全 文 ：※分析检测 食品科学 2013, Vol.34, No.14 263
利用HPLC-MS/MS测定三叶委陵菜中的
黄酮类化合物
李 荣，周 媛，杨立琛，姜子涛*
(天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134)
摘 要：利用75%乙醇作为溶剂，采用微波辅助法提取三叶委陵菜黄酮，黄酮样品经D101树脂纯化，采用高效液相
色谱分离、串联四极杆质谱负离子方式检测分析。根据相对分子质量、二级质谱碎片、液相色谱保留时间等信息，
从三叶委陵菜中测定出了二苯乙烯苷、槲皮素-3,7-芸香糖鼠李糖苷、牡荆素、芦丁、金丝桃苷、橙皮苷、槲皮苷和
山奈酚-3-芸香糖苷8种黄酮类成分。
关键词：三叶委陵菜；液相色谱-质谱/质谱联用；黄酮；橙皮苷；金丝桃苷
Determination of Flavonoids from Potentilla freyninan by HPLC-MS/MS
LI Rong，ZHOU Yuan，YANG Li-chen，JIANG Zi-tao*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,
Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)
Abstract：Total flavonoids were obtained from Potentilla freyninan by microwave-assisted extraction method using 75%
ethanol as the extraction solvent and purified with D101 macroporous resin. The purified total flavonoids were analyzed
by high performance liquid chromatography tandem quadrupole mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in the negative ion
monitoring mode. Based on relative molecular weight, MS2 fragmentation pattern, and retention time in liquid chromatography,
eight flavonoids in P. freyninan were identified, including 2,3,5,4’-tetrahydroxystilbane-2-O-β-D-glucoside, quercetin-3,7-
rutinosogalactoside, apigenin-8-C-glucoside, rutin, hyperoside, hesperidin, quercitrin, and kaempferol-3-rutinoside.
Key words：Potentilla freyninan；HPLC-MS/MS；flavonoids；hesperidin；hyperoside
中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)14-0263-04
doi:10.7506/spkx1002-6630-201314054
收稿日期：2012-06-24
基金项目：天津市高校科技发展基金计划项目(20110608)；天津市自然科学基金重点项目(120029)
作者简介：李荣(1962—)，女，教授，学士，研究方向为食品及添加剂分析。E-mail：lirong@tjcu.edu.cn
*通信作者：姜子涛(1956—)，男，教授，博士，研究方向为食品分析、食品资源开发。E-mail：ztjiang@tjcu.edu.cn
黄酮具有抑制脂质过氧化、杀菌、抗病毒、抗衰老
和调节免疫力等功效[1-7]，已成为目前倍受关注的天然活
性产物之一，从可食性植物资源中筛选出抗氧化性强的
天然抗氧化物质也是人们关注的焦点，黄酮类化合物作
为优良的抗氧化剂已广泛地应用于食品和保健品中[8]。
三叶委陵菜(Potentilla freyninan)为蔷薇科委陵菜属植
物，俗称三叶翻白草、地蜂子、铁秤砣，主要分布于华
东、华中、西南地区的山坡草地，具有清热解毒、散瘀止
痛等功效[9]。三叶委陵菜中含有β-谷甾醇和儿茶素等活性
物质[10-12]，关于其黄酮类物质的生物活性已有少量研究，
但迄今为止尚未见该植物黄酮类成分方面的报道。许正刚
等[13]采用有机溶剂浸提法发现三叶委陵菜中含有黄酮类化
合物，本课题组采用微波辅助法提取了三叶委陵菜黄酮，
探讨了利用大孔树脂纯化三叶委陵菜黄酮的条件，并对纯
化过的三叶委陵菜黄酮进行了体外抗氧化性能和清除自由
基的能力的研究[14-16]。为充分利用三叶委陵菜这一天然资
源，不仅要有效地提取其活性物质，还需要了解其化学成
