全 文 ：中国中西医结合杂志 2011 年 9 月第 31 卷第 9 期 CJITWM，September 2011，Vol． 31，No. 9 ·1243·
基金项目:浙江省自然基金项目(No． Y2081051) ;浙江省中医药管
理局重点项目 (No． 2009ZA003)
作者单位:1．浙江中医药大学附属第一临床医学院肿瘤科(杭州
310006) ;2．杭州师范大学附属医院肿瘤科(杭州 310015)
通讯作者:舒琦瑾，Tel:13605706566 ，E-mail:shuqjhz@ yahoo． com． cn
南方红豆杉水提物诱导人肺癌 A549 细胞凋亡
及其分子机制的实验研究
舒琦瑾1 李 萍2 王彬彬1
摘要 目的 探讨南方红豆杉水提物诱导人肺癌 A549 细胞的凋亡作用及其分子机制。方法 采用噻
唑蓝(MTT)法检测南方红豆杉水提物对 A549 细胞的增殖抑制作用;以光镜、电镜、膜联蛋白Ⅴ-FITC PI(An-
nexin Ⅴ-FITC /PI)标记法检测细胞凋亡;以蛋白印迹法分析南方红豆杉水提物对细胞外信号调节蛋白激酶
1 /2(ERK1 /2) ，c-jun氨基未端激酶 1 /2(JNK1 /2)和生存素(survivin)蛋白表达的影响。结果 南方红豆杉
水提物能抑制 A549 细胞的增殖;南方红豆杉水提物处理 A549 细胞后，光镜与电镜下可见到明显的凋亡细
胞;Annexin Ⅴ-FITC /PI标记法的定量检测进一步证实了南方红豆杉水提物诱导细胞凋亡的作用;蛋白印迹
检测表明南方红豆杉水提物能使 survivin表达下降，对 ERK1 /2 和 JNK1 /2 表达无影响。结论 南方红豆杉
水提物能显著抑制 A549 细胞增殖，诱导细胞凋亡，主要通过调节 survivin蛋白的表达来实现。
关键词 南方红豆杉;人肺癌 A549 细胞;凋亡
Experimental Study on Apoptosis Induced by Aqueous Extract of Taxus chinensis in Human Pulmonary
Carcinoma Cell A549 and Its Molecular Mechanisms SHU Qi-jin，LI Ping，and WANG Bin-bin Department
of Oncology，The First Affiliated Hospital of Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou (310006)
ABSTRACT Objective To investigate the apoptosis inducing effects of aqueous extract of Taxus chinensis
(AETC)in human lung cancer cell A549 and its molecular mechanisms． Methods Using MTT assay，the inhibi-
tion of AETC on the proliferation of A549 cells was detected． The apoptosis was detected by light and electron
microscopy，and Annexin Ⅴ-FITC /PI staining． The expressions of ERK1 /2，JNK1 /2，and survivin were ana-
lyzed by Western blot． Results AETC could inhibit the proliferation of A549 cells． Obvious apoptotic cells could
be seen under light and electron microscope in AETC treated A549 cells． AETCs induction on the cell apoptosis
was further confirmed by Annexin Ⅴ-FITC /PI labeled quantitative detection． Western blot assay showed that
AETC could decrease the survivin expressions． AETC showed no effects on ERK1 /2 or JNK1 /2 protein expres-
