全 文 ：安徽农业大学学报 , 2000, 27 ( 4): 340～ 344
Journal of Anhui Ag ricultural Univ e rsity
瑞香狼毒杀虫活性成分的提取与分离 (Ⅰ )⒇
张国洲 1 , 王亚维 2 , 徐汉虹 1 , 吴恭谦 3 , 赵善欢 1
( 1. 华南农业大学资源环境学院 , 广州 510642; 2. 湖北农学院资源环境系 ; 2. 安徽农业大学植保系 )
摘　要: 以菜粉蝶 (Pieris rapae L. ) 5龄幼虫为试虫 , 进行生物活性跟踪。采用浸提、 萃取、 层析等多种
方法 ,从瑞香狼毒 ( Stellera chamae jasme L. )根中分离出 3种活性成分单体。通过物质结构的四大谱 ( IR, UV ,
NM R, M S) 鉴定 , 它们分别为伞形花内酯、 瑞香亭和狼毒色原酮。
关键词: 瑞香狼毒 ; 菜粉蝶 ; 伞形花内酯 ; 瑞香亭 ; 狼毒色原酮
　　中图分类号: S482. 39 文献标识码: A 文章编号: 1000-2197 ( 2000) 04-0340-05
瑞香狼毒广泛分布于我国高山和亚高山草地 , 是青藏高原上重要的杀虫植物。 它的根乙醇提取物
(简称 SCEE) 对菜粉蝶幼虫有很强的生物活性。如能将之开发为一种新型的植物性杀虫剂 , 对充分利用
该植物资源具有重要意义。 为此 , 笔者对其中的活性成分进行提取、 分离、 纯化以及结构鉴定 , 有利于
将之开发为一种新型的植物性杀虫剂 , 充分利用该植物资源 , 为农业生产服务 , 同时为杀虫剂的仿生合
成提供结构模板。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　供试物质　瑞香狼毒采自青藏高原的青海省西宁市郊区 (海拔 3000～ 4000 m )。将采集的植物洗
净、 阴干 , 然后将其根、 根木质部、 韧皮部、 茎、 叶分别放入恒温箱中烘干 ( 40～ 45℃ )至材料发脆 , 再
分别磨碎过 150μm筛 , 装入塑料袋密封贮于冰箱中备用。
95%印楝素: 由华南农业大学昆虫毒理室提供。
1. 1. 2　供试昆虫　菜粉蝶在养虫室内用甘蓝 (B rassica oleracea L. )叶饲养 , 温度 ( 25± 1)℃ , 相对湿度
( 85± 10)% , 每日光照 12 h。
1. 1. 3　供试仪器　 LI-1000叶面积测定仪: 美国 Lincoin公司制造 ; RFX-65A型红外光谱仪: 美国
Analect公司制造 ; DU-600型紫外扫描仪: 美国杜邦公司制造 ; DRX-400型核磁共振仪: 德国 Bruker公
司制造 ; ZAB-HS型质谱仪: 英国 VG公司制造。
1. 2　方法
1. 2. 1　冷浸法　将一定量的植物干粉 2000 g装入大型广口瓶中 ,加入 5倍量的乙醇 10 L, 浸提 3～ 5 d,
过滤 , 滤液减压浓缩后 , 再加入 5倍量的乙醇浸提 3～ 5 d, 过滤 , 滤液减压浓缩 , 如此 3次 , 合并 3次
的提取物浓缩物 , 即得到瑞香狼毒根乙醇提取物 (简称 SCEE)。
1. 2. 2　萃取法　称取 SCEE 20 g , 加 10倍量蒸馏水 200 ml, 热溶 , 装入分液漏斗中 , 采用液-液分配 ,
依次用石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇各萃取 3～ 5次 ( 100 m l /次 ) , 最后分别将这些萃取液和水萃取
液减压浓缩至稠膏 , 重复 3次 , 并计算出萃取率。 具体过程见图 1。
1. 2. 3　层析法　根据每次分离样品的量选用不同口径的玻璃管柱 , 填充硅胶 H作固定相 ,干装柱 , 上湿
样。洗脱剂为石油醚+ 氯仿+ 甲醇配成一系列极性逐渐增强的组分 , 洗脱溶剂流速为 3～ 4滴 /s , 每流分
⒇ 收稿日期: 2000-05-16
基金项目: 国家自然科学基金资助课题 ( 39300087)。
作者简介: 张国洲 ( 1963- ) , 男 , 博士 , 副教授。 现在湖北农学院资源环境系工作。
DOI : 10. 13610 /j . cnki . 1672 -352x . 2000. 04. 007