分，本研究利用75%乙醇作溶剂的微波辅助法从三叶委陵
菜中提取了黄酮，再经过D101大孔树脂进行纯化，将得
到的三叶委陵菜黄酮利用高效液相色谱-质谱-质谱联用技
术(liquid chromatography tandem quadrupole multigrade mass
spectrometries，HPLC-MS/MS)进行成分分析，以期为三
叶委陵菜的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
三叶委陵菜，产地河北，2011年9月购于毫州市真源
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堂药业有限公司，干燥后粉碎过40目筛备用。
D101大孔树脂 南开大学化工厂；二苯乙烯苷、牡
荆素、芦丁、金丝桃苷、橙皮苷、紫云英苷标准品 上
海顺勃有限公司；甲醇(色谱纯) 德国Mallinckrodt
Baker公司；甲酸(色谱纯) 美国Columbus Chemical
Industries公司；其他试剂均为分析纯。
1100 Series高效液相色谱(含G1322A在线脱气机、
G1312B二元泵、G1316B柱温箱、G1315DAD紫外检测
器、G1367D自动进样器)、G6410A LC-MSD QQQ液相
色谱-质谱/质谱联机 美国Agilent公司；MAS-Ⅰ型微
波快速制样系统 上海新仪微波化学科技有限公司；
BP211D型电子天平 德国Satorius集团；ZH-2型涡流
混合器 天津大学无线电厂；RE52-86A型旋转蒸发仪
上海亚荣生化仪器厂；LGJ-10冷冻干燥机 北京松源华
兴科技发展有限公司；ZK-82A型真空干燥箱 上海市
实验仪器厂；KQ2200B型超声波清洗机 昆山市超声仪
器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 样品液的制备
称取20.0g干燥的三叶委陵菜粉末，放入微波快速
制样系统的圆底烧瓶中，按1:25的料液比加入75%乙
醇溶液，在微波功率400W、70℃的条件下，微波萃取
5min。提取液过滤，滤液经石油醚萃取3次，去掉石油
醚层，然后减压旋转薄膜蒸发至粗提液中无乙醇，残留
物冷冻干燥，得到三叶委陵菜粗黄酮的干燥粉末1.03g[7]。
称取干燥的粉末0.5g，配制成质量浓度2.0mg/mL的上样
液，加入到预处理好的D101树脂柱上进行动态吸附，再
用50%的乙醇溶液洗脱，洗脱速率为0.5mL/min，将纯化
液旋转蒸发并冷冻干燥，制得纯化后的三叶委陵菜黄酮
粉末[15]。
用30%甲醇溶液将纯化后的三叶委陵菜黄酮粉末配
制为0.1mg/mL的样品液，用0.22μm有机微孔膜过滤后，
供HPLC-MS/MS分析用。
1.2.2 标准品的配制
准确称取二苯乙烯苷、牡荆素、芦丁、金丝桃苷、
橙皮苷和紫云英苷标准品各0.0100g，用50mL甲醇完全溶
解后，得到每一种标准品质量浓度均为200μg/mL的标准
品储备液。然后用50%的甲醇将储备液稀释成10μg/mL标
准品溶液，用0.22μm有机微孔膜过滤后备用。
1.2.3 HPLC-MS/MS分析
色 谱 条 件 ： Z O R B A X S B - C 1 8色 谱 柱
(4.6mm×250mm，5μm)，柱温30℃，流动相为甲醇-水
体系(含0.1%甲酸)，采用梯度洗脱的方式。梯度条件
为0～10min，甲醇-水(50:50，V/V)匀速梯度至甲醇-水
(72:28，V/V)，10～21min，甲醇-水(72:28，V/V)，流速
0.3mL/min，进样体积为2μL。
质谱条件：电喷雾(electrospray ionization，ESI)负
离子源，喷雾电压4000V，雾化气体为N2，雾化气压力
35psi，雾化气流速10L/min，离子源温度350℃，碰撞气
体为高纯氮气，碰撞气压力0.15MPa。
2 结果与分析
2.1 样品与标准品的总离子流图
将处理好的三叶委陵菜黄酮样品液和标准品溶液，按
照上述的色谱和质谱条件进行HPLC-MS/MS分析，扫描后
得到总离子流图(图1)。图1显示，三叶委陵菜黄酮样品液
中的1、3、4、5、6和7号黄酮(m/z分别为405、431、609、
463、609和447)与黄酮标准品的m/z及保留时间一致，因此
可初步判断三叶委陵菜黄酮样品中这6种物质分别为二苯
乙烯苷、牡荆素、芦丁、金丝桃苷、橙皮苷和槲皮苷。
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
2
8
7
6
5
4
3
1
b
a
ֱ⬭ᯊ䯈/min
图 1 三叶委陵菜黄酮(a)和黄酮标准品(b)的总离子流图
Fig.1 Total ion chromatograms of flavonoids from Potentilla freyninan (a)
and standards (b)
2.2 黄酮类化合物的质谱鉴定
鉴于三叶委陵菜中黄酮类化合物对质谱的负离子检
表 1 三叶委陵菜中黄酮类化合物的分析结果及与标准品的比较
