全 文 ：Research Paper 研究报告
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica
52(3) :295 － 303;4 March 2012
ISSN 0001 － 6209;CN 11 － 1995 /Q
http:/ / journals． im． ac． cn / actamicrocn
基金项目:国家自然科学基金(31100471) ;山西省高校高新技术产业化资助项目(2110122)
作者简介:任嘉红(1976 －) ，博士，副教授，主要从事森林微生物的研究。E-mail:renjiahong76@ yahoo． com． cn
收稿日期:2011-11-09;修回日期:2011-12-30
南方红豆杉根际溶无机磷细菌的筛选、鉴定及其促生效果
任嘉红1，刘辉2，吴晓蕙1，王青1，任英瑜1，刘亚静1，冯玉龙1
1长治学院生物科学与技术系，长治 046011
2安徽师范大学环境科学与工程学院，芜湖 241003
摘要:【目的】对南方红豆杉(Taxus chinensis var． mairei)根际溶无机磷细菌进行了分离、筛选与鉴定，并对获
得的高效溶磷菌株进行了温室盆栽试验。本研究为通过生物途径改善南方红豆杉磷素供应，促进其生长提
供了优良的菌株资源。【方法】利用选择培养基从南方红豆杉根际土壤中共分离出具溶磷能力的细菌;采用
NBRI-BPB 培养基进行复筛获得溶磷能力较强的溶无机磷细菌;并采用钼锑抗比色法测量其在 NBRIP 培养
基中经 4d 发酵后的可溶性磷含量;通过形态指标、生理生化测定、Biolog 系统和 16S rDNA 序列分析鉴定细
菌种类;并进行了溶磷菌株的室内盆栽实生苗接种试验。【结论】从南方红豆杉根际共分离出 4 株高效溶磷
细菌，分别鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)、草木樨中华根瘤
菌(Sinorhizobium meliloti)和地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis) ;4 株细菌对南方红豆杉苗期的生长有明显
的促进作用。
关键词:南方红豆杉，溶无机磷细菌，筛选和鉴定，促生长
中图分类号:Q939. 99 文献标识码:A 文章编号:0001-6209 (2012)03-0295-09
南方红豆杉(Taxus chinensis var． mairei)是红豆
杉科红豆杉属植物，广布于我国南方部分地区海拔
600 － 1200 m 的山地，山西是该植物生长的北限［1］，
其树冠优美，材质坚硬、水湿不腐，是集观赏、材用、
药用于一身的珍贵树种。而且，南方红豆杉是中国
特有树种，为第三纪孑遗树种和国家一级保护珍稀
树种，是新型抗癌天然药物紫杉醇(Taxol)的主要来
源之一。目前，几乎所有的紫杉醇临床用药都直接
或间接地来源于红豆杉属植物的自然资源，其它的
一些尝试均没有形成产业化规模［2］，这导致红豆杉
属植物野生资源破坏严重，红豆杉生长缓慢的生物
学特性和极低的紫杉醇含量进一步加剧了这种状
况［3］。
磷是植物生长发育重要的物质基础，植物吸收
磷量与植物的生物量呈显著的正相关。在我国有
74%的耕地土壤缺磷，土壤中 95%的磷为无法吸收
的难溶性磷，因此如何提高植物对土壤中难溶性磷
的吸收具有重要的应用价值。许多研究表明，土壤
中分布有大量具有溶磷能力的微生物，称为溶磷微
生物［4 － 6］。一般将具有溶解无机磷酸盐的细菌称溶
无机磷细菌 (Phosphate-solubilizing bacteria，PSB)
［7］。这类细菌能够促进磷灰石［Ca3(PO4)2］等难溶
成分释放出磷，具有溶无机磷能力。PSB 可明显提
高土壤中可溶性磷的营养水平，增加植物对磷元素
的吸收，从而促进植物的生长［8］。目前国内外尚未
开展南方红豆杉根际溶无机磷细菌的系统研究。
Jiahong Ren et al． / Acta Microbiologica Sinica(2012)52(3)
本文以南方红豆杉根际土为研究对象，对南方
红豆杉根际土的溶无机磷细菌进行了分离筛选，得
到了 4 株高效溶无机磷细菌，并对这 4 株溶磷细菌
进行了鉴定;同时在温室条件下，研究了 4 株高效溶
磷细菌对南方红豆杉实生苗苗期生长的影响。该研
究结果可为南方红豆杉高效生物肥料的研制提供优
良的菌种资源，对南方红豆杉珍贵野生资源的保护
和紫杉醇产业的可持续发展具有重要意义。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 土样:选择山西省南方红豆杉分布区(陵川
凤凰谷、长治大峡谷、蟒河自然保护区、历山自然保
护区、长治林业局院内、长治宾馆院内、长治林业局
苗圃)中长势良好的南方红豆杉。采用三点取样
法，铲去表土，将南方红豆杉 10 － 20 cm 的根系及黏
附其上的土壤一同装入无菌袋中，注明采集地点、日
期、土样号，带回实验室及时进行溶无机磷细菌的分
离。
1. 1. 2 培养基:①溶无机磷细菌的分离、纯化培养
基(选择培养基)［9］②溶无机磷细菌保藏培养基
(NA) :牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂18 g，
蒸馏水1000 mL，pH 7. 2 － 7. 4。③溶无机磷细菌种
子及培养培养基(NB) :配方同 NA(不添加琼脂)。
④溶无机磷细菌筛选培养基(NBRI-BPB)［10］⑤溶磷
能力测定培养基(NBRIP)［10］:配方同 NBRI-BPB(不
添加溴酚蓝)。
1. 1. 3 主要试剂和仪器:①试剂:钼酸铵、酒石酸锑
钾、抗坏血酸、浓硫酸、乙醇、2，4-二硝基酚、Ca3
