全 文 ：第r l卷 第2 期
1 90 1 年1 1 月
中 南 林 学 院 学 才良
JO UR NA LO FC E N TRA L一S H O U TO FRS E TR YC O L LE E G
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1 9 91
南方红豆衫种子后 熟生理的研究
谭 一 凡
( 林 学 系 )
`摘要】 对南方红豆杉种子后热过程的生理生化变化进行研究 , 结果表明 . 种子形态成熟时 . 种胚发育不完全
是其最初不能萌发的根本原因 . 经过长时间 的综合变温层积 . 种胚在完成其形态发育的同时 , 生理生化功能亦渐
趋完替 . 种皮的透性不良与种内抑制物的存在 , 是 延缓种胚后热过程的主要因素 . 通过层 积处理 . 可以提高种子
的发芽率和成苗串 .
关 , 润 南方红豆杉 ; 后熟生理 : 种胚
南方红豆杉 〔 T a x 。 s , n 。 f r e i ( L e m e e e t l e v l ) 5 Y H u 〕 属红豆杉科红 豆 衫 属 大乔
木 . 是珍贵的观赏及用材树种 〔 ’ 〕 . 由于它独立成种的历史不长 , 故对其进行系统研究的 报
道较少 .
南方红豆杉种子休眠期长 , 发芽缓慢而不齐 . 为了提高种子的发芽率 , 生产上一般将其
层积一年后播种 , 但效果仍不理想 , 常常使有限的种质资源造成极大的浪费 . 据报道 , 与其
同属的欧洲红豆杉种子 , 一般需要在 16 ℃左右条件下处理 90 ~ 1 20 天 , 随后再在 2 ~ 5 ℃条
件下处理 60 ~ 1 20 天才能发芽 〔 ’ 〕 . 说明该属种子为典型的形态— 生理休眠种子 . 为寻找在生产上行之有效的催芽措施 , 我们对南方红豆衫种子后熟过程中的生理生化变化 进 行 了 研
究 . 现将结果整理如下 :
材料与方法
1
.
1 材 料
供试种子分两批 . 第一批于 1 9 8 5年 2 月由庐山种子公司购进 . 含水量为 16 帕 , 千粒重为
5 8
.
9 9
, 优良度为 85 肠 ; 第二批于同年 1 月在江西九连山自然保护区采集 . 含水量为” 肠 ,
千粒重为8 1 . 5 9 , 优良度为 92 肠 .
1
.
2 方 法
1
.
2
.
1 种子处理 将种子充分吸水后 , 按常规方法进行层积处理 .
20 ℃ : 后期为冷层积 , 温度为 5 ℃ .
1
.
2
.
2 种子呼吸的测定 用 S K W 一 3 型微量呼吸仪测定其耗氧最 .
前期为暖层 积 , 温度 为
短组 4 0粒 , 重复 3 次 .
本文于 19 1年 3 月 12 日收到 .
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1673 -923x . 1991. 02. 019
2期 谭一凡 :南方红豆衫种子后熟生理的研 究 20 1
1
.
2
.
3胚胎发育状况鉴定 取不同层积时期种子的胚 , 用石蜡切片及冰冻切片两种 方 法进
行显微摄影 .
1
.
2
.
4 内源抑制物的分离及鉴定 参照丁静 〔 ’ 〕和王文章 〔 ` 〕所采用的方法 , 进行分离 和鉴
定 .
1
.
2
.
5 离体胚的培养 按 S a o h a r和 K a nt a的方法 〔 ’ 〕配制培养基 , 置于种子三角 瓶 中 . 然
后 , 按一般无菌操作方法 , 将不同层积时期的种胚接种到上述培养基上 , 置于 20 ℃ ~ 25 ℃下
进行光照培养 ( 即白天光照 s h , 温度为 25 ℃ ; 晚上黑暗16 h , 温度为 20 ℃ ) .
1
.
2
.
6 酶的测定 用联苯氨比色法 〔 ` 〕测定过氧化物酶活性 , 丙烯酞胺凝胶电泳法测定过氧
化物酶同工酶 .
1
.
2
.
7 不同呼吸途径运转活性的估算 分别采用丙三酸抑制法和 K C N抑制法进行估测 .
2 结果和分析
2
.