收集 50～ 100 ml, 经薄层层析检验后将成分相同者合并。薄层层析所用薄板用硅胶 GF254铺成。使用前活
化 ( 120℃ , 2 h)。样品在薄板上展开后 , 喷以 10%的 H2 SO4乙醇溶液 , 烘烤至显色 , 做好标记。
取氯仿提取物 4. 0 g , 用少量氯仿溶解 , 与 20 g硅胶混匀 , 室温下挥发除尽溶剂 , 加于硅胶柱 ( 500
g ) 上 , 用石油醚 -氯仿 (体积比为 1∶ 1)、 氯仿、 氯仿 -甲醇 (体积比为 49∶ 1至 9∶ 1) 梯度洗脱 , 得到
24个流分。第 1、 2流分为石油醚 -氯仿 (体积比为 1∶ 1) 洗脱物 , 第 3～ 7流分为氯仿洗脱物 , 第 8～ 10
流分为氯仿 -甲醇 (体积比为 49∶ 1)洗脱物 , 第 11～ 15流分为氯仿 -甲醇 (体积比 95∶ 5)洗脱物 , 第 16
～ 24流分为氯仿-甲醇 (体积比为 9∶ 1) 洗脱物。根据薄板层析结果 , 将它们合并成 14个流分。将流分
-3、 流分 -5、 流分-11分别上小柱 , 干装柱 , 上湿样 , 用氯仿洗脱 , 洗脱溶液为 2滴 /s , 每号收集流分 50
～ 100 ml , 经薄层层析检验后合并 , 确定活性高的流分 , 浓缩后即可得高纯度的单体化合物。
图 1　 SCEE液 -液分配法分离程序
Figur e 1　 Process o f SCEE in liquid ex t raction
1. 2. 4　生物活性测定方法　参照吴文君 [ 1]的方法 ,将新鲜甘蓝叶片用圆形打孔器 (直径 2 cm )打成叶碟 ,
放入到供试样品的丙酮稀释液 (氯仿萃取物的质量浓度为 500μg /ml; 氯仿萃取物各流分的质量浓度为
300μg /m l; 伞形花内酯等 3种活性成分的质量浓度为 500μg /ml; 印楝素的质量浓度为 80μg /m l) 中浸
3 s, 让丙酮挥发干。然后放入直径为 9 cm的培养皿中 (内垫滤纸 , 加蒸馏水保湿 )。拒食作用试验时摆
入数片处理叶碟 , 另设对照。每皿放入饥饿了 4 h的 5龄幼虫 1头 , 以 10头为一组 , 重复 3次。 24、 48
h后选出 10头用于叶面积测定仪测定剩余叶面积 ,据此计算幼虫取食叶面积和拒食率。2 d后换新鲜叶片
继续饲养 , 7 d后调查结果。
拒食率 (% ) = 对照组取食叶面积 — 处理组取食叶面积对照组取食叶面积 × 100
1. 2. 5　物质结构鉴定方法　红外光谱 ( IR)法: 将样品与 KBr混合压片 , 测定范围为 410. 12～ 3600. 00
cm
- 1 , 检出限为 85. 00 cm- 1 , 精度为± 2. 0000 cm- 1。
紫外光谱 ( UV ) 法: 所测样品均用氯仿溶解 , 扫描波长为 200～ 400nm。
核磁共振谱 ( NMR)法: 以四甲基硅烷 ( TM S)为内标准 , 测定其 1H-核磁共振谱、 13 C-核磁共振谱、
DEPT谱和二维核磁共振谱中各质子共振频率的化学位移 , 13 C-核磁共振化学位移范围为 0～ 250μg /m l,
精度为± 0. 2μg /ml。
质谱 ( M S) 法: 采用快原子 ( FAB-M S) 轰击法。
2　结果与分析
2. 1　液 -液分配法对 SCEE初步分离效果
液 -液分配法对 SCEE初步分离效果见表 1。从表 1中可以看出 , 就萃取物状态而言 , 除氯仿萃取物
是固体外 , 其余均为浸膏。 就萃取效果而言 , 正丁醇的萃取效果最好 , 乙酸乙酯次之 , 石油醚更低 , 氯
34127卷 4期 张国洲等　瑞香狼毒杀虫活性成分的提取与分离 (Ⅰ )
仿最低。
表 1　液 -液分配法对 SCEE初步分离效果
Table 1　 Sepa ration effection o f SCEE in liquid ex traction method
溶剂 萃取物状态 萃取物重 ( g ) 萃取率 (% ) 溶剂 萃取物状态 萃取物重 ( g) 萃取率 (% )
石油醚 浸膏 2. 444 12. 22d 正丁醇 浸膏 7. 799 38. 96a
氯仿 固体 0. 552 2. 76e 水 浸膏 3. 953 19. 77c