(PO4)等均为国产分析纯。溶液的配制及稀释均采
用 Milli-Q 超纯水。②仪器:Leica DM5000B 荧光显
微镜、德国 Eppendorf Centrifuge 5804R 高速低温离
心机、UNICO UV2000 紫外分光光度计和 Millipore
超纯水系统。
1. 2 南方红豆杉根际溶无机磷细菌分离、纯化及筛
选
1. 2. 1 溶无机磷细菌的分离、纯化及保藏:溶无机
磷细菌的分离采用平板梯度稀释培养法。将涂布有
南方红豆杉根际土悬浮液的分离平板置于 30℃培
养4 － 7 d，挑取平板上产磷溶圈且形态有明显区别
的菌落纯化多次，直至通过平板和镜检观察确定其
为纯培养物后，挑取单菌落转至 NA 斜面培养
2 － 3 d，然后置于 4℃冰箱保存。
1. 2. 2 溶无机磷细菌的复筛:参照 Sangeeta Mehta
和 Nautiyal 的方法［10］(略有修改) ，用接种环挑取
1. 2. 1 分离获得的细菌菌株，接种于装有 20 mL
NBRI-BPB 培养基的100 mL三角瓶中，以未接菌空
白 NBRI-BPB 培养基为对照，30℃，180 r /m振荡培
养3 d，发酵液(4℃，12857 × g)离心10 min，在波长
600 nm处测定上清液 OD600值，对其溶磷能力进行初
步分级。分级标准为溶磷能力强(+ + +) :OD600≤
－ 1;较强(+ +) :－ 1 ＜ OD600≤ － 0. 5;弱(+ ) :－
0. 5 ＜ OD600≤ － 0. 1。
1. 3 溶无机磷细菌溶磷能力的测定
选取 1. 2. 2 中 OD600≤ － 1 的溶磷菌株活化后
接种于 NB 种子培养基，30℃振荡培养 18 － 24 h制
成种子液，取0. 5 mL种子液接种于含50 mL NBRIP
培养液的100 mL三角瓶中，以接0. 5 mL空白种子液
的 NBRIP 培养基为对照，每个处理 3 个重复，30℃，
180 r /m振荡培养4 d后，发酵液(4℃，12857 × g)离
心10 min，采用钼锑抗比色法测定上清液有效磷含
量［11］，同时计算溶磷率［12］;并测定上清液 pH 值。
1. 4 溶无机磷细菌的鉴定
1. 4. 1 理化性质及形态学分类:按照文献［13］做
形态与生理生化分析。
1. 4. 2 Biolog 系统鉴定:具体步骤参照该系统的鉴
定说明书。
1. 4. 3 16S rDNA 序列分析:按文献［14］提取细菌的
基因组 DNA，采用扩增细菌 16S rDNA 的通用引物
(正向引物 27 F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;反向
引物 1512 R:ACGGCTACCTTGTTACGACT)对细菌
基因组 DNA 进行扩增［15］。获得的 PCR 产物，经
1%琼脂糖凝胶电泳分离后送 Invitrogen 公司测序。
测序完成后，将得到的序列登陆 EzTaxon server
(http:/ /www． EzTaxon． org)进行 BLAST［16］，选取数
据库中有代表性的菌株 16S rDNA，采用 Bioedit 软
件的 Multiple Sequence Alignment 程序进行分析，并
利用软件 MEGA5. 05 构建系统发育树(Bootstrap =
1000)。
1. 5 溶无机磷细菌的温室试验
将 4 株高效溶磷菌株活化后，用接种环挑取少
量菌体接种于装有50 mL NB 培养基的100 mL三角
瓶中，29℃，200 r /min振荡培养48 h。发酵液(4℃，
692
任嘉红等:南方红豆杉根际溶无机磷细菌的筛选、鉴定及其促生效果 ． /微生物学报(2012)52(3)
4629 × g)离心5 min，无菌生理盐水润洗菌体 3 次
后，无菌生理盐水调节菌悬液(108 cfu /mL)制成接
种剂。接种南方红豆杉实生苗(苗龄60 d) ，以等量
无菌生理盐水为对照，接种量为实生苗 5 mL /株。
每处理 6 个重复，置温室中培养，光照通过遮阳网得
到一定控制，不使用人工光源，适时浇水。实生苗培
养培养基质为 V(泥炭)∶ V(珍珠岩)∶ V(沙)= 3∶ 1 ∶
1的混合基质，每盆 1. 5 kg，基质中速效氮含量
35. 0 mg /kg，速效磷含量7. 0 mg /kg，速效钾含量为
25. 4 mg /kg。南方红豆杉接种后 150 d 后测定苗
高、地径。
1. 6 数据分析
采用 SPSS V13. 0 统计软件进行方差分析和多
重比较。
2 结果和分析
2. 1 南方红豆杉根际溶磷细菌的分离与筛选
用选择培养基平板分离所采集的南方红豆杉根
际土中的溶磷细菌，获得 45 株能产生溶磷圈的细
菌，说明这些菌株具有溶无机磷能力。其中从陵川
凤凰谷土样中获得 8 株，长治大峡谷 6 株，蟒河自然
保护区 10 株，历山自然保护区 9 株，长治林业局院
内 5 株，长治宾馆院内 4 株，长治林业局苗圃 3 株。
利用 Sangeeta Mehta 和 Nautiyal 的方法对 45 株
溶无机磷细菌进行定性和半定量溶磷能力的测定，
结果表明有 11 株菌株在 NBRI-BPB 培养基中的发
酵液上清液于波长 600 nm 处的光吸收值均 ＜ － 1，
属于溶磷能力初步分级标准中的最高级(表 1) ，具
有应用潜力。该方法原理为溶磷细菌分泌有机酸降
低培养介质的 pH 值，从而达到溶磷的目的。溴酚
蓝(BPB)作为一种酸碱指示剂，随着介质 pH 降低
而褪色，pH 变色范围 3. 0(黄)－ 4. 6(蓝紫)。因此，
在 NBRIP 中添加一定量 BPB，利用发酵液褪色程度
的不同可以定性和半定量的反应细菌溶磷能力的大
小。从表 1 可看出，与对照相比，11 株溶磷细菌发