sions． Conclusion AETC could significantly inhibit the proliferation of A549 cells and induce the apoptosis，which
was mainly achieved through regulating the expressions of survivin．
KEYWORDS Taxus chinensis;human pulmonary carcinoma cell A549;apoptosis
细胞凋亡是机体生长发育、细胞分化和病理状态
中细胞自主性死亡的过程，是机体保持自稳的一种重
要的方式。近年来，人们通过对细胞凋亡及其机制的
研究，发现肿瘤的发生、发展及产生耐药，与细胞凋亡
有密切关系［1］。因此，诱导肿瘤细胞发生凋亡是目前
进行肿瘤控制与治疗的可行方法之一，也是筛选抗癌
药物的指标之一［2］。
红豆杉是红豆杉科红豆杉属植物总称，是世界上
公认的濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物。红豆杉性味
苦、平，有小毒，归心经。功效消肿散结，主治肿瘤、肾
病、风湿等。目前已经从红豆杉中分离出 400 多种化
合物，包括紫杉烷类化合物和少量的非紫杉烷类化
合物［3］。
水煎提取物是中药应用的传统方式及目前临床应
用的主要形式。红豆杉水煎剂已在临床广泛应用，且
安全有效，但目前国内外尚未见应用红豆杉水提物抑
制肿瘤的研究报道。
本课题通过对南方红豆杉水提物的研究，验证其
对人肺癌 A549 细胞诱导凋亡作用，进一步阐明南方
红豆杉水提物的抗肿瘤作用，为天然药物南方红豆杉
的开发提供理论和实验依据。
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材料与方法
1 细胞系及细胞培养 人肺腺癌细胞株 A549，
购自中国科学院上海细胞生物学研究所。以体积分数
为 10%的胎牛血清 F12-K培养液，在 37℃、体积分数
为 5%的 CO2 培养箱中培养，细胞呈贴壁生长，实验时
均取对数生长期细胞。
2 药物及制备 南方红豆杉(8g /袋，购自浙江省
中医院中药房，宁波泰康红豆杉生物工程有限公司生
产)。参考文献［4］方法，将 80 g 南方红豆杉置于医用
不锈钢锅，浸泡过夜，加 8 倍水煮沸 30 min，倒出药液，
后加8倍水煮沸20 min，再加5倍水煮沸20 min，将3次
药液经真空抽滤器过滤，置于电磁炉上浓缩至约 100
mL后于旋转蒸发仪上 80 ℃水浴中浓缩成约 40 mL 药
液，入真空干燥箱中干燥，得浸膏，按 100%浓度计算得
率。取1 g南方红豆杉水提物，其中加入10 mL超纯水，
溶解后，经高速冷冻离心机 12 000 r /min 离心 15 min，
取上清液，再经 0. 22 μm微孔滤膜除菌，制成母液浓度
100 mg /mL，于 －20 ℃冰箱备用。顺铂［DDP，20 mg(冻
干型) ，购自德州德耀制药有限公司，批号:H20023236］:
使用时由生理盐水溶解配制成所需浓度。
3 主要试剂及仪器 细胞培养基 F12-K 培养液
(美国 GIBCO公司) ;Hylcone胎牛血清(美国 Thermo公
司) ;MTT粉(美国 Sigma公司) ;二甲基亚砜(美国 Sim-
ga公司) ;戊二醛、锇酸、乙醇、乙酮、柠檬酸铅、醋酸双氧
铀(宁波波太化工有限公司) ;0. 25%胰酶 EDTA(吉诺
生物医药技术有限公司) ;Annexin V-FITC /PI 细胞凋亡
双染试剂盒(美国 Invitrogen 公司) ;Survivin 一抗(美国
Cell Signaling Technology 公司) ;ERK1 /2、JNK1 /2、β-ac-
tion一抗，羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗(美国 Santa Cruz 公
司) ;RIPA 裂解液(瑞士 Roche 公司) ;化学发光试剂
A、B(美国 Millipore 公司) ;96 孔板(美国 CORNING 公
司) ;FACS Calibur 流式细胞仪(美国 BD 公司) ;ES-
HK02型侧摆脱色摇床(江苏碧云天生物技术研究所) ;
BX20型荧光显微镜摄像机(日本 Olympus 公司) ;Rei-
chert超薄切片机 (奥地利 Reichert-Jung 公司) ;JEM-
1230型透射电镜(日本 JEOL公司)。
4 MTT药物敏感性试验 收集对数生长期细胞，
调整细胞悬液浓度约 5 ×104 /mL，接种于 96 孔板，每孔
