全 文 ：收稿日期:2007-01-26;修回日期:2007-03-29
基金项目:国家自然科学基金(20572076);教育部博士点基金(2050610016)
作者简介:梁海英(1980-),女,四川绵阳 ,硕士研究生在读 ,从事天然产物化学研究.
通讯作者:侯太平.E-mail:houtp@tom.com
文章编号:　0490-6756(2008)02-0446-05
瑞香狼毒对稻瘟病菌的抑制活性
及其机理的初步研究
梁海英 , 陶　科 , 张新刚 , 滕　云 , 侯太平
(四川大学生命科学学院 , 成都 610064)
摘　要:研究了瑞香狼毒的甲醇 ,乙酸乙酯和石油醚萃取物对稻瘟病菌的抑菌作用 ,实验结果
表明 ,乙酸乙酯萃取物对稻瘟病菌生长的抑制作用最强.进一步研究了乙酸乙酯萃取物对稻
瘟孢子的萌发和产孢量的抑制作用 ,结果显示在 1.750×10-3 g/mL ,12 h处理下对孢子萌发
的抑制率达 100%,在 2.016×10-3 g/mL 处理下对产孢量的抑制率为 95.20%.最后对乙酸
乙酯萃取物进行分段分离 ,研究结果发现 ,乙酸乙酯分段分离的四段萃取物中 ,对稻瘟的抑制
活性顺序是:Ⅲ>Ⅳ>Ⅱ>Ⅰ , Ⅲ段在 1.313×10-3 g/mL处理后的第 8 d抑制率达到 100%.
分别将乙酸乙酯Ⅲ段萃取物在 0.6560×10-3 g/mL 下处理稻瘟病菌 ,在倒置显微镜下观察到
处理组菌丝发生了变形扭曲 ,出现空管;处理组孢子横隔变的不明显 ,且表面有疱疹状突起;在
透射电镜下观察到细胞质凝集 ,质壁分离 ,线粒体消失 ,细胞器大量降解.
关键词:瑞香狼毒;稻瘟病菌;抑菌活性;抑菌机理
中图分类号:Q93　　　文献标识码:A
Studies on the inhibitory activity and mechanism of
Stellera chamaejasme L.to Pyricularia grisea
LIANG Hai-Y ing , TAO Ke , ZHANG X in-Gang , TENG Y un , HOU Tai-Ping
(College of Life Sciences , Sichuan University , Chengdu 610064 , China)
Abstract:The inhibito ry activity against py ricularia grisea of contents ex tracted from Stellera chamaejasme
by methanol , ethyl acetate and petroleum ether w as studied.The results showed that the ethyl acetate ex-
tracts had a best inhibitory activity on Pyricularia grisea.The sublevel contents w hich inhibitory activity se-
quences w ere :Ⅲ>Ⅳ>Ⅱ>Ⅰ ex tracted f rom ethyl acetate also were studied.The Ⅲ ex tract at 1.313×
10-3 g/mL could inhibi t the mycelia g row th at 100%even at the eighth day.Observed in the inverted micro-
scope , it was found that the mycelia had been deformed and the protoplasm dist ribution w as not homoge-
neous;the spore partitions had disappeared and the surface of the spores w ere outg row th as herpes shape.Ob-
served in the electronmicroscope , i t w as found that the cy toplasm w as concentrated , plasmolysis happened ,
many cell org anelles were disappered.
Key words:Stellera chamaejasme L., Pyricularia grisea , inhibitory act ivity , mechanism
2008年 4月 　
第 45卷第 2期　
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edit ion)
　 Apr.2008
Vol.45　No.2
1　引　言
水稻稻瘟病(Pyricularia grisea)是全世界稻
区危害最严重的水稻病害之一 ,又名稻热病 ,俗称
火烧瘟 、吊头瘟 、掐颈瘟等.该病一年四季均可对
水稻造成危害 ,其危害遍及水稻的各个部位 ,有苗
稻瘟 、叶瘟 、叶枕瘟 、节稻瘟 、穗颈瘟 、枝梗瘟和谷粒
瘟等 , 一般造成水稻减产 10%～ 20%.据估计 ,
1975 ～ 1990年由稻瘟病引起的全球粮食损失高达
1.57亿吨[ 1] .目前用于防治稻瘟病菌的药剂主要
有:三环唑 、富士一号 、稻瘟净 、异稻瘟净和克瘟散
等.