1 种胚的发 , 及其离休生长特性
对不同后熟阶段种胚的石蜡切片进行观察 , 结果表明 : 种子形态成熟时 , 胚胎发育已进
入鱼雷形胚阶段 . 胎的各部分均 已分化 . 但发育程度较差 ( 图版 I一 1 ) . 特别是生长点的
分化程度仍较低 ( 图版 I一 2 ) . 此时的离体胚在培养基上多数处于静止状态 . 只有少数胚
能出现子叶张开现象 , 但不久胚体发黑 , 直至死亡 .
经历 3 个月暖层积后 , 整个胚体有所伸长 , 各部分进一步分化 ( 图版 I一 3 ) , 顶端分
生组织明显向上突起 ( 图版 I一 4 ) . 此阶段离体胚在培养基上多数可长期存活 . 并出现子
叶张开 、 胚体膨大并转绿的现象 . 少数胚可长成形态各异的畸形苗 .
将上述种子置于 5 ℃左右的低温下处理 , 使综合层积时间达到 10 个月左右 , 胚在形态上
已完全成熟 ( 图版 I一 5 ) , 胚的维管系统也已完全建立 ; 根端分生组织已分化出环状与柱
状细胞结构 , 顶端分生组织细胞向上突起 ( 图版 I 一 6 ) , 最外层分化 出两层排列整齐的细
胞 , 生长点基部已有真叶原基分化的迹象 . 此阶段离体胚多数可迅速转绿并生 长 . 但只有少
数胚可长成正常苗 . 这预示尚有某种因素在对胚的生长起着抑制作用 . 但如此时利用已在胚
乳内转绿的胚进行离体培养 , 则大多数能很快成苗 . 可见这种胚实际上为萌动胚 .
2
.
2 离休胚呼吸强度的变化
将经过不同层积处理和干藏种子的胚与
胚乳分离 , 测定离体胚的呼吸速率 , 结果如
图 1所示 .
从图 l 可以看出 , 离体胚的呼吸强度与
层积处理的时间长短有着极密切的关系 . 层
积处理的时间越 长 , 离体胚的呼吸作用也越
强 . 在层积时间相同时 , 冷暖变温层积比冷
层积强 . 表明种胚的生理功能 , 是随层积时
间的增长而 日趋完善的 . 干藏一年的种子
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图 1 不同处理种子离体胚 的呼吸强度
层 积一年 2 . 2 0 ` C Z个月 + 5 ’ C Z个月
5
’
C S个 } 1 4 干藏 l 年
ǎ崖令。一·q\,I. 1乙、侧翻含彭
2 2 0中 南 林 学 院 学 报 1 1卷
其离体胚的呼吸作用比层积处理的弱 , 表明其生理功能尚不完善 , 势必影响到种子的发芽和
成苗 , 故不宜在生产中应用 .
2
.
3 过筑化物醉活性及同工醉的变化
对经过不同层积处理和干藏种子的过氧化物酶活性及种胚同工酶带谱进行测定和分析 ,
结果如图 2 , 3 所示 .
4因日园臼3翻阳日圈口U2口两园圈日ǎ目叫日巴\.。1xQ .O司à只胆谧
图 2 不同处理种子的过氧化物酶活性
1
. 层积 1年 2 . 20 ’ C 3 个月 + 5 ’ C Z 个月
3
.
2 0
’
C Z 个月 4 . 5 ` C Z个月 5 . 干藏 一年
图 3 不同处理种子胚的同工酶带谱
一 层积 1年 2 . 2 0 ’ C 3 个月 + 5 ’ C Z个月
3
.
5
’
C S个月 4 . 干藏 l年
从图 2 可 以看出 , 越是采用有利于种子后熟的处理方式 , 种子的过氧化物酶活性越高 .
并表现为随着层积时间的增长 , 酶活性呈上升趋势 . 这一结果 , 与不同处理种子离体胚的呼
吸作用相似 .
图 3 表明 , 不同处理种子胚的 同工酶带谱数保持基本稳定 . 但其活性存在着较明显的差
别 . 并主要表现在染色的深浅和出带的速度上 . 这可能是种子采收时各器官原 基 已 基 本分
化 , 在带谱与器官之间存在着某种专一性所致 . 带谱活性的不一致性 , 正是种胚器官分化程
度存在着差异的反映 .