酵液 OD600值在 － 1. 001 － － 2. 050 之间。这说明 11
株溶磷细菌能够分泌大量有机酸降低了培养介质
pH 值从而使 BPB 褪色。根据发酵液 OD600值的不
同，各菌株产酸能力排序为菌株 CLW17 ＞ CHB10B
＞ CHB10L ＞ JFW3 ＞ MHW04 ＞ JFW01 ＞ JFW13 ＞
MHW07 ＞ CLW02 ＞ LSW08 ＞ CFW07。
2. 2 溶磷细菌溶磷能力测定
将 2. 1 中初筛获得的 11 株溶磷细菌分别接种
于 NBRIP 培养基中，29℃，180 r /m振荡培养4 d后，
各接菌处理发酵液有效磷含量均明显高于对照
(24. 67 mg /L) ，不同处理间差异显著(见表 2)。11
株溶磷细菌处理发酵液有效磷含量在357. 21 mg /L －
647. 67 mg /L之间，溶磷率介于 6. 65% － 12. 46%。
如表 1 所 示，菌 株 CLW17、JFW3、CHW10B 和
CHW10L 溶磷能力明显高于其它菌株，有效磷含量
分别高达647. 67 mg /L、635. 21 mg /L、638. 86 mg /L
和622. 12 mg /L，溶磷率分别为 12. 46%、12. 28%、
12. 21%和 11. 95%。
溶磷细菌在 NBRIP 液体培养基中摇培 4d 后，
各处理 pH 值均比对照有不同程度的降低，在 3. 80
－ 4. 40 之间(表 2)。相关分析表明，发酵液 pH 值
(X)与有效磷含量(Y)呈极显著负相关(r = －
0. 922＊＊，P ＜ 0. 01) ，线性回归方程为 Y = － 205. 3X
+ 1385. 8。以上结果表明，初筛获得的 11 株溶磷菌
株产生的酸性物质有助于这些菌株溶磷能力的提
高。
溶磷菌株在 NBRI-BPB 液体摇培4 d后，发酵液
OD600值与有效磷含量之间存在一定相关性。相关
分析表明，发酵液 OD600值(X)与有效磷含量(Y)呈
极显著负相关(r = － 0. 914＊＊，P ＜ 0. 01) ，线性回归
方程为 Y = － 300. 55X + 107. 67。这说明采用
NBRI-BPB 培养基摇培4 d后测定发酵液 OD600值可
以相对准确、快速的从大量的供试溶磷菌株中筛选
出具有溶磷能力较强菌株，在一定程度上大大减少
后续复筛的工作量。
2. 3 高效溶磷细菌的鉴定
2. 3. 1 溶磷细菌的形态特征:对 4 株高效溶磷细菌
的细胞形态和菌落特征进行观察，可以看出，菌株
CLW17 和 CHW10B 为无芽孢革兰氏阴性(G － )短
杆菌，菌落圆形、边缘整齐，表面湿润粘稠;菌株
JFW3 和 CHW10L 为芽孢革兰氏阳性(G +)短杆菌，
菌落圆形、表面干燥;菌落表面除菌株 CLW17 菌落
为浅黄色外，其余菌株均为乳白色;4 株溶磷菌株均
具有运动型，菌株 JFW3 和 CHW10L 为周生鞭毛，菌
株 CLW17 和 CHW10B 极生 1 － 3 根鞭毛。
2. 3. 2 溶磷细菌的生理生化特性:对 4 株高效溶磷
细菌的各项生理生化鉴定项目包括:氧化酶、接触
酶、明胶水解、淀粉水解、丙二酸盐利用、柠檬酸盐利
792
Jiahong Ren et al． / Acta Microbiologica Sinica(2012)52(3)
用、吲哚试验、M． R、V． P、硝酸盐还原、脓青素和荧
光色素的检出、卵磷脂酶等。菌株 CLW17、JFW3、
CHW10B 和 CHW10L 的各项生理生化鉴定结果见
表 2。每个生理生化鉴定实验重复 3 次，结果稳定;
其中分别将四株南方红豆杉根际高效溶磷细菌在
Kings B 平板上划线，置 30℃，培养 24 h后，菌株
CLW17 菌落周围产生可扩散的色素，在波长 366 nm
紫外光下菌落呈现浅绿色荧光，菌落周围显示青色
质蓝色荧光(图 1-A) ;菌体在荧光显微镜下观察具
自发荧光(图 1-B) ，而另外三株溶磷细菌则无此特
性。以上说明菌株 CLW17 极有可能是能够自发荧
光的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
2. 3. 3 溶磷细菌的 Biolog 鉴定:4 株高效溶磷细菌
在 Biolog 鉴定板培养 16 － 24 h时的读数相似值
(SIM 值)均大于 0. 50，符合 Biolog 系统关于理想结
果的要求，菌株 CLW17、JFW3、CHW10B、CHW10L
分别鉴定为荧光假单胞(P． fluorescens)、蜡状芽胞
杆 菌 (Bacillus cereus)、草 木 樨 中 华 根 瘤 菌
［Sinorhizobium(Ensifer)meliloti］和地衣芽胞杆菌
(B． licheniformis)。该结果与形态特征、生理生化鉴
定结果一致。
表 1 11 株溶磷细菌的初筛和溶磷能力测定
Table 1 The Determination of phosphate-dissolving ability of 11 strains of PSB
Strain OD600 pH value
Available phosphorus
content /(mg /L)
Phosphorus-dissolving
rate /%
The site of isolation
CMW07 － 1. 001 f 4. 31 bcd 357. 21 e 6. 65 the nursery of Changzhi Forestry Bureau
CLW02 － 1. 077 ef 4. 35 bcd 474. 32 c 8. 99 the yard of Changzhi Forestry Bureau