Table 1 Mass spectral data of flavonoids obtained from P. freyninan in comparison with standards
化合物名称 m/z 标准品保留时间/min 样品保留时间/min 标准品MS2碎片离子(m/z) 样品MS2碎片离子(m/z) 相对含量/%
二苯乙烯苷 405 10.062 10.025 243.0 243.1 2.27
牡荆素 431 12.192 12.155 310.9、340.8、282.9 311.1、282.7 1.10
芦丁 609 14.027 14.034 300.0、178.7、151 300.1、178.9 6.97
金丝桃苷 463 14.354 14.323 300.1 300.2、271.1 23.48
橙皮苷 609 14.981 14.944 301.0 301.0 31.73
槲皮苷 447 15.906 16.076 300.1、270.8、255.1 300.1、271.0 16.38
※分析检测 食品科学 2013, Vol.34, No.14 265
测有较好的信号响应，因此本实验采用了负离子检测的
方式，对三叶委陵菜黄酮样品液和标准品溶液中扫描得
到的每一个分子离子进行二级质谱，然后根据待测物质
的色谱保留时间、分子离子、碎片离子峰质核比与标准
品相比较，并参考相关的文献[17-24]，对三叶委陵菜(图1所
示)的8种黄酮物质进行了质谱鉴定，其中6种黄酮的分析
结果见表1。
100 200 300 400 500 600 700 800
0
100
200
300
400
500
600
700
800
ֵ
ো
ᔎ
ᑺ
m/z
300.2
755.3
445.8
609.2
图 2 2号物质的二级质谱图
Fig.2 MS2 spectrum of compound 2
图2显示了图1中曲线a的2号物质的二级质谱图。可
见2号黄酮的分子离子峰为m/z 755，可知该物质的相对
分子质量为756，MS2碎片离子m/z 609为裂解过程中脱去
一分子的鼠李糖后得到的芦丁特征峰，m/z 446是分子离
子m/z 755在裂解过程中丢失一分子芸香糖后产生的特征
峰，m/z 300为该物质在裂解过程中脱去所有糖苷后得到
的槲皮素苷元峰。因此可以推断2号物质为槲皮素-3,7-芸
香糖鼠李糖苷[17-19]，其断裂方式如图3所示。
O
O
O-
OO
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH OH
OH
OH
OH
OH
HO
HO
HO
HO
HO
HO
HO
HO
HO
HOHO
O
O-
OO
O
O
O
O
O
O-
-O
-O
-O
O
O
O
O-
O
m/z 755
m/z 609
m/z 446
m/z 300
m/z 300
ˉC6H10O4
ˉC6H10O4
ˉC12H21O9
ˉC12H21O9
图 3 槲皮素-3,7-芸香糖鼠李糖苷的二级质谱裂解方式
Fig.3 MS2 fragmentation pattern of quercetin-3,7-rutinosogalactoside
0 100 200 300 400 500 600 700
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
ֵ
ো
ᔎ
ᑺ
m/z
284.1
593.2
图 4 8号物质的二级质谱图
Fig.4 MS2 spectrum of compound 8
图4显示了图1a中8号物质的二级质谱图。可见8号物
质的分子离子峰为m/z 593，MS2碎片离子m/z 284为山奈
酚甙元的特征峰，减少的质量数309是8号物质的分子离
子(m/z 593)在裂解过程中脱去一分子的芸香糖的结果，
这个结果是与文献[20-24]的研究结果一致的，故推断8号
物质为山奈酚-3-芸香糖苷，其断裂方式见图5。
O
HO
HO
HO
HO
HO
O OH
OH
OH
OH
OH
O-
O-
-O
OO
O
O
O
m/z 284m/z 593
ˉC12H21O9
图 5 山奈酚-3 -芸香糖苷的二级质谱裂解方式
Fig.5 MS2 fragmentation pattern of kaempferol-3-rutinoside
3 结 论
通过HPLC-MS/MS分析并与标准品及文献对比，
对三叶委陵菜黄酮的主要成分进行了初步的分析鉴定，
报道了三叶委陵菜中黄酮类化合物的组成。结果显示三
叶委陵菜中主要存在有8种黄酮类化合物，分别为二苯
乙烯苷、槲皮素-3,7-芸香糖鼠李糖苷、牡荆素、芦丁、
金丝桃苷、橙皮苷、槲皮苷和山奈酚-3-芸香糖苷，并
且以金丝桃苷和橙皮苷为主要成分。所提出的方法简便
可行，为进一步研究三叶委陵菜的化学成分提供了科学
依据。
参考文献：
[1] 吴国忠, 杨其绛, 王同明. 脂褐素(老年斑)形成机理与中药祛除脂褐
素研究进展[J]. 中医药研究, 1997, 13(1): 60-62.