瑞香狼毒(Stel lera chamaejasme L .)广泛分布
于我国青藏高原及其它高寒地区[ 2] ,牲畜误食可
导致死亡 ,影响畜牧业 ,是一种需要防除的草地有
毒植物.经本实验室前期研究发现它对菜青虫具
有拒食活性[ 3] ,对某些菌具有抑制活性[ 4] .本实验
优选了瑞香狼毒的乙酸乙酯萃取物 ,发现其对稻瘟
病菌具有较强的抑制活性 ,并对其抑制机理进行了
初步研究 ,这有望将瑞香狼毒这种有毒有害植物变
废为宝 ,并开发成一种新型的植物源抑菌剂 ,对今
后农药的理论研究和生产实践应用等方面具有一
定的科学价值和生态意义.
2　材料与方法
2.1　材　料
2.1.1　实验菌株　稻瘟病菌(Pyricularia grisea)
由四川省农科院提供.
2.1.2　供试药剂 　瑞香狼毒(S tel lera chamae-
jasme L.)石油醚 、乙酸乙酯和甲醇萃取物 ,由本实
验室前期制备.主要仪器:水浴搅拌器 ,柱层析硅
胶 , RE-52AA型旋转蒸发仪 , U-PMTVC型倒置显
微镜(Olympus),H2600型透射电镜.
2.2　方　法
2.2.1　不同萃取物对稻瘟病菌的抑菌作用的初步
测定　将淀粉酵母培养基与不同浓度的瑞香狼毒
石油醚 、乙酸乙酯和甲醇萃取物(均用丙酮溶)分别
充分混合 ,制成浓度梯度分别为 12.50×10-3 g/
mL , 6.250 ×10-3 g/mL , 3.125 ×10-3 g/mL 和
1.563×10-3 g/mL ,之后倒平板 ,分别用丙酮和无
菌水作空白对照.置于 37 ℃温箱中挥发丙酮 3 d ,
之后加 0.5 mL 的稻瘟病菌菌液(菌丝用玻璃珠打
散)于平板上 ,并用推棒推匀.在 28 ℃恒温箱中培
养.3 d之后待对照组开始生长时观察菌丝生长情
况.
2.2.2　孢子液的制备　加 5 mL 的 1%吐温-20
于平板中 ,用毛笔将生长在固体培养基上面的孢子
轻轻刷下 ,并用纱布过滤掉菌丝 ,然后用 1%吐温-
20稀释孢子液(显微镜下每个视野 100个左右),
置于试管中待用.
2.2.3　乙酸乙酯萃取物不同浓度药液的配制　将
乙酸乙酯萃取物加无菌水在超声波下破碎 ,采用二
倍稀释法用水稀释成 7.000×10-3 g/mL ,3.500×
10-3 g/mL ,1.750×10-3 g/mL , 0.8750×10-3 g/
mL 和 0.4380×10-3 g/mL 共 5个浓度 ,置于试管
中待用.
2.2.4　观察乙酸乙酯萃取物处理孢子悬浮液时对
孢子萌发的影响　取不同浓度的乙酸乙酯水溶液
于凹玻片上 ,每个浓度点 3个孔.然后用滴管将稻
瘟病菌孢子悬浮液滴加到每个含药的孔中 ,并用一
次性针头搅拌混匀药物和孢子液.将凹玻片置于
含有湿滤纸的大平皿中保湿 ,每隔 2 h在普通光学
显微镜下观察孢子的萌发情况 ,按公式(1)计算孢
子萌发抑制率.
2.2.5　乙酸乙酯萃取物对稻瘟病菌产孢量的影响
加 5 mL 的1%吐温-20于平板中 ,分别将含药浓分
别为 4.032 ×10-3 g/mL , 2.016 ×10-3 g/mL ,
1.008×10-3 g/mL 和 0.5040×10-3 g/mL 平板上
的孢子用毛笔轻轻刷下 ,用 1%土温-20 稀释 , 取
0.1 mL 于凹玻片上在光学显微镜下观察孢子个
数 ,每个浓度点 3个孔观察计数.
2.2.6　乙酸乙酯粗提物过中柱　在硅胶柱中加
乙酸乙酯粗提物 ,加洗脱剂顺序分别为:V(正己烷
∶乙酸乙酯)=2∶1;乙酸乙酯;V(乙酸乙酯∶甲醇)
=1∶1 ,用三角瓶收集各段溶液 ,用薄层析硅胶板检
测 ,将极性相似段合并分成四段 ,即 Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ ,
再用旋转蒸发仪蒸干.