CLW17 － 2. 050 a 3. 80 g 647. 67 a 12. 46 the yard of Changzhi Forestry Bureau
JFW01 － 1. 234 cd 4. 27 d 573. 12 b 10. 97 Fenghuang Canyon of Lingchuan
JFW3 － 1. 312 c 3. 98 f 635. 21 a 12. 21 Fenghuang Canyon of Lingchuan
JFW13 － 1. 195 cde 4. 30 cd 489. 67 c 9. 30 Fenghuang Canyon of Lingchuan
CHW10B － 1. 921 ab 3. 90 f 638. 86 a 12. 28 Daxia Canyon of Changzhi
CHW10L － 1. 872 b 3. 96 f 622. 12 a 11. 95 Daxia Canyon of Changzhi
MHW04 － 1. 236 cd 4. 15 e 552. 77 b 10. 56 Menghe
MHW07 － 1. 149 def 4. 38 bc 408. 24 d 7. 67 Lishan
LSW08 － 1. 035 f 4. 40 b 401. 12 d 7. 52 Lishan
CK 0 g 6. 83 a 24. 67 f / /
Date with different letters are significantly different at 0. 05 level in the same according to a LSD test．
2. 3. 4 16S rDNA 鉴定:以菌株 CLW17、JFW3、
CHW10B、CHW10L 的总 DNA 为模板，使用一对细
菌通用引物分别扩增出长约 1500 bp、1515 bp、
1448 bp和1403 bp的片段，将所测 16S rDNA 序列登
陆 http:/ /www． EzTaxon． org 进行 BLAST 比对，获得
同源性数值，运用 ClustalX 软件进行分析，形成一个
多重复匹配列阵，利用 MEGA5. 05 采用 Neighbor-
Joining 法构建系统发育树。4 个菌株通过 BLAST
比对，都能在数据库中找到同源性非常高的相似菌
株序列。菌株 CLW17、JFW3、CHW10B、CHW10L 分
别与假单胞菌属、芽胞杆菌属、中华根瘤菌属(剑菌
属)和芽胞杆菌属具有较高的序列相似性。从图 2
的发育树可以看出，菌株 CLW17、JFW3、CHW10B、
CHW10L 得遗传进化距离分别与 P． fluorescens、B．
cereus、S． meliloti 和 B． licheniformis 亲缘关系较近。
因此，综合 4 株溶磷细菌的培养特征、生理生化特
性、Biolog 鉴 定 和 系 统 发 育 分 析 结 果，分 别 将
CLW17、JFW3、CHW10B、CHW10L 准确鉴定为 P．
fluorescens、B． cereus、S． meliloti 和 B． licheniformis。
表 2 高效溶磷细菌生理生化特性
Table 2 The Physiological and biochemistry characteristics
of the five efficient PSB strains
Strains CLW17 JFW3 CHW10B CHW10L
Demand for oxygen + + + +
Oxidase + － + －
Catalase + + + +
Gelatine liquefaction + － － +
Starch － + － +
Propionate utilizing + + － +
Citratre utilization + + － －
Indole roduction + + － +
Methyl red － － － －
Voges-proskauer + + + +
Nitrate production + － + +
Pyocyanine production － － － －
Fluorochrome production + － － －
Lecith inase － + － －
“ －”means negative;“ +”means positive．
892
任嘉红等:南方红豆杉根际溶无机磷细菌的筛选、鉴定及其促生效果 ． /微生物学报(2012)52(3)
图 1 菌株 CLW17 荧光特性
Fig． 1 The Feature of Fluorescence of CLW17
strain under UV (366nm ) (A ) and under
Fluorescence Microscope by Leica DM5000B(B)．
2. 4 高效溶磷菌株对南方红豆杉实生苗的促生作
用
在温 室 条 件 下，将 溶 磷 效 果 最 好 的 菌 株
CLW17、JFW3、CHW10B 和 CHW10L 分别接种于南
方红豆杉实生苗，接种后 150 d 测定苗高和地径。
结果如表 3 显示，接种处理苗木的苗高和地径均超
过了不接种处理对照。尤其是苗高，接种处理显著
高于未接种处理。以上说明 4 株高效溶磷细菌对南
方红豆杉苗期具有明显的促生长作用。
3 结论和讨论
利用微生物途径调动土壤中磷的有效性，可提
高土壤中可溶性磷的营养水平，减少磷肥资源的浪
费。因此，如何提高土壤中有效磷含量，已成为当前
的研究热点。近年来，将溶磷微生物制成土壤磷素
活化剂用来提高植物磷素利用率成为国内外研究热
点。溶磷微生物除了能够使土壤中有效磷含量提
高，还能够改善土壤环境［6］。但溶磷微生物种类繁
多、溶磷机制复杂，溶磷微生物施入土壤后易受到土
壤性质、根际环境和植物种类等方面的影响，往往难