[2] 张彦文. 查尔酮类化合物的药理作用和构效关系[J]. 国外医学: 药
学分册, 1996, 8(23): 218-223.
[3] 杜崇民, 刘春宇. 黄酮类化合物抗肿瘤研究进展[J]. 中国野生植物
资源, 2007, 26(3): 4-7.
[4] 鄢春旻. 黄酮类化合物抗病毒及抗炎活性研究[D]. 南京: 南京大学,
2012.
[5] 兰真, 曾凡骏, 曾里, 等. 生物类黄酮对心血管系统的调节及作用机
理[J]. 现代预防医学, 2005, 32(6): 613-615.
[6] 张逸凡, 于庆海. 淫羊藿总黄酮的免疫调节作用[J]. 沈阳药科大学
学报, 1999, 16(3): 182-184.
[7] WU J A, ATTELE A S, ZHANG L, et al. Anti-HIV activity of
medicinal herbs: usage and potential development[J]. Am J Chin Med,
2001, 29(1): 69-81.
[8] 延玺, 刘会青, 邹永青, 等. 黄酮类化合物生理活性及合成研究进展
[J]. 有机化学, 2008, 28(9): 1534-1544.
[9] 钟颖, 瞿显友, 张永东. 湘西委陵菜属药用植物资源[J]. 中国民族民
间医药杂志, 2004(6): 344-345.
[10] 蔡玉华, 刘梁, 韩丁献, 等. 三叶委陵菜根化学成分的研究[J]. 武汉
理工大学学报, 2005, 27(9): 32-33.
266 2013, Vol.34, No.14 食品科学 ※分析检测
[11] 邓凤玲. 高效液相色谱法测定三叶委陵菜中β-谷甾醇含量[J]. 医药
导报, 2011, 30(7): 939-940.
[12] 韩建伟, 刘新国, 王文琼. HPLC法测定三叶委陵菜药材中儿茶素含
量研究[J]. 湖北中医学院学报, 2008, 10(3): 55-56.
[13] 许正刚, 闵运江. 安徽产委陵菜属7种药用种类的黄酮提取与分析
[J]. 安徽农业科学, 2010, 38(6): 2929-2933.
[14] 周媛, 李荣, 姜子涛. 三叶委陵菜黄酮的微波辅助提取工艺研究[J].
食品研究与开发, 2012, 33(4): 47-50.
[15] 周媛, 李荣, 姜子涛. 大孔吸附树脂分离纯化三叶委陵菜总黄酮的
研究[J]. 中国食品添加剂, 2011(6): 64-70.
[16] 周媛, 李荣, 姜子涛. 食用委陵菜黄酮的抗氧化性及清除自由基能
力研究[J]. 食品工业科技, 2012, 33(17): 102-105.
[17] MULINACCI N, VINCIERI F F, BALDI A, et al. Flavonol glycosides
from Sedum telephium subspecies maximum leaves[J]. Phytochemistry,
1995, 38(2): 531-533.
[18] LOMMEN A, GODEJOHANN M, VENEMA D P, et al. Application
of directly coupled HPLC-NMR-MS to the identification and
confirmation of quercetin glycosides and phloretin glycosides in apple
peel[J]. Anal Chem, 2000, 72(8): 1793-1797.
[19] MANGURO L O A, UGI L, LEMMEN P, et al. Flavonol glycosides
of Warburigia ugandensis leaves[J]. Phytochemistry, 2003, 64(4):
891-896.
[20] BRUNO A S, FEDERICO F, JOAO O M, et al. Phytochemical and
antioxidant characterization of Hypericum perforatum alcoholic
extracts[J]. Food Chem, 2005, 90: 157-167.
[21] DERBEL S, BOUAZIZ M, DHOUIB A, et al. Chemical composition
and biological potential of seed oil and leaf extracts of Henophyton
deserti Coss. & Durieu[J]. C R Chim, 2010, 13: 473-480.
[22] SILVA B A, FERRERES F, MALVA J O, et al. Phytochemical and
antioxidant characterization of Hypericum perforatum alcoholic
extracts[J]. Food Chem, 2005, 90: 157-167.
[23] SLIMESTAD R, FOSSEN T, VERHEUL M J. The flavonoids of
tomatoes[J]. J Agric Food Chem, 2008, 56: 2436-2441.
[24] DRI D N, CALANI L, MAZZEO T, et al. Effects of different maturity
stages on antioxidant content of Ivorian gnagnan (Solanum indicum L.)
berries[J]. Molecules, 2010, 15: 7125-7138.