2
.
4 种皮结构与种胚的供级状况
对南方红豆杉种子的种皮结构进行观察表明 , 种皮由三层构成 . 即第一层为蜡质不透水
层 , 第二层为透水性狠差 的木栓层 , 第三层为多层石细胞层 . 其中第一二层构成 了气 体 交
换的主要障碍 . 对干藏一年和冷暖变温层积一年 ( 下同 ) 南方红豆杉种子的呼 吸 商 进 行测
定 , 结果如表 l 所示 .
表 1 种皮状态时不同处理种子呼吸商 ( R Q )的影响一一 - - - - - 一 - - - - - - -处理方式及 干 藏 变 温 层 积测定温度 2 0 ’ C 2 5 ’ C 3 0 ’ C 2 0 ’ C 2 5 ` C 3 0 ` C种皮 完整
种皮剥离
2
.
4 4
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。
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2
.
18
0
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1
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6 3
1
.
3 5
0
.
7 0
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。
16
( )
.
8 2
从表 1 可以看出 , 种皮的存在 , 使种子处于明显的无氧呼吸状态 , _以在温度较低的情况
下 , 这种缺氧呼吸性质更为明显 . 据报道 , 在高度缺氧条件下 , 可导致种子内形成生长抑制
物 〔 ’ 〕 , 而高氧分压是抑制物降解的先决条件之一 〔 . 〕 . 由于供试种子通常是在低于 20 ℃的条
2期 谭 一凡 :南方红豆杉种子 后熟生理的研 究0 23
件下渡过漫长的后熟过程的 , 因此 , 种皮透性不 良对 其后熟过程中抑制物的降解极为不利 ,
从而影响到种胚的后熟和种子的萌发 . 表 l 中层 积与干藏完整种子呼吸商的显著差别表明 ,
经过层积处理 , 种皮的透性有了较明显的改善 .
2
.
5 抑制物活性与种胚的后熟
2
.
5
.
1 层积前后抑制物总活性的比较 以 白菜籽为发芽试验材料 , 对层积前后南方 红 豆杉
种子抑制物的总活性进行测定 , 结果如图 4 所示 .
从图 4 可 以看出 , 层积后的抑制物较层积前的抑制物对 白莱籽的发芽率影响较小 . 表明
经过层积处理 , 其抑制物活性有所下降 . 但继续观察供试白菜籽幼根的生长发现 , 层 积前后
抑制物对它的抑制作 用却几乎没有区别 . 这说明抑制总物的活性仍然很强 . 在层积过程中 ,
抑制物的降解速度是相当缓慢的 .
将抑制物粗提液以纸层析后 , 再用白菜籽作生物鉴定 , 结果表明 ( 图 5 ) , 层积前后抑
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抑制物浓度 (/ m L / 2 . s m L H Z O ) R f 值 R f值
图 4 层 积前后 抑制物总活性比较 图 5 层积前后抑制物活性比较
1 层积种子 2 未层积种子
制物的活性变化不大 , 但抑制区段明显减少 , 促进区段明显增加 . 这表明层积处理对种子的
发芽大有促进作用 .
2
.
5
.
2 种子各部位抑制物活性的比较 将种胚与种皮剥离 , 分别提取抑制物粗 提 液 , 经纸
层析后 , 按 R f 值以麦芽鞘垂直生长 法 进行生物鉴
定 , 结果如图 6 所示 .
从图 6 可 以看出 , 在种皮 内 , 在 R f 值 为 0 . 8
附近有一抑制物 , 经 过层积后其总活性下 降 ; 而在
种胚内 , 在 R f值为 0 . 6 ~ 。 . 9区间 , 存在着 一 广 谱
性的抑制物 , 经层积后 , 在 R f 值 0 . 8附近抑制物活
性明显下 降 . 这一位置 , 与A B A 标样在 纸谱 上 的
位置相当接近 , 故估计可能有类似 A B A 的物质存
在 .
2
.
5
.
3 种胚粗提液对离体胚生长的 影 响 将层积
一年并已转绿的种胚剥出 , 接种到含有种胚粗提液
的培养基上 , 并与接种到正常培养基上的离体胚相
对照 , 结果表明 , 它与对照一样可以长成正常苗 .