加入100 μL，24 h后加入以 F12-K培养液配制的南方红
豆杉水提物，终浓度分别为 0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5、3. 0
mg /mL，并设空白组和 200 μg /mL 顺铂阳性对照组(简
称 DDP组) ，每浓度设 3 个复孔。培养 24 h 后，每孔加
入 20 μL MTT溶液(5 mg /mL，即 0. 5%MTT) ，再培养 4
h，每孔加入 100 μL 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡
10min，使结晶物充分溶解。在 ElX808酶标仪 490nm波
长处测量各孔的吸光值(OD 值)。实验重复 3 次。按
下列公式计算细胞生长抑制率:细胞生长抑制率(%)=
(1 －实验组吸光度值 /对照组吸光度值)× 100%。剂量
和效应关系用药物浓度抑制软件(LOGIT 法)版本
1. 0. 0求半数抑制率(IC50)。
5 细胞凋亡形态学观察 在 BX20型荧光显微镜
下观察培养瓶中的活细胞，并于电镜下行超微结构观
察。细胞经 2. 5%戊二醛和 1%锇酸双固定，梯度乙醇
和丙酮脱水，将细胞包埋，Reichert 超薄切片机切片，行
柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀 50%乙醇饱和溶液各染色
15min，即可在 JEM-1230型透射电镜下观察并拍照。
6 以 Annexin V-FITC /PI标记法定量检测细胞凋
亡 细胞用 0. 25%胰蛋白酶消化，吹起后收集，1640
培养液清洗 2 次，于 4℃ 1 000 r /min 离心 10 min。离
心后弃上清，加入结合 buffer 100 μL，重悬细胞，加入
AV 染液 5 μL，PI染液 1 μL，避光 15 min，用 FACS Cal-
ibur流式细胞仪检测，并用随机软件进行数据分析。
7 Western blot 检测 用裂解液处理收集细胞，以
蛋白提取液样品作聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后
转膜，封闭后加入一抗(抗体稀释浓度为 1∶ 1 000)孵育
2 ～3h，TBST洗膜 3次，每次 10 min;加入二抗(抗体稀释
浓度为 1∶ 2 500)，TBST洗 3次，每次 10 min，浸于适量化
学发光试剂中(A液∶ B液 1∶ 1)1 min，取出，室温条件下干
燥并用保鲜膜包置于暗盒中，压片曝光 3 ～10 min，洗片。
8 统计学方法 采用 SPSS 13. 0 统计软件，计量
资料采用x ± s表示，多组间比较采用 F 检验，P ＜ 0． 05
为差异有统计学意义。
结 果
1 MTT法药物敏感试验 南方红豆杉水提物处
理 A549细胞 24 h 后，对 A549 细胞增殖有明显的抑制
作用，且随着药物浓度的增加，其抑制作用逐步增强，呈
明显的剂量—效应关系，6 组浓度分别为 0. 5、1. 0、1. 5、
2. 0、2. 5、3. 0 mg /mL，其抑制率分别为 4. 87%，14. 62%，
20. 87%，35. 75%，51. 70%，81. 24%，且各浓度组与空白
组比较，差异有统计学意义(P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，计算
IC50值为 2. 2 mg /mL，DDP组的抑制率为 70. 46%，以后
选 2. 0、2. 5、3. 0 mg /mL为研究浓度。
2 细胞凋亡形态学观察 (1)倒置显微镜观察:
红豆杉水提物 2. 0、2. 5、3. 0 mg /mL处理 A549 细胞 24
h后与正常细胞比较，随着红豆杉水提物剂量增加，
A549 细胞增殖受抑制，形态发生明显变化，细胞出现
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皱缩、坏死，呈典型凋亡表现(图 1A-D)。(2)透射电
镜观察:红豆杉水提物 2. 0、2. 5、3. 0 mg /mL 处理 A549
细胞 24 h后，结果显示:与空白组(正常细胞)比较，随
着红豆杉水提物剂量增加，A549 细胞形态发生明显变
化，出现细胞核固缩，细胞核碎裂，凋亡小体形成等凋亡
的典型形态学改变(图 2A-D)。
注:A为空白组;B为 2. 0 mg /mL南方红豆杉水提物处理组;C