以发挥出高效的溶磷能力。因此，从特定植物的根
际环境中进行筛选，以获得与植物亲和性好、易于在
植物根际定殖的溶磷微生物菌株是当前有待于加强
的研究方向。
目前，有关溶磷微生物的分离、筛选和应用的研
究大都局限于农作物，在林木根际筛选和应用溶磷
微生物的报道极少。Liu 等从我国不同地区杨树根
际筛选获得多株溶无机磷细菌和溶有机磷细菌［17］。
南方红豆杉在我国分布广泛，土壤微生物资源丰富，
因此，从南方红豆杉根际土壤中分离、筛选高效溶磷
细菌，研究高效微生物菌肥，对调节土壤磷素的供需
矛盾，促进南方红豆杉人工林的生长和紫杉醇产业
的可持续性发展具有重要意义。
溶磷细菌在土壤中分布广泛，其中溶磷能力比
较强的主要是芽胞杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属
(Pseudomonas)。芽胞杆菌包括蜡状芽胞杆菌(B．
cereus)、地衣芽胞杆菌(B． licheniformis)、坚强芽胞
杆菌(B． firmus)、枯草芽胞杆菌(B． subtilis)、短小
芽胞 杆 菌 (B． pumilis)和 巨 大 芽 胞 杆 菌 (B．
megaterium)等;假单胞菌主要包括荧光假单胞菌
(P． fluorescens)、丁香假单胞菌(P． syringae)、恶臭
假单 胞 菌 (P． putida)、铜 绿 假 单 胞 菌 (P．
aeruginosa)等。
本研究从南方红豆杉根际共分离获得 4 株高效
溶无机磷菌株 CLW17、JFW3、CHW10B 和 CHW10L，
进行包括形态学特征、生理生化特性、Biolog 系统鉴
定及 16S rDNA 基因序列分析，分别鉴定为荧光假
单胞菌(P． fluorescent)、蜡状芽胞杆菌(B． cereus)、
草木樨中华根瘤菌(S． meliloti)和地衣芽胞杆菌
(B． licheniformis)。这 4 种溶磷细菌均有报道，是溶
磷细菌中较具应用潜力的菌种。温室接种试验结果
表明从南方红豆杉根际分离到得 4 株溶磷细菌对南
方红豆杉的苗期有较好的促生长效应。因此，可以
将这 4 株溶磷菌株作为研制南方红豆杉专用溶磷细
菌肥料的重点资源菌株。另外，4 株高效溶磷菌株
对南方红豆杉的长期接种效应及其促生机制还有待
于进一步深入研究。
992
Jiahong Ren et al． / Acta Microbiologica Sinica(2012)52(3)
图 2 依据 16S rDNA 基因序列构建的 4 株高效溶磷菌株的系统发育树
Fig． 2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of four efficient PSB strains． Numbers at the
nodes are the boottrap confidence values obtained after 1000 replicates． The scale bar corresponds to 0. 01
substitutions per nucleotide position． The GenBank accession numbers for nucleotide sequence data are
shown in the brackets．
表 3 4 株高效溶磷细菌对南方红豆杉实生苗生长的影响
Table 3 Effect of four efficient PSB strains on seedling growth of Taxus chinensis var． mairei
Strains Ground Diameter /mm Rate of increase /% Plant height /mm Rate of increase /%
CLW17 2. 14 ± 0. 24ab 7. 91 81. 21 ± 5. 30b 18. 45
JFW3 2. 18 ± 0. 37abc 9. 74 79. 95 ± 3. 39b 16. 61
CHW10B 2. 29 ± 0. 32bc 15. 01 83. 29 ± 4. 53b 21. 49
CHW10L 2. 46 ± 0. 36c 23. 56 82. 01 ± 4. 91b 19. 62
CK 1. 99 ± 0. 24a / 68. 56 ± 7. 35a /
Date with different letters are significantly different at 0. 05 level in the same according to a LSD test．
目前，微生物的溶磷机制存有多种观点，一般
认为是微生物向周围分泌质子、有机酸等物质。
有机酸既能降低 pH 值，又可与 Ca2 +、Fe2 +、Fe3 +、
Al3 +等离子螯合，从而使难溶性无机磷转化为可溶
003
任嘉红等:南方红豆杉根际溶无机磷细菌的筛选、鉴定及其促生效果 ． /微生物学报(2012)52(3)
性磷［18］。本文发现溶磷细菌溶磷量随 pH 下降而
增加，两者存在显著负相关关系，这与王岳坤［19］、
Seshadri S［20］研究结果基本一致;而林启美等［21］研
究认为培养介质 pH 值降低是溶磷的重要条件，但
不是必要条件;Thomas［22］、Varsha［23］和杨慧［24］等
的研究结果表明培养液的 pH 值下降与溶磷微生
物的溶磷量无直接关系;易艳梅［25］研究指出，微生
物分泌的多糖类物质在微生物溶磷过程中发挥着
重要作用。以上有关溶磷微生物溶磷机制的观点
多是基于研究中所采用的溶磷微生物菌株得出。
本研究中初筛选得到的 11 株溶磷细菌对难溶性
无机磷源的溶磷能力与发酵液 pH 存在负相关关