2.2.7　各段萃取物对稻瘟病菌的抑制活性测定　
采用生长速率法[ 5] .称取各段萃取物各 0.2100 g ,
加 10 mL 丙酮稀释 ,再用二倍稀释法稀释成 5 个
梯度浓度.取 4 mL 梯度浓度药液与 16 mL 固体
培养基充分混合.37 ℃挥发丙酮 3 d ,之后接直径
为 7 mm 的稻瘟病菌团于平板中 , 3 d后 ,待对照组
开始生长后用十字交叉法测定菌丝生长直径 ,按公
式(2)计算菌丝生长抑制率.
447第 2期 梁海英等:瑞香狼毒对稻瘟病菌的抑制活性及其机理的初步研究 　
菌丝生长抑制率(%)=对照组菌丝生长直径-处理组菌丝生长直径对照组菌丝生长直径 ×100% (2)
2.2.8　乙酸乙酯萃取物处理稻瘟病菌的形态镜检
　倒置显微镜:分别将乙酸乙酯 Ⅲ段萃取物在
0.6560 g/mL 下处理菌丝和孢子混合物 ,在倒置显
微镜下观察孢子菌丝形态在给药前后的变化.
透射电镜:分别将用乙酸乙酯 Ⅲ段萃取物
0.6560 g/mL 处理后的菌丝和孢子混合物与对照
组加入离心管中 , 用 1500 ～ 2000 r/min 离心 15
min ,弃去上清液.用吸管沿管壁缓慢加入 0.3%
戊二醛固定液 , 4 ℃静置 15 ～ 30 min.再用 10000
～ 13000 r/min 离心 10 min ,弃去上清液.用吸管
沿管壁缓慢加入 3%戊二醛 ,再用 1%四氧化锇固
定 ,丙酮逐级脱水 , Epon812树脂包埋 ,超薄切片 ,
醋酸铀及枸橼酸铅双重染色 ,H2600型透射电镜观
察菌丝和孢子在细胞壁 ,细胞膜 ,细胞质内含物 ,孢
子横隔等生理结构上药物处理前后所发生的变化 ,
分析药物作用的主要部位并探究机理.
3　实验结果与分析
3.1　不同萃取物对稻瘟病菌的抑制活性
由表 1初步可以看出 ,三种萃取物对稻瘟病菌
的抑制效果中以乙酸乙酯萃取物最强 ,在 1.563×
10-3 g/mL下对稻瘟的生长都还有较强的抑制作
用 ,石油醚次之 ,甲醇最弱 ,可以初步确定狼毒抑制
稻瘟病菌的活性成分在乙酸乙酯萃取物中.因此
进一步对乙酸乙酯萃取物的活性成分进行深入研
究.
表 1　瑞香狼毒的不同萃取物对稻瘟病菌的抑制活性
Tab.1　Antifungal activity of different extracts from S tellera chamaejasme L.
瑞香狼毒的不同提取物 含药浓度(×10
-3 g/mL)
12.50 6.250 3.125 1.563
甲醇 +-- ++- +++ +++
乙酸乙酯 --- --- --- +--
石油醚 +-- +-- ++- +++
丙酮溶剂对照 +++ +++ +++ +++
空白对照 +++ +++ +++ +++
+++:表示生长很好;++-:表示生长一般;+--表示生长较少;---表示没有生长
3.2　乙酸乙酯萃取物对稻瘟病菌孢子萌发的抑制
由表 2可以看出 ,乙酸乙酯萃取物对稻瘟孢子
的萌发有极强的抑制作用 ,在 1.750×10-3 g/mL
下 12 h的抑制率都为100%,此时对照组的孢子几
乎全部萌发.
表 2　乙酸乙酯萃取物对稻瘟病菌孢子萌发的抑制率(%)
Tab.2　The inhibitory effects of ethyl acetate ex tract against spo res of Pyricularia grisea
处理浓度(×10-3 g/mL) 2 h 4 h 6 h 8 h 10 h 12 h
7.000 100 100 100 100 100 100
3.500 100 100 100 100 100 100
1.750 100 100 100 100 100 100
0.875 100 100 100 98.68 97.21 93.9
0.438 100 91.43 88.76 90.26 81.73 75.69
CK 0 0 0 0 0 0
3.3　乙酸乙酯萃取物对稻瘟病菌产孢量的影响
乙酸乙酯萃取物在 4.032×10-3 g/mL , 2.016
×10-3 g/mL ,1.008×10-3 g/mL , 0.5040×10-3
g/mL 下对稻瘟产孢的抑制率分别为 98.63%,
95.20%, 88%, 64.90%,随着浓度的增加抑制率增
大.