未撼积种胚
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刊护 - 口 L飞尸J
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R f值
图 6 层积前后 种子各部位抑制物活性比转
2 0 4中 南 林 学 院 学 报 1 1卷
但生长速度却大大延缓( 比对照晚成苗一个
多月) .这再次说明 , 抑制物活性是相当强
的 . 它是造成南方红豆杉种子不能正常成苗
的关键 .
2
.
5
.
4 种胚粗提液对种子过氧化物 酶 活性
的影响 在测定种子过氧化物酶活性时加入
种胚粗提液 , 并设对照加以比较 , 结果表明
( 图 7 ) , 粗提液能促进酶活性 大 大 下 降
( 依粗提液浓度发生变化 ) , 并使反应进程
曲线发生改变 . 说明种胚后熟过程中的过氧
化物酶活性的确受到种胚内某些物质的抑制 .
用 .
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时间 / m i n
图 7 种胚粗提液对酶活性的影响
1
. 对照 2 , 3 . 加种胚提取物
这种物质对种子的后熟过程起着重要的调控作
将种胚粗提液以纸层析后进行生物鉴定 , 按其结果将具有明显抑制及促进作用的区段分
别提出 , 用磷酸缓冲液浸提后再加入酶反应体系 , 结果表明 ( 图 8 ) , 前者对酶活性有明显
ǎ、。一xQ.O司à\只谧地
的抑制作用 , 而后者却大大加快了酶反应的
进程 . 可见 , 种胚提取物对种子的过氧化物
醉活性具有双向的调 节作用 .
2
.
6 种子代谢途径的变化
2
.
6
.
1 层积前后种胚呼吸商的 变 化 在供
氧状态 良好的情况下 , 种胚的呼吸商 RQ 是
最能反映种子内代谢底物类型及代谢状态的
指标 . 表 l 中的测定结果表明 , 经 过层积以
后 , 种子的呼吸商呈现明显变小的趋势 . 这
一” 3 ’ 6 犷 。时间 /m i n
图 8 不 同层析区段物质对酶活性的影响
1
. 促进区段 2 . 对照 3 . 抑制区段
除了说明层积后改善了种皮的透性外 , 也说明层积前后的种子在代谢方式上的变异 .
2
.
6
.
2 T C A 途径运转能力的差异 丙二酸为墟拍酸脱氢酶的专一性抑制物 , 常用来证实整
体材料中 T C A存在的证据 〔 ’ 〕 . 因此 , 以丙二酸渗入种子后测量呼吸作用被抑制的 程度 , 即
可估计出 T C A在呼吸作用中所占的比例 . 反之 , 可推算出 非 T C A 途 径 ( 即 H M P P ) 的 比
例 . 将层积前后的南方红豆杉种子去掉种皮 , 切成 l m m厚的 圆片 ( 包括胚 ) , 置水中漂洗 4
~ h5
, 于 0 . 5 x 10 一 ` m o l/ L丙二酸中处理 10 h后测定其呼吸强度 , 结果 表 明 ( 表 2 ) , 经过
表 2 丙二 酸时层积前后种子呼吸作 用的抑制 ( 1-0 ` L O : / h · 3 0片 )
种子类型 处 理 呼 吸 速 率第 1小时 抑制 / (%) 第 10 小时 抑制 / (%) 第 24 小时 抑制 / (%)
.7…l787104124G54幻79 1层积种子
休眠种子
对 照
丙二酸
对 照
丙二酸
5 0
.
0
2 0
.
0
6 3
.
5
9
.
7
2期 谭 一凡: 南方红 豆衫种子 后熟生理 的研 究 2 0 5
层积以后 , T C A 途径明显下 降 , 而非 T C A途径显著上升 .
2
.
6
.
