氨基酸的含量，计算回收率，结果见
拼版1.indd 93 2014-12-25 16:24:08
• 94 • 中华中医药杂志(原中国医药学报)2015年1月第30卷第1期 CJTCMP , January 2015, Vol . 30, No. 1
为10.0293%。茺蔚子游离氨基酸中含有门冬氨酸等
17种氨基酸，其含量为0.4525%，相比起水解氨基酸
缺少苏氨酸。文章采用PITC柱前衍生法测定茺蔚子
中的氨基酸，说明茺蔚子中含有大量的氨基酸，不仅
为茺蔚子药材的质量控制提供了依据，同时也为含
大量氨基酸的中药材质量控制提出一种新方法。该
方法精密度高、重复性好、回收率良好、结果准确可
靠，能用于茺蔚子药材及其相关产品中氨基酸的含
量测定。
参 考 文 献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:中国医
药科技出版社,2010:225
[2] 张莲珠,王会弟.茺蔚子研究进展.长春中医药大学学报,2012,
28(5):920-921
[3] 吴嘉瑞,张冰.国医大师颜正华教授辨治月经病经验探析.
中华中医药杂志,2012,27(9):2329-2331
[4] 陈晨,赵晓辉,文怀秀,等.HPLC测定不同海拔小叶金露梅17种
氨基酸含量.氨基酸与生物资源,2011,33(1):71-74
[5] 陈再洁,殷金龙,李坤,等.柱前衍生RP-HPLC法测定人参中17
种氨基酸的含量.中国药房,2012,23(35):3334-3337
[6] 刘丽敏,王海敏,虞海霞,等.柱前衍生反相高效液相色谱法测
定西洋参中游离氨基酸.中成药,2009,31(2):275-278
[7] 于泓,牟世芬.氨基酸分析方法的研究进展.分析化学,2005,
33(3):398-404
（收稿日期：2013年7月22日）
岭南地区外感热病发病特点及历代名医治疗经验
杨宇，杨海韵，李磊
（广州中医药大学附属佛山市中医院，广州 528000）
摘要：岭南地处南端，一向远离中原，在医学上虽源于中原，但由于其独特地理气候环境，形成了其特殊
的一面，构造了独特的岭南医学流派。中医尤其善于个性化治疗，因地制宜、因人制宜、因时制宜是其的治疗特
色。外感热病是中医临床的常见病、多发病，具有起病急骤，病因复杂，传变迅速的特点。笔者阅读了大量的岭
南历代医家的医案，就此对岭南区外感热病的发病特点及历代名医的治疗经验略微总结，以期望对外感热病的治
疗提供理论参考。
关键词：岭南医学；外感热病；历代名医；名家经验
Clinical characteristics of exogenous febrile disease in Lingnan area and the clinical
experience from the successive dynasties famous doctors
YANG Yu, YANG Hai-yun, LI Lei
( Foshan Hospital of TCM Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 528000, China )
Abstract: Away from the central of China, and located in the south of China, Lingnan developed into a unique medical
school because of its special geographical and climate conditions. As an individualized service medicine, the features of TCM
concentrated on the ‘treatment in accordance with local conditions’, ‘treatment in accordance with individuals’ and ‘treatment in
accordance with seasonal conditions’. As a common and high frequency disease, exogenous febrile disease had the characteristics
of urgent onset, complicated causes and rapid progress of the disease. The clinical characteristic of exogenous febrile disease in
Lingnan area and the clinical experience from the successive dynasties famous doctors were summarized after consulting lots of
medical records, to provide a theoretical reference for the treatment of exogenous febrile disease in the coming days.
Key words: Lingnan medicine; Exogenous febrile disease; Successive dynasties famous doctors; Clinic experience of
famous doctors
·论著·
通讯作者：杨宇，广东省佛山市亲仁路6号广州中医药大学附属佛山市中医院，邮编：528000，电话：0757-83068421
E-mail：55214702@qq.com
拼版1.indd 94 2014-12-25 16:24:08