为 2. 5 mg /mL南方红豆杉水提物处理组;D 为 3. 0 mg /mL 南方红
豆杉水提物处理组
图 1 倒置显微镜观察结果 (无染色，× 100)
3 各组细胞凋亡流式细胞仪定量检测结果(表
1，图 3) 与空白组比较，经药物处理 24 h后的细胞早
注:A为空白组(×10 000) ;B为2. 0 mg /mL南方红豆杉水提物处理
组(×8 000) ;C为 2. 5 mg /mL南方红豆杉水提物处理组(×5 000) ;D为
3. 0 mg /mL南方红豆杉水提物处理组(×30 000)
图 2 透射电镜观察结果
期凋亡的比例均有明显升高，差异有统计学意义(P ＜
0. 01) ，且早期凋亡的比例呈现一定的剂量—效应关系。
表 1 南方红豆杉水提物对 A549 细胞凋亡的影响 (%，x ± s)
组别 n UL UF LL LF
空白 3 0． 01 ± 0． 01 8． 86 ± 0． 15 85． 25 ± 1． 44 4． 63 ± 0． 64
DDP 3 0． 09 ± 0． 01 6． 49 ± 0． 08 58． 38 ± 1． 70 35． 09 ± 2． 00*
HDS 2． 0 mg /mL 3 0． 07 ± 0． 01 29． 00 ± 0． 30 48． 74 ± 2． 50 22． 13 ± 6． 53*
2． 5 mg /mL 3 0． 19 ± 0． 02 25． 97 ± 1． 05 34． 09 ± 1． 02 38． 81 ± 2． 56*
3． 0 mg /mL 3 1． 17 ± 0． 01 34． 29 ± 1． 12 12． 09 ± 3． 12 50． 22 ± 1． 07*
注:UL为单核细胞;UF 为坏死 +晚期凋亡;LL 为正常活细胞;LF 为早期凋
亡;HDS为南方红豆杉水提物;与空白组比较，* P ＜0． 01
注:A:空白组;B:DDP组;C:2． 0 mg /mL南方红豆杉水提物处理组;D:2. 5 mg /mL南方红豆杉水提物处理组;E:3． 0 mg /mL南方
红豆杉水提物处理组
图 3 各组细胞凋亡流式细胞仪定量检验结果
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4 Western blot检测结果(图 4，表 2) 分别收集
南方红豆杉水提物 2． 0、2. 5、3． 0 mg /mL 作用 24 h 的
A549 细胞及空白组细胞，提取总蛋白，检测凋亡相关
蛋白 ERK1 /2、JNK1 /2、Survivin 的表达。与空白组比
较，随着红豆杉水提物剂量增加，ERK1 /2、JNK1 /2 蛋
白无明显变化，Survivin蛋白逐渐减少。
注:1 为空白组;2 为 2． 0 mg /mL南方红豆杉水提物处理组;3 为
2. 5 mg /mL南方红豆杉水提物处理组;4 为 3． 0 mg /mL 南方红豆杉
水提物处理组
图 4 Western blot检测不同浓度南方红豆杉水提物处理
A549 细胞后 ERK1 /2、JNK1 /2、Survivin的蛋白印迹分析
表 2 不同浓度南方红豆杉水提物处理 A549 细胞后 ERK1 /2、
JNK1 /2、Survivin的蛋白印迹分析 (x ± s)
组别 n β-actin ERK1 /2 JNK1 /2 Survivin
空白 3 23． 11 ± 1． 17 24． 06 ± 0． 96 24． 47 ± 1． 44 44． 10 ± 1． 84
HDS 2． 0 mg /mL 3 23． 89 ± 1． 64 24． 41 ± 1． 71 24． 56 ± 2． 51 32． 44 ± 3． 53*
2． 5 mg /mL 3 28． 23 ± 1． 07*26． 45 ± 1． 51 28． 41 ± 1． 57 16． 37 ± 2． 52＊＊
3． 0 mg /mL 3 22． 76 ± 1． 08 22． 84 ± 2． 12 22． 22 ± 3． 12 8． 08 ± 1． 01＊＊
注:HDS为南方红豆杉水提物;与空白组比较，* P ＜0． 05，＊＊P ＜0． 01
讨 论
细胞凋亡是受基因调控、也受外界其他因素影响
和制约的细胞主动死亡过程［5］。随着肿瘤分子生物
学研究的深入，人们认识到肿瘤的发生和发展不仅与
肿瘤细胞的增殖、分化异常有关，而且同细胞凋亡的调
控失常有关。因此，设法诱导肿瘤细胞的凋亡已成为
一种新的治疗方向［2］。
本研究结果表明，南方红豆杉水提物处理人肺癌
A549 细胞后，细胞呈现明显的凋亡形态;AnnexinV-
FITC标记法对凋亡细胞的定量检测结果亦显示，南方