系，该结果与所采用 Sangeeta Mehta 和 Nautiyal 筛
选体系是分不开的。采用该体系进行初筛可以相
对快速的从南方红豆杉根系获得优良的高效溶磷
菌株，但许多研究表明溶磷微生物的溶磷机制复
杂，不同的溶磷微生物存在不同的溶磷机制。因
此该体系虽能快速获得优良溶磷菌株，但极有可
能漏筛了许多溶磷机制与有机酸分泌无关或关系
不密切的优良菌株。在今后的筛选工作中，应该
进行更多筛选体系的摸索，尽量采用多种筛选体
系才能更科学、更全面的获取大量优良的溶磷菌
株。另外，有关本研究中所采用的 4 株高效溶磷
细菌的溶磷机理尚需开展更深入的研究。
丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorhizal Fungi，
AMF)也是土壤微生物中重要的成员之一。本研
究室前期研究发现，AMF 可侵染南方红豆杉根部
形成典型的丛枝菌根［26］。近年来，许多研究已经
观察到 AMF 与植物次生代谢的相关性，AMF 能够
直接或间接地影响植物的次生代谢过程。目前在
药材栽培研究中应用 AMF 技术已经逐渐引起人们
的重视［27 － 28］。作为土壤微生物家族的成员，溶磷
细菌与菌根真菌之间有很多方面是相互影响的。
一些学者开展了溶磷细菌与菌根真菌的相互作用
及其对宿主植物生长和养分吸收影响的研究，指
出溶磷细菌与菌根真菌互作在增加磷素吸收和植
物的促生作用上优于单一接种时的效果［29］。在今
后的研究中，可开展南方红豆杉高效溶磷细菌和
AMF 人工接种的相关研究工作，为研制高效复合
型微生物菌剂，通过生物途径提高南方红豆杉繁
殖率以及紫杉醇资源瓶颈问题提供重要的理论指
导和实践应用价值。
参考文献
［1］ 张桂萍，张建国，茹文明 ． 山西蟒河南方红豆杉群落
和种群结构研究 ． 山西大学学报 (自然科学版)
(Journal of Shanxi University (Natural Science
Edition) ) ，2003，26(2) :169-172．
［2］ Collin HA． Secondary product formation in plant tissue
cultures． Plant Growth Regulation，2001，34:119-134．
［3］ 高银祥，于景华，祖元刚，张学科，常影，庞海河 ． 不同
激素处理对南方红豆杉扦插苗的影响 ． 中国农学通
报(Chinese Agricultural Science Bulletin) ，2009，25
(1) :93-96．
［4］ Bojinova D，Velkova R， Ivanova R． Solubilization of
Morocco phosphorite by Aspergillus niger． Bioresource
Technology，2008，99:7348-7353．
［5］ Oliveira CA，Alves VMC，Marriel IE，Gomes EA，Scotti
MR，Carneiro NP，Guimar珓aes CT， Schaffert RE， Sá
NMH． Phosphate solubilizing microorganisms isolated
from rhizosphere of maize cultivated in an oxisol of the
Brazilian Cerrado Biome． Soil Biology and Biochemistry，
2009，41:1782-1787．
［6］ 朱培淼，杨兴明，徐阳春，欧阳红，沈其荣 ． 高效溶
磷细菌的筛选及其对玉米苗期生长的促进作用 ． 应
用生 态 学 报 (Chinese Journal of Applied Ecology) ，
2007，18 (1) :107-112．
［7］ Chung H，Park M，Madhaiyan M，Seshadri S，Song J，
Cho H，Sa T． Isolation and characterization of phosphate
solubilizing bacteria from the rhizosphere of crop plants of
Korea． Soil Biology ＆ Biochemistry，2005，37:1970-
1974．
［8］ Hameeda B，Harini OP，Rupela OP，Wani SP，Reddy
G． Growth promotion of maize by phosphate-solubilizing
bacteria isolated from composts and macrofauna．
Microbiological Research，2008，163(2) :234-242．
［9］ 赵小蓉，林启美，李保国 ． 溶磷菌对 4 种难溶性磷酸
盐溶 解 能 力 的 初 步 研 究 ． 微 生 物 学 报 (Acta
Microbiologica Sinica) ，2002，42 (2) :104-109．
［10］ Mehta S， Nautiyal CS． An Efficient Method for
Qualitative Screening of Phosphate-Solubilizing Bacteria．
Current Microbiology，2001，43:51-56．
［11］ 鲁如坤 ． 土壤农业化学分析方法 ． 北京:中国农业科
技出版社，2000
103
Jiahong Ren et al． / Acta Microbiologica Sinica(2012)52(3)
［12］ 李娟，王文丽，卢秉林，郭天文 ． 甘肃省河西高钙土
溶磷菌筛选及其溶磷能力初步研究 ． 干旱地区农业