3 对 C N 一的敏感性 CN 一可与有氧呼吸链中的细胞色素 ( C y t ) 氧化酶结合 , 因而造成
其活性衰退 . 因此 , C N 一的存在可明显地抑制 E M P一 T C A 途径 . 并可由呼吸链被 抑 制的程
度 , 推算出非T C A 途径的活性 . 取层积前后的南方红豆杉种子 40 粒 , 分别置于 20 x 1 0 一 ’ m ol
/ L K c N 溶液及清水中预处理 24 h , 然后分别置于盛有 30 x 10一 m 。 丫L K c N 溶液和清水的
呼吸瓶内 , 在 25 ℃下保温 6 h , 测定其呼吸强度 . 结果表明 ( 表 3 ) , 层积前后的南方红豆杉
种子 , 对 C N 一的敏感性差异十分明显 . 这就进一步证实了经层积后的南方红豆杉种子 的呼吸
表 3 K C N时层积前后 种子呼吸作用的影响 ( “ L O : / h · 4 0拉 )
种子 预处现 呼 吸 速 率 呼 吸被
类型 方 式 清水 K C N 抑制 / (%)
来层积
种 子
清 水
K CN
清 水
K C N
6 3
.
0
8 1
。
3
8 3
。
S
9 0
.
8
3 0
。
7
7 7
.
7
3 7
。
0
5 8
。
3
5 l
4
5 6
3 6
积子层种
途径为非 T C A 部分显著上升的结论 . 已有研究表明 , 休眠种子的代谢一般以 T C A 途 径 为
主 , 随着后熟的进行 , 代谢途径发生转化 , 因而导致休眠的解除 〔 ` 。 〕 . 层积种子呼吸途径的
非 T C A 部分上升 , 可能是其休眠被解除的反映 .
3 结语与结论
。 . 南方红豆杉种子形态成熟时 , 多数 胚仍处于形态发育未完全阶段 . 这是该树种种子最
初不能萌发的根本原因 . 经过长时间的冷暖变温层积 , 种胚在完成形态发育分化的同时 , 生
理生化功能亦渐趋完善 . 其主要表现是离体胚由不能正常生长转化为能够生长成苗 、 离体胚
的呼吸强度逐渐升高和过氧化物酶活性逐渐增强 .
b
. 种皮的不透性结构 , 使该种子种胚在 后熟过程中长期处于低氧分压状态 , 这 对 种子
内源抑制物的降解极为不利 . 而抑制物的存在 , 又抑制着种胚的分化与生长 , 降 低 酶 的 活
性 , 因而使种胚的后熟过程延缓 .
c
. 在种胚的后熟过程中 , 种胚的呼吸代谢途径发生了明显的转化 . 这可能 是 种胚由非
成熟状态 向成熟状态转化的一个主要前提 .
综上所述 , 对南方 红豆杉进行一年的变温层积处理 , 并辅以破皮进行播种 , 乃是提高南
方红豆衫成苗率的有效途径 .
承周佑勋教授拍导 , 谨此致谢 .
2 06 中 南 林 学 院 学 报 1 1卷
参 考 文 献
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8 W a r
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i n g P F
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F o d a H A
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G r o a t h i n h i b i t p r s a n d d o r口 a n e y s n x a n t h s : m s e o d s
P la n t
,
1 9 5 7
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P卜y s i P I .
1 9 6 5 仲
ST U D Y ON A F T E RRIP E N ING P HY S IO LO G y O F T a x a s 优 a r f e f S E E D
T a n Y i f a n
( D
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A B S T R A C T
A s t u d y h
a s b e e n m a d e o n p h y s i o l o g i e a l a n d b i o e h e m i e a l e h a n g e s o f
T a x a s 优 a r i e i s e e d i n t h e P r o e e s s o f a f t e r r i P e n i n g . R e s u l t s i n d i e a t e t h a t
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,
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.
D
u r i n g t h e l o n g p e r i o d o f s t r a t i f i e a t i o n a t v a r i e d t e m p e r a t盯 e s ,
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F u r t h
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e n d o g e n o u s i n h i b i t o r a r e t h e m a i n e a u s e s f o r t h e d e l a y e d e m b r y o
心
之
a f t e r r i P e n i n g
, a n d t h r o u g h
s e e d s a n d t h e s u r v i v a l r a t e
K e y w o r d s
:
T a x a s 州 a r i e i
5 t r a t i f i e a t i o n
,
t h e g e r m i n a t i o n P e r e e n t
o f t h e s e e d l i n g s a r e b o t h i n e r e a s e d
.
a f t e r r i p e n i n g p h y s i o l o g y
, e m b r y o
第 1 1 .