全 文 ：瑞香狼毒系统溶剂法分离提取部位的体外抗肿瘤活性
王 彬 ’ 王 锐 , 贾正平 ’ 2 樊俊杰 2 马 骏 2 张汝学2
( 1
. 兰州大学生命科学学院 , 兰州 7 3 0 0 0 0 ; 2 . 兰州军 区兰州总医院药局 , 兰州 7 30 0 5 0 )
摘要 目的 :分离筛选瑞香狼毒中抗肿瘤活性部位 。 方法 : 用系统溶剂法对瑞香狼毒 95 % 乙醇提取物进行分
离 , M竹 比色法对分离得到的部位进行体外抗肿瘤活性的测定 。 结果 : 石油醚提取物和氯仿提取物对体外培养肿
瘤细胞表现出较强的抑制作用 , 在测定浓度范围内呈现出良好剂量依赖性抑制作用 , 而正丁醇和甲醇提取部位在
测定浓度范围内则显示出很弱的抑制作用 ;在各提取部位中石油醚提取物的体外抗肿瘤作用最强 。 结论 : 石油醚
提取部位是瑞香狼毒中的体外抗肿瘤活性部位 「
关键词 瑞香狼毒 系统溶剂法 M rT 抗肿瘤活性
瑞香狼毒 ( tS el er a hc a m a eaj s m el L . ) , 又名断肠
草 , 为瑞香科狼毒属植物 , 其根人药 , 为少用 中药 。
《中药大辞典》记载瑞香狼毒有逐水祛痰 、 散结杀虫
的功效 。 现代药理学和临床应用均表明瑞香狼毒具
有显著的抗肿瘤作用 ,但因其毒性较大 ,一定程度上
限制了临床应用〔 ’ 一 4〕 。 本研究通过用系统溶剂法对
瑞香狼毒 95 % 乙醇提 取物进 行初步的分离 , 并用
M竹 比色法对分离得到的部位测定体外抗肿瘤活
性 ,从而确定瑞香狼毒中抗肿瘤活性部位 。
材料
药材 瑞香狼毒由兰州市药材供应 站提供 ,
经鉴定为瑞香科植物瑞香狼毒 (凡 el er a c ha m a ej as -
m el L
.
)
。
1
.
2 主要药品与试剂 R PM I一 164 0 培养基 为 临 b -
co 公司产品 ; M件 为 iS g m a 公司产品 ;小牛 血清为
四季青公司产品 ;其余试剂均为分析纯
1
.
3 细胞 系 人 胃癌细胞 S GC 一7 9 01 、人肝癌细胞
B E L
一
74 02 和人白血病细胞 H L 一60 均 引 自中国科学
院上海细胞生物研究所的细胞库 ;用 R PM I一 1640 培
养液 (含 or % 的小 牛血清 , 10 OK U1/ 青霉素 , 10
m郭 L 链霉素 ) , 37 ℃ , 5% C 0 2 , 相对湿度 10 % 培养 ,
0
.
25 % 胰蛋白酶消化传代 。
2 方法
2
.
1 系统溶剂法分 离提取瑞香狠毒 95 % 乙 醇提取
物 称取 10 0 9 瑞香狼毒药粉于蒸馏瓶 中 , 加人
9 5% 乙醇回流提取 。 浓缩 回收乙醇 ,浓缩液挥干溶
剂后 得 浸 膏 , 称重 13 . 50 9 , 得率约 为 13 . 50 % 。
95 % 乙醇提取物用少量 95 % 乙 醇溶解后加 人硅 藻
土适量拌匀 ,水浴挥干溶剂 ,制成硅藻土混合物 取
50 ml 的玻璃针管一支 , 下部放置滤纸后 ,将硅藻土
混合物粉末装人针管中 , 依次用石油醚 、 氯仿 、 乙酸
乙醋 、 正丁醇 和 甲醇流洗 每次加人溶剂 10 ~ 20
ml
,使溶剂匀速流下 , 同时将流出的提取液重新加入
中药材第 27 卷第 5 期 2 004 年 5 月
进行多次重复提取 ,多次流洗至提取液颜色近无色
时停止流洗 , 溶剂用量大约为样品的 20 一 30 倍 。 当
流洗结束时 ,将硅藻土混合物倒出 , 水浴挥干溶剂后
再换溶剂依次流洗 。 最后各部位提取液于旋转蒸发
器上浓缩并回收溶剂 , 浓缩液挥干溶剂后称重 ,计算
得率 ;各提取部位分别编号为 eP , Chl 。 , tE 0 A c , n 一 B u
和 M e O H 。
2
.