乙酸乙酯 浸膏 5. 053 25. 28b
　　注: 表中同列数据后字母相同者表示经 DM RT法检测差异不显著 ( 5%水平 ) , 以下同。
2. 2　 SCEE不同溶剂提取物对菜粉蝶 5龄幼虫的生物活性测定结果
试验中 , 以 24 h与 48 h后幼虫的拒食率和 7 d后的校正死亡率作为生物活性指标 ,来评价各物质对
菜粉蝶 5龄幼虫生物活性的强弱。 SCEE的几种溶剂萃取物对菜粉蝶幼虫的生物活性见表 2。从表 2中可
以看出 , 氯仿萃取物的生物活性最强 , 石油醚萃取物其次 , 乙酸乙酯萃取物更弱 , 正丁醇萃取物和水萃
取物对幼虫几乎无活性。
表 2　 SCEE几种溶剂萃取物对 5龄菜粉蝶幼虫的生物活性
Table 2　 Bioactiv ities of ex tr action o f SCEE to the fifth-instar la rva e of Pieris rapae
处理 拒食率 (% )
24 h 48 h
7 d校正死亡率
(% )
处理 拒食率 (% )
24 h 48 h
7 d校正死亡率
(% )
石油醚萃取物 89. 53a 85. 02a 58. 62b 正丁醇萃取物 - 12. 84e 7. 64d 3. 46d
氯仿萃取物 93. 58a 91. 63a 82. 76a 水萃取物 8. 45d 14. 85cd 0d
乙酸乙酯萃取物 22. 97c 27. 81c 31. 03c 印楝素 56. 59b 77. 93b 96. 59a
2. 3　 SCEE氯仿萃取物各流分对菜粉蝶 5龄幼虫的生物活性测定结果
SCEE氯仿萃取物各流分对菜粉蝶 5龄幼虫的生物活性测定结果见表 3。从表 3中可以看出 , 流分 7
与流分 8的活性最强 , 流分 -1、 流分 -3、 流分-4、 流分 -5和流分-11的活性次之。
表 3　 SCEE氯仿萃取物各流分对菜粉蝶 5龄幼虫的生物活性
Table 3　 Bioactivities o f frac tions of chlor ofo rm par t of SCEE to the fifth-insta r larv ae o f Pieris rapae
流分号 取食面积 ( cm
2 /头 )
24 h 48 h
拒食率 (% )
24 h 48 h
7 d校正死亡率
(% )
1 2. 09g 4. 44g 78. 50 73. 03 85. 71ab
3 0. 27j 1. 57j 97. 32 90. 46 96. 43ab
4 1. 60h 2. 53i 83. 54 84. 63 89. 29ab
5 0. 51i 0. 92j 94. 75 94. 41 92. 85ab
6 2. 34f 5. 29f 75. 92 67. 86 60. 71c
7 0. 33ij 0. 96j 96. 60 94. 10 100. 00a
8 0. 36ij 1. 16j 96. 30 92. 95 100. 00a
9 4. 63c 9. 49b 52. 37 42. 35 50. 00cd
10 3. 17e 5. 27f 67. 39 67. 98 46. 43cd
11 1. 61h 3. 26h 83. 44 80. 19 82. 14b
12 3. 56d 7. 13d 63. 37 56. 68 57. 14cd
13 3. 07e 5. 74ef 68. 42 56. 13 57. 14cd
14 4. 66c 6. 14e 52. 06 62. 70 42. 86cd
16 5. 44b 8. 83c 44. 03 46. 36 50. 00cd
CK 9. 72a 16. 46a 0 0 0
2. 4　结构鉴定结果
流分-1、 流分 -4、 流分 -7、 流分 -8的样品量少 , 无法进一步分离。由流分-3获得无色粒状晶体 -1, 由
流分-5获得无色粒状晶体 -2, 由流分 -11分离得淡黄色晶体 -3。
晶体 -1: 于甲醇或氯仿溶液中呈强烈荧光。 FAB-M S的 m /z: 162 ( 100% ) [M+ ] , 134 ( 95% ) [M-
CO ] , 105, 78, 63, 51; M S /DS对照与伞形花内酯的 MS一致。 1 H-NMR ( 400MHz) ( COCl3 )的δ: 6. 3