研究(Agricultural Research in the Arid Areas) ，2008，26
(2) :8-9．
［13］ 东秀珠，蔡妙英 ． 常见细菌系统鉴定手册 ． 北京:科
学出版社，2001．
［14］ Sambrook J，Fritsch ED，Maniatis T． Molecular cloning:
a laboratory manual， 3rd edn． Cold Spring Harbor
Laboratory Press，New York． 2001:155-164．
［15］ Weisburg WG，Barns SM，Pelletier DA，Lane DJ． 16S
ribosomal DNA amplification for phylogenetic study．
Journal of Bacteriology，1992，173:697-703．
［16］ Chun J，Lee JH，Jung Y，Kim M，Kim S，Kim BK，
Lim YW． EzTaxon: a web-based tool for the
identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA
gene sequences． International Jounal Systematic and
Evolutionary Microbiology，2007，57，2259-2261．
［17］ Liu H， Wu XQ， Ren JH， Ye JR． Isolation and
identification of phosphobacteria in poplar rhizosphere
from different regions of China． Pedosphere，2011，21
(1) :90-97．
［18］ 冯月红，姚拓，龙瑞军 ． 土壤解磷菌研究进展 ． 草原
与草坪 (Grassland and Turf) ，2003，(1) :3-7．
［19］ 王岳坤，于飞，唐朝荣 ． 海南生态区植物根际解磷细
菌 的 筛 选 及 分 子 鉴 定 ． 微 生 物 学 报 (Acta
Microbiologica Sinica) ，2009，49(1) :64-71．
［20］ Seshadri S， Ignacimuthu S， Lakshminarasimhan C．
Effect of nitrogen and carbon sources on the inorganic
phosphate solubilizing by different Aspergillus niger
strains． Chemical Engineering Communications，2004，
191(8) :1043-1052．
［21］ 林启美，王华，赵小蓉，赵紫鹃 ． 一些细菌和真菌的
解 磷 能 力 及 其 机 理 初 探 ． 微 生 物 学 通 报
(Microbiology) ，2001，28(2) :26-29．
［22］ Thomas GV． Occurrence and ability of phosphate-
solubilizing fungi from coconut plant soils． Plant and
Soil，1985，87:357-364．
［23］ Varsha N，Patel HH． Aspergillus aculeatus as a rock
phosphate solubilizer． Soil Biochemistry，2000，32:559-
565．
［24］ 杨慧，范丙全，龚明波，李全霞 ． 一株新的溶磷草生
欧文氏菌的分离、鉴定及其溶磷效果的初步研究 ． 微
生物学报(Acta Microbiologica Sinica) ，2008，48(1) :
51-56．
［25］ 易艳梅，黄为一 ． 产多糖溶磷细菌对难溶性 Ca-P 的
活化特性 ． 南京农业大学学报(Journal of Nanjing
Agricultural University) ，2008，31(2) :49-54．
［26］ 任嘉红，张静飞，刘瑞祥，李玉琴 ． 南方红豆杉丛枝
菌根(AM)的研究 ． 西北植物学报(Acta Botanica
Boreali-Occidentalia Sinica) ，2008， 28 (7) :1468-
1473．
［27］ 谭钜发，黄京华，扶蓉，杜金子 ． 接种 AM 真菌对四
种药用植物生长的影响研究初报 ． 中药材(Journal of
Chinese Medicinal Materials) ，2009，32(6) :843-845．
［28］ Hortencia GMV， Omar OJ， Luc D， Gerardo MS，
Jaquelina GC， Fred TD， Víctor OP． Arbuscular
mycorrhizal fungi enhance fruit growth and quality of
chile ancho (Capsicum annuum L． cv San Luis)plants
exposed to drought． Mycorrhiza，2006，16:261-267．
［29］ Barea JM，Azcon R，Hayman DS． Possible synergistic
interactions between Endogone and phosphate-solubilizing
bacteria in low-phosphate soils． In:Sanders FE，Mosse