2 试样 的制备 分别准确称取以上各部位及
95 % 乙醇总提取物 (编号为 tE 0 H )50 . 0 m g 后 ,加人
1 m 1 DM S O 溶液充分溶解 , 各试样原初浓度为 50 . 0
m郭 ml ,用 DM S O 按倍 比稀释制备后的 4 个浓度分
另}J为 : 2 5 . 0 m g / nr l , 12 . s m郭m l , 6 . 2 5 m g / m l 和 3 . 1 3
m g / m l
2
.
3 M竹 比 色法 将生长 旺盛 的 SG C 一79 01 和
B E L
一
7 4 0 2 细胞用 0 . 25 % 胰蛋白酶消化后 ,悬浮于含
10 % 小牛血清 RM PI 一 1 64 0 培养液中 , H L 一60 细胞直
接加人含 10 % 小牛血清 RM IP 一 164 0 培养液 ,用玻璃
吸管轻轻吹打成单细胞悬液 ;取少许悬液加 0 . 4%
台盼蓝染液染色 , 显微镜下计数活细胞 ,调整细胞浓
度为 2 x l o s 个 / n l l ;取 9 6 孔细胞培养板 ,每孔加人
调好的细胞悬液 195 闪 ,置于 37 ℃ 、 5% CO : 、 相对湿
度 10 0% 培养箱中培养 4 h 后 ,加人测试药液 5 闪/
孔 , 继续培养 4 h 后每孔加 5 m g / ml M竹 溶液 (用
生理盐水配制 ) 10 闪 ,在培养箱中温育 4 ;h 完成后 ,
H L
一
60 细胞需 2 00 r/ m in 离心 10 m in ,然后仔细吸
取 _ L清 , 每孔加人 20 闪 DM SO ,于微量振荡器振荡
以使甲攒完全溶解 ,最后用酶标仪在 5 70 n m 波长处
测吸光 度 A 值 。 细胞增殖抑 制率 rI = ( A 对照 -
A药物 ) / A 、
、
,照 x 10 %
,剂量对数线性 回归法计算 CI S。
值 _
3 结果
3
.
1 系统溶剂法分 离提取部位 各提取部位称
重 ,计算得率 (相对于总提物 ) ,结果 见表 1 。
·
3 5 5
·
DOI : 10. 13863 /j . i ssn1001 -4454. 2004. 05. 019
表 , 各提取部位净重及得率
提取部位 净重 ( g ) 得率 (% )
石油醚 ( P e ) 2 . 2 2 16 . 4 5
氯仿 ( C h l o ) 1 . 2 4 9 . 1 9
乙酸 乙醋 ( E tO A e ) 1 . 5 5 1 1. 4 5
正丁醇 ( n 一 B u ) 0 . 88 6 . 5 0
甲醇 ( M e O H ) 7 . 16 5 3 . 0 3
3
.
2 各提取部位对体外培养的肿瘤细胞增殖的抑
制作用 石油醚提取部位和氯仿提取部位对体外培
养的人 胃癌细胞 S GC刁 9 01 、 人肝癌细胞 B E L一 4 02
和人 白血病细胞 H L石 O增殖具有较强的抑制作用 ,
在测定浓度范围内呈现出良好剂量依赖性抑制作
用 ; 而正丁醇和甲醇提取部位则表现出很弱 的抑制
作用 。 结果见表 2 一 4 。
表 2 各提取部位对 SG C 一 901 细胞的抑制率
DO SE I
r
( % )
( 林留 m l ) P e C h o l E tO A C n 一 B u M e OH E tO H
7 8
.
125 9
.
2 9 0
.
00 0
.
00 0
.
( )0 0
.
00 0
.
00
1 5 6
.
250 5 4
.
28 0
.
00 0
.
0 0 0
.
0 0 0
.
0() 0
.
0()
3 12
.
50() 67
.
4 8 2 7
.
6 3 2 7
.
14 0
.
0() 0
.
00 0 0()
6 25
.