( 1H, d, 12Hz, H-4) , 7. 34 ( 1H, d, 10Hz, H-5) , 6. 68 ( 1 H, d, 10Hz, H-6) , 6. 68 ( 1H, S, H-8) ,
342 安 徽 农 业 大 学 学 报 2000年
6. 23 (
1
H, d, 12Hz, H-3) ; UV的λmax为 243 nm和 323 nm , 因此 , 鉴定为伞形花内酯。
晶体 -2: 微溶于甲醇或丙酮或氯仿 , 并在紫外光下呈强烈荧光。 IR的 Vmax /cm- 1: 3 440 ( h )
( O H) ; 2 922, 2 852 ( CH) , 1 705 ( S) (νc= 0) ; 1 612 ( S) , 1 512 (芳基 C-H) , 1 279 ( S) , 1 236, 1251,
1 130 ( C-O)。 UV的 λmax为 343 nm。
FAB-M S的 m /z: 352 ( 10% ) ( M+ ) , 307, 219, 177, 154 ( 100% ) , 136 ( 84% ) , 107 ( 40% ) , 89
( 38% ) , 77, 55 ( 68% )。
1
H-NM R ( 400M Hz, DM SO-d6 , TM S内标 ) δ: 8. 04 ( 1H, d, 8Hz, H-4) ; 7. 87 ( 1H, S, H-4 ) ;
7. 70 ( 1H, d, 8Hz, H-6) ; 7. 21 (
1
H, S, H-8) ; 7. 19 (
1
H, d, 4Hz, H-5 ) ; 7. 11 (
1
H, dd, 8, 4Hz,
H-5) ; 6. 86 (
1
H, S, H-8 ) ; 6. 37 (
1
H, d, 8Hz, H-3) ; 3. 80 ( 3H, S, O CH3 )。
13
C-NMR (宽带去偶谱+ DEPT谱 ) 显示:
10个季碳: 160. 0, 159. 6, 156. 9, 155. 0, 150. 3, 147. 4, 145. 6, 135. 7, 114. 4, 110. 2;
8个次甲基 ( CH): 144. 0, 130. 9, 129. 9, 113. 8, 113. 4, 109. 3, 103. 9, 102. 7;
1个甲氧基: 56. 0。
经过对 FAB-M S和 NMR的详细解析 , 晶体-2的结构确定为瑞香亭 ( daphno ri tin)。
晶体-3: 13 C-NM R显示:
15个季碳 (均为 sp2杂化碳 ): 202. 9, 179. 9, 164. 9, 164. 1, 164. 0 (× 2) , 161. 5, 157. 0, 155. 3
(× 2) , 134. 3, 133. 3, 120. 4, 104. 3, 103. 6。
15个 CH ( 2个为 sp3杂化碳 ): 156. 0, 129. 4 (× 2) , 128. 5 (× 2) , 114. 9 (× 2) , 114. 6 (× 2) , 98. 9,
94. 7 (× 2) , 93. 5, 52. 6, 46. 9。
UV的λmax为 255 nm。无 CH2与 CH3信号。
经过对 MS、 UV、 IR、 NM R的详细解析 , 该化合物鉴定为狼毒色原酮 ( chamaech romone)。
2. 5　伞形花内酯等化合物对 5龄菜粉蝶幼虫的生物活性测定结果
伞形花内酯等化合物对 5龄菜粉蝶幼虫的生物活性测定结果见表 4。从表 4中可以看出 , 3种化合物
对幼虫都有较强的生物活性 , 这说明分离出来的 3种化合物是本试验跟踪的活性成分。
表 4　伞形花内酯等化合物对 5龄菜粉蝶幼虫的生物活性
Table 4　 Bioac tivities o f 7-hydro-coumarin et al to the fifth -instar la rva e o f Pieris rapae
化合物 取食面积 ( cm
2 /头 )
24 h 48 h
拒食率 (% )
24 h 48 h
7 d校正死亡率
(% )
伞形花内酯 1. 00e 2. 56d 83. 79 82. 02 79. 31 ab