红豆杉水提物具有较强的诱导肺癌 A549 细胞凋亡的
作用。
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein
kinase，MAPK)信号系统是一组非常保守的丝氨酸
(苏氨酸)双重磷酸化蛋白激酶系统。它存在于大多
数原核生物和所有真核生物中，在信号传递的过程
中占据着相当重要的地位。MAPK 信号传导通路采
用高度保守的三级激酶级联传递信息，即 MAPK 激
酶的激酶(MAPK kinase kinase，MKKK)激活，MAPK
激酶(MAPK kinase，MKK)激活，MAPK 激活。MAPK
有多个亚家族，其中较为确定的，在细胞功能中发挥
重要 作 用 的 有 细 胞 外 信 号 调 节 蛋 白 激 酶
(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)、c-
jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和
P38 分裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated pro-
tein kinase，P38MAPK)。
ERK-1 和 ERK-2 是第一个被克隆并鉴别出的
MAPK家族的成员［6］，主要传递细胞丝裂原信号，参与
调节细胞周期及促进细胞增殖分化。一般认为，
ERK1 /2 通路在促进细胞增生、分化以及抑制细胞凋
亡中发挥重要作用。
JNK信号传导途径在细胞应激反应中起重要作
用，并被多种细胞外应激信号激活，因而 JNK 又被称
为应激活化蛋白激酶(SAPK)。当暴露于以下情况时
被激活:脂多糖、炎症介质白介素-1 或肿瘤坏死因子、
电离或紫外线辐射、热休克或高渗压力等。激活的
JNK可调控许多 3末端翻译区域(UTR)富含 AU元件
(AURE)基因的半衰期，从而增强这些基因 mRNA 的
翻译过程。
本实验通过Western blot检测发现与空白组比较，
随着红豆杉水提物剂量增加，ERK1 /2，JNK1 /2 蛋白无
明显变化，提示南方红豆杉水提物在诱导 A549 细胞
凋亡过程中，并没有引起 ERK1 /2、JNK1 /2 通路蛋白
量的变化。同时我们还发现随着红豆杉水提物剂量增
加，Survivin蛋白量逐渐减少。
Survivin基因属于凋亡抑制蛋白(inhibitor of ap-
optosis protein，IAP)基因家族新成员，是分子量最小
的 IAP，也是迄今发现的最强的凋亡抑制因子［7］，具
有抑制细胞凋亡，调控细胞周期及参与血管形成的
作用。Survivin 主要通过 4 种方式直接或间接抑制
Caspase 活性而抗凋亡，(1)Survivin 能抑制由 Fas /
Caspase-8 和 Bax /细胞色素 C 诱导的 Caspase 活化和
凋亡，可能通过作用于各个凋亡途径的汇聚点，即直
接抑制终末效应蛋白 Caspase-3 和 Caspase-7 从而抑
制凋亡［8］;也有学者认为 Survivin 不是直接作用于
Caspase-3，可能结合 Caspase-9 从而抑制其活性，阻
断 Caspase-9 依赖的细胞凋亡信号传导［9］。(2)Sur-
vivin 可与辅助性线粒体源性 Caspase 激活因子(sec-
ond mitochondria derived activator of caspase，Smac)结
合，Smac是一种通过结合 IAP 保护 Caspase 活性的
蛋白［10］，Survivin 与 Smac 结合并与之对抗抑制
Caspase 活性。(3)Survivin 通过对抗 Smac 的作用，
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保护其它 IAP 家族成员如 X染色体连锁的凋亡抑制
蛋白免受 Smac 抑制而维持它们的抗凋亡功能，从而
增强 IAP 家族成员的功能［11］。(4)Survivin 可通过
非 Caspase 依赖细胞凋亡的途径抑制细胞凋亡，如参
与调节 p53 依赖的凋亡［12］。因此，Survivin在肺癌的
发生、发展及转化中扮演重要角色可能是一个有潜
在价值的肺癌诊断指标和治疗靶点。
分析南方红豆杉水提物诱导凋亡的机制，可能是
通过抑制凋亡蛋白 Survivin 的表达，进而直接或间接
抑制 Caspase 活性，从而发挥诱导凋亡的作用。
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