3.4　乙酸乙酯分段萃取物对稻瘟病菌生长的影响
为了找出乙酸乙酯对稻瘟病菌抑制的活性成
分 ,本研究通过洗脱剂的极性由弱到强进行梯度洗
脱将乙酸乙酯粗提物分成四段 ,由图 1可以看出这
四段萃取物中 Ⅲ段的抑制作用最强 ,在 1.313 ×
10
-3
g/mL 下第 8 d 的抑制率仍然是 100%,说明
瑞香狼毒的抑菌活性成分主要分布在 Ⅲ段中 ,即中
性偏极性一段.
448 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷
图 1　乙酸乙酯分段分离对稻瘟病菌生长的抑制
Fig.1　The inhibitory effects of different composing ex tracted fromethy l acetate ex tract against Pyricularia grisea
(a)Ⅰ段萃取物对稻瘟病菌的抑制率;(b)Ⅱ段萃取物对稻瘟病菌的抑制率;
(c)Ⅲ段萃取物对稻瘟病菌的抑制率;(d)Ⅳ段萃取物对稻瘟病菌的抑制率
4.5　乙酸乙酯萃取物处理稻瘟病菌后形态观察
在倒置显微镜下观察(如图2所示):A ,B为正
常稻瘟病菌孢子和菌丝;C , D为药物处理后的孢
子和菌丝.可以观察到正常稻瘟病菌孢子有明显
的横隔 ,其菌丝原生质和核均匀;经药物处理后其
孢子横隔消失 ,且孢子出现疱疹样突起.菌丝扭曲
变形 ,出现空管.
图 2　处理组菌丝和孢子与对照组菌丝和孢子
Fig.2　The structure change of Pyricularia grisea observed in the inver ted microscope
A 、B为正常稻瘟病菌孢子和菌丝;C 、D 为药物处理后的孢子和菌丝
　　在透射电镜下观察(如图 3所示):A为正常孢
子和菌丝横截面 ,可以看到完整的细胞结构和均匀
的细胞质分布;B为药物处理后的孢子和菌丝横截
面 ,可以观察到处理后稻瘟病菌的孢子和菌丝细胞
壁和膜均完整 ,未观察到内容物溢出的现象 ,有可
能是因为瑞香狼毒的主要成分是脂类物质二帖环
氧内酯 ,伞形花内酯[ 6] 等 ,而真菌细胞膜也是由脂
质构成 ,所以采用渗透而非破坏膜完整性的方式进
入细胞.此外还明显的观察到菌丝细胞质凝集 ,细
胞器大量降解 ,线粒体完全消失 ,有可能是药物具
有直接溶解内膜系统及细胞器的能力;也有可能是
破坏了溶酶体等消化性的细胞器致使其内容物外
449第 2期 梁海英等:瑞香狼毒对稻瘟病菌的抑制活性及其机理的初步研究 　
流 ,细胞自溶.或者是激发了胞内的某种内源性溶
解降解机制 ,致使线粒体降解 ,细胞质凝集而膜完
整等一系列自发衰老的现象.
图 3　电镜下观察瑞香狼毒Ⅲ段萃取物对照组和处理组对稻瘟病菌的影响
Fig.3　The ultra structure change of Pyricularia grisea after dealing with the ex tracts
4　讨　论
(1)从瑞香狼毒的乙酸乙酯萃取物对稻瘟病
菌的抑制活性来看 ,不管是对菌丝生长 ,孢子萌发
还是稻瘟病菌的产孢量量都有极强的抑制 ,乙酸乙
酯的分段萃取物中 , Ⅲ段在 1.313×10-3 g/mL 处
理后的第 8 d抑制率仍然为 100%,由此可以看出
瑞香狼毒是一种极具开发价值的生物农药.
(2)稻瘟病菌对水稻的浸染主要依靠分生孢
子形成的芽管分化成一种特殊休眠结构即附着胞.
附着胞产生侵染栓穿透角质和表皮细胞壁 ,继而在
寄主细胞中生长 ,侵染邻近表皮细胞并深入叶肉细
胞 ,5 ～ 7 d 后出现症状 ,分生孢子梗分化 ,形成分
生孢子重复侵染[ 7 ,8] .本实验发现瑞香狼毒乙酸乙
酯萃取物对稻瘟孢子的萌发和产生都有较强的抑
制作用 ,这就从根本上达到了对稻瘟病的控制.
(3)由于观察到了明显的胞质凝集 ,线粒体降
解而细胞膜仍然完整等现象 ,可以考虑从细胞凋亡
的角度进一步深入研究;从分子水平来说是否阻止
了稻瘟病菌的某个代谢途径 ,还是抑制了某种酶的
含量 ,或是抑制了某条信号传导途径都还有待进一
步研究.
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[责任编辑:白林含]
450 四川大学学报(自然科学版) 第 45卷