0() 0 7 3
.
1 1 7 6
.
7 7 35
.
9 4 0
.
X() 9
.
5 4 6 7
.
9 7
12 50
.
(X〕0 7 6 . 5 3 8 1 . 1 7 64
.
0 6 3 0
.
0 7 6 0
.
6 4 7 8
.
4 8
表 3 各提取部位对 B E L 7 40 2 细胞的抑制率
D O SE I r ( % )
( 卜彭 m l ) P e C h o l E tO A C n 一 B u M e O H E t O H
19
.
5 3 1 0
.
(X )
一 一 一 一 一
39
.
06 3 0
、
o
一 一 一 一 一
7 8
.
125 10
.
60 39
.
8 3 1 2
.
8 9 6
.
9 5 0
.
00 0
.
00
156
.
2 50 5 5
.
0 1 4 2
.
9 8 7
.
16 6
.
3 0 0
.
00 0
.
00
3 12
.
5《X ) 7 7 . 3 6 56 . 16 2 2 . 06 9
.
4 6 0
.
0() 39
.
5 4
625
. 以X ) 一 7 6 . 7 9 3 8 . 1 1 15 . 7 6 8 . 3 1 59 . 8 9
12 50
.
(拟 ) 一 8 3 . 10 5 4 . 4 4 3 8 . 1 1 4 1 . 8 3 7 0 . 4 9
表 4 各提取部位对 H L 芍O 细胞的抑制率
DO SE
( 卜留 m l )
I r ( % )
P e Ch
o
l E! O A
e n 一
B
u M e O H E t0 H
19
.
5 3 1 26
.
9 1 一 一 一 一 一
39
.
06 3 54
.
22
一 一 一 一 一
7 8
.
125 87
.
24 2 3
.
93 0
.
0() 0
.
X() 0
.
0() 18
.
7 5
1 5 6
.
2 5 0 9 1
.
4 9 5 4
.
30 0
.
0() 0
.
0() 0
.
7 0 4 7 1 7
3 12
.
50() 94
.
9 7 92
.
8 6 1 2
.
9 5 0
.
0() 6
.
09 92
.
0 2
6 2 5
.
X() 0
一 9 4
.
2 6 4 2
.
2 7 O
.
0() 科 . 2 3 95 . 1 0
12 50
.
X() 0
一
93
.
2 8 88
.
0 3 5 4
. 科 8 7 . 3 3 94 . 9 6
3
.
3 各提取部位体外杭肿瘤作用的比较 线性 回
归法计算各提取部位的 Ic s。值 ,结果见表 5 。 比较各
·
35 6
·
提取部位对不 同肿瘤细胞的 IC S。值 ,石油醚提取部
位的 IC S。 分 别 为 2 3 6 . 7 5 3 卜岁 m l ( S G C一 7 9 0 1 ) 、
1 18
.
0 5 8 林扩m l ( B E L 一7 4 0 2 ) 、 3 5 . 18 0 林群m l ( H L -
60 )
,均小 于其余提取 部位 , 而且 也小于总提物 的
CI
S〔,值 , 这表明在各提取部位中石油醚提取部位的
体外抗肿瘤活性最强 。 表 5 结果还显示 , 氯仿提取
部位也具有较强的体外抗肿瘤活性 ,正丁醇和甲醇
提取部位的体外抗肿瘤活性很低 。
表 5 瑞香狼毒各提取部位的 IC 50 值
IC
5。
( 林酬 m l )
提取部位 —S G C一7 9 0 1 B E L 一7 4 0 2 H L石0石油醚 ( P e ) 2 3 6 . 7 5 3 1 1 8 . 0 5 8 3 5 . 18 0氯仿 ( C h lo ) 4 5 3 . 9 8 5 17 8 . 明 9 13 4 . 4 9 6乙酸乙醋 ( E t0 A e ) 8 82 . 3 8 4 12 6 9 . 47 2 6 15 . 4 95正丁醇 ( n 一 B u ) 4 9 7 1 1. 4 7 0 8 66 8 . 1 10 3 7 6 8 . 3 3 3甲醇 ( M e OH ) 2 10 1. 9 6 5 6 3 5 6 . 15 2 6 3 5 . 2 0 9总提物 ( E rO H ) 5 9 1. 5 3 4 5 4 3 . 1 19 1 5 8 . 6 2 34 讨论近年来对瑞香狼毒的药理研究表明 , 瑞香狼毒