瑞香亭 1. 22e 2. 58d 80. 45 81. 88 75. 87 ab
狼毒色原酮 1. 87c 3. 80c 70. 03 73. 32 65. 52 b
印楝素 1. 56d 1. 82e 75. 00 87. 22 89. 66 a
CK 6. 24a 14. 24a 0 0 0
3　讨论
植物中的化学成分有数十种乃至数百种化合物 , 但其中的杀虫活性成分可能只有一种或几种。 为了
从中获得有效成分 ,液 -液分配萃取法是一种重要的方法 , 特别适合样品分离的 “预处理” , 它在天然产物
分离工作中已被广泛采用 , 如 Morgan等 [2 ]从沙漠蝗 ( Schistocerca gregaria )中提取分离蜕皮激素 ,
Galbrai th等 [3 ]从植物中提取蜕皮激素也是多次采用此法。
由于 SCEE中含有丰富的蛋白质、 脂肪酸、 皂素、 多糖等表面活性物质 , 在对其用石油醚、 氯仿、乙
酸乙酯分配萃取操作中遇到了两相溶剂的乳化问题 , 即萃取液分为 3层 , 其中一层为乳化层。 为了提高
其准确性 , 引入了 “非石油醚萃取液”、 “非氯仿萃取液” 与 “非乙酸乙酯萃取液” 概念。
从瑞香狼毒中分离出来的 3种化合物其纯度越高 , 生物活性越低。 这充分说明这些活性物质之间的
关系是十分复杂的 ,仅靠其中的一种有效成分的含量 ,往往并不能准确地反映出其粗提物的活性大小。目
前所分离的化合物 , 多是容易分离、 含量较为丰富的化合物 , 还要对那些含量较少、 常规方法难以分离
的化合物做进一步分离。
34327卷 4期 张国洲等　瑞香狼毒杀虫活性成分的提取与分离 (Ⅰ )
参考文献:
[ 1] 　吴文君 . 化学保护实验技术导论 [M ] . 西安: 陕西科技出版社 , 1988
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[ 3 ]　 Galbraith M N , Ho rn D H S. Insect moulting ho rmone Crust ecdy sone f rom Podocar pus elatus [ J] . Ch em, 22: 1045
Isolation and Identification o f Ex t raction of Stellera chamaejasme (Ⅰ )
ZHANG Guo-zhou1 , W ANG Ya-wei2 , X IU Han-hong1 , WU Gong-qian3 , CHIU Shin-fo on
1
( 1. Colleg e of Resources and Environment, South China Ag ricultura l Univ er sity , Guang zhou 510642;
2. Depar tment of Resources and Env ironment , Hubei Ag ricultur al Co lleg e;
3. Depar tment of Plant Pro tection, Anhui Ag ricultura l Univ ersity)
Abstract: 3 kinds of active ing redients f rom Stellera chamae jasme were iso lated by dip, ex traction
and chromatog raply, and th eir molecular st ructure w ere identi fied to be 7-hydro-coumarin, daphno ri tin
and chamaechromone respectiv ely. The ex t raction against the fi f th instar larvae o f Pieris rapae was
investigated.
Key words: Stel lera chamaejasme; Pieris ra pae ; 7-hydro-coumarin; daph no ri tin; chamaechromone
344 安 徽 农 业 大 学 学 报 2000年