B，Tinker PB (eds)Endomycorrhizas． Proc Symp Univ
Leeds． New York:Academic Press，1975
203
任嘉红等:南方红豆杉根际溶无机磷细菌的筛选、鉴定及其促生效果 ． /微生物学报(2012)52(3)
Screening， identification， and promoting effect of
phosphate-solubilizing bacteria in rhizosphere of Taxus
chinensis var． mairei
Jiahong Ren1* ，Hui Liu2，Xiaohui Wu1，Qing Wang1，Yingyu Ren1，Yajing Liu1，
Yulong Feng1
1Department of Biological Science and Technology，Changzhi College，Changzhi 046011，China
2 College of Environmental Science and Engineering，Anhui Normal University，Wuhu 214000，China
Abstract:［Objective］ Phosphate-solubilizing bacteria (PSB)were isolated，screened and identified from the rhizosphere
of Taxus chinensis var． mairei，and growth-promoting effects on T． chinensis var． mairei by high effective PSB were
determined． ［Methods］By using selective culture media，PSB were isolated from rhizospheric soil，the high effective
PSB was further screened using NBRI-BPB medium，and the molybdenum-antimony anti-spectrophotometric method was
applied to determine the phosphate-dissolving ability of the high effective PSB after four days fermentation in NBRIP
medium． Bacteria were identified by the Biolog system combined with 16S rDNA gene sequence analysis and
morphological，physiological and biochemical characteristics． The inoculation test in potted seedlings was carried out
under the greenhouse． ［Conclusion］ Four strains of high effective PSB were screened and identified as Pseudomonas
fluorescens，Bacillus cereus，Sinorhizobium meliloti and Bacillus licheniformis，respectively． These strains had significant
effects on improving the growth of the seedlings of T． chinensis var． mairei．
Keywords:Taxus chinensis var． mairei，phosphate-solubilizing bacteria，screening and identification，promoting effect
(本文责编:张晓丽)
Supported by the Natural National Science Foundation of China(31100471) and by the Program for Higher school Hi-tech Industry of Shanxi
Province (2110122)
* Corresponding author． Tel: + 86-355-2205276;E-mail:Renjiahong@ 163． com
Received:9 Novermber 2011 /Revised:
檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶檶
30 December 2011
《微生物学报》关于署名
经过本刊审查通过后即将发表的稿件，作者在修改时，如果对“作者或单位的署名”进行变更，与最初的投稿不同，本刊要
求:作者必须再提供有关证明，否则不能生效!此项规定早已公布在本刊的网页上、并且在本刊的纸质出版物中也多次公布。
请作者登陆本刊网页(http:/ / journals． im． ac． cn / actamicrocn) ，在首页内、“常见问题”中有显示，点开左侧的“署名”，其中有详
细的说明和办理方法。
(1)如变单位署名顺序，需要原研究内容所属单位(通常是第一署名单位)的证明信，证明内容:原署名顺序→现署名顺
序→盖章。
(2)如变更作者署名顺序，需要通讯作者和第一作者同意的签字证明。证明内容:原作者姓名及顺序→修改之后的作者
姓名及顺序。
(3)将此证明信返回编辑部(邮寄原件或扫描后 E-mail 发来) ，新的变更即可生效。
303