具有很强的抗肿瘤作用 ,最新的研究还发现其具有
抗病毒作用 , 特别是抗 H IV 病毒的作用 。 冯威健等
从瑞香狼毒中分离得到抗肿瘤活性很强的二帖类化
合物尼地吗琳 ,并认为尼地吗琳是瑞香狼毒中的主
要抗肿瘤活性成分 ,但其活性剂量与毒性剂量接近 ,
因而降低了临床应用的价值 〔, 一 9二。 目前 ,对瑞香狼
毒大量的化学成分研究表明 ,除了含二帖类化合物
外 ,瑞香狼毒中还含有结构比较特殊 的双二氢黄酮
类 、木脂素类 、 香豆素类等化合物 〔’ 。 一 ’ 4〕 , 而这些成分
对于抗肿瘤活性化合物的筛选具有广阔的研究开发
前景 ,对瑞香狼毒中抗肿瘤活性化合物的研究仍很
必要 。
本研究以人的肿瘤细胞系为筛选模型 , 以体外
抗肿瘤活性为指标 ,对瑞香狼毒用系统溶剂法分离
得到的提取部位进行 了筛选 。 结果表明 , 石油醚提
取部位是瑞香狼毒中抗肿瘤作用的主要部位 , 对其
中的抗肿瘤活性成分有待进一步的研究 。
’ 通讯联系人 , 电话 : ( 09 3 1 ) 89 7 54 6 0 , 8 9 75 4 7 8
参 考 文 献
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.
Th e p e tor le u m e th e r e x t r a e t w a s
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v e n t e x t l u e r io n ; M竹 ; A n r i t u m o r a e r iv it y
黄连解毒汤有效部位对实验性脑缺血的保护作用
吴 彦 孙建宁 张爱林 邓 云 石任兵 谭 涛 孙文燕
( 北京中医药大学 ,北京 10 0 10 2 )
摘要 目的 : 观察黄连解毒汤有效部位 ( H IJ DT A F )对实验性脑缺血的保护作用 。 方法 : 采用三氯化铁所致大
鼠单侧大脑中动脉阻塞 ( M C A O )模型观察 H IJ D T A F 对局灶性脑缺血 的保护作用 ;采用大鼠双侧颈总动脉结扎
( C C AO )模型研究药物对脑毛细血管通透性的影响 ;采用小鼠双侧颈总动脉反复缺血再灌注 ( C C AO RR )模型观察
药物对模型断头张口喘气时间 、脑指数与脑含水量的影响 。 结果 : H IJ DT A F 可明显减轻 M C AO 大 鼠神经症状 , 减
少脑梗塞范围 ( P < 0 . 05 , P < 0 . 01 ) ;H LJ D T AF 还能显著降低 C C A O 大鼠血脑屏障毛细血管通透性及脑组织 E B 含
量 ( P < 0 . 05 , P < 0 . 0 1 ) ; 该有效部位还可 以延长 C C AO R R 的断头张 口喘气时间 , 降低脑指数 , 减轻脑水肿 ( P <
0
.
05
,
P < 0
.
01 )
。 结论 : H曰 D T A F 具有很好的脑保护作用 〕
关键词 黄连解毒汤有效部位 脑缺血 大脑中动脉阻断 脑水肿 毛细血管通透性
黄连解毒汤源 于唐 · 王熹 《外台秘要 》 , 由黄
连 、黄答 、 黄柏和桅子组成 , 为清热解毒代表方 。 近
年中日两国对黄连解毒汤及其提取物用于脑血管病
的基础研究与临床报道较多 ,表明本方对低氧性脑
障碍 、 小鼠各种记忆障碍有显著改善作用 ,能显著增
中药材第 27 卷第 5 期 2 0 0 4 年 5 月
加脑血流量 ,抑制血小板聚集 、 抑制血栓形成并可抑
制动脉粥样硬化形成 〔’ 周 。 应用该方及提取物治疗
脑血管病的临床报道也较多 , 治疗效果较好 〔’ 川 。
这些均提示本方治疗缺血性脑血管病有 良好前景 。
我们根据所形成的中药复方有效物质基础研究思路
·
35 7
·