全 文 ：收稿日期:2005-11-13
基金项目:四川省应用基础研究项目(03JY029-083-2);教育部新世纪人才支援计划 NCET(04-0868)
作者简介:龚晓霞(1981-), 女 ,湖北武汉 , 硕士研究生在读 ,从事天然产物化学研究.
＊通讯作者.E-mail:houtp@tom.com
文章编号:　0490-6756(2006)03-0697-05
瑞香狼毒根中抑菌活性成分的研究
龚晓霞1 ,李文娟1 ,欧阳秋1 ,王泓2 ,候太平1 , ＊
(1.四川大学生命科学学院 , 成都 610064;2.四川大学华西第二附属医院 , 成都 610041)
摘要:研究了瑞香狼毒(S tellera chamaejasme L.)对病原真菌石膏样毛癣菌的抑制作用 ,并对
其活性成分进行了分离纯化.采用无水乙醇浸提瑞香狼毒根粉 ,并用不同极性溶剂进行依次萃
取 ,结果表明乙酸乙酯萃取物具有较强的抑菌活性 ,其最低抑菌浓度(MIC)为312.5mg·L-1.
然后采用硅胶柱对乙酸乙酯萃取物进行分段柱层析 ,并结合活性跟踪获得一高活性化合物 ,其
最低抑菌浓度(M IC)为 9.8mg·L-1.
关键词:瑞香狼毒;抑菌活性;石膏样毛癣菌;最低抑菌浓度(M IC)
中图分类号:Q946;Q93　　　文献标识码:A
瑞香狼毒(S tel lera chamaejasme L.)俗称断肠草 ,为瑞香科狼毒属植物 ,是当前中国草地上危害较严
重的毒草之一.但是瑞香狼毒又具有可利用的一面.其根是传统中药狼毒的基质 ,有逐水 、祛痰 、破积 、杀虫
之功效[ 1] .目前 ,国内外对其化学成分[ 2]以及杀虫活性[ 3-6] 、抗癌活性[ 7]都有了深入的研究和报道.有文
献表明瑞香狼毒对于植物病原菌也有较好的抑制作用[ 8] .本文中 ,我们用临床上常见的皮肤癣菌石膏样
毛癣菌为供试菌 ,对瑞香狼毒根的抑菌作用及活性成分进行了研究 ,这为以瑞香狼毒为材料研制开发新型
天然抗真菌类新药奠定了基础.
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1 　供试植物样品　瑞香狼毒采自四川若尔盖草原 ,根洗净 ,切碎 ,50℃烘干后过 40目筛粉碎 ,备用.
1.1.2　供试菌种　石膏样毛癣菌(Trichophyton gypsum)(由四川省皮肤病性病防治研究所提供).
1.1.3　培养基　沙堡氏琼脂培养基 .
1.1.4　仪器和试剂　薄层层析硅胶板(烟台汇友硅胶开发有限公司);柱层析用硅胶(青岛海洋化工厂);
HPLC高效液相色谱仪(美国Waters公司);所用溶剂均为分析纯 ,HPLC所用的甲醇为色谱纯;达克宁霜
剂(乳剂型的白色软膏 ,每克含硝酸咪康唑 0.02g ,西安杨森制药有限公司产品 ,批号:H61020001).
1.2　试验方法
1.2.1　植物样品的提取　取狼毒根粉末加入 10倍重量的溶剂依次用无水乙醇 、丙酮∶石油醚(体积比为
1∶1)、甲醇冷浸 24 h ,45℃水浴搅拌 8 h ,过滤 ,减压浓缩后得到三种提取物.合并这三种提取物得到总提取
物.
1.2.2　活性成分的分离纯化　用石油醚 、乙酸乙酯 、90%甲醇分别对总提取物进行萃取 ,重复萃取 3 ～ 5
次 ,将萃取液浓缩得到 3种萃取物:石油醚萃取物 、乙酸乙酯萃取物 、90%甲醇萃取物.活性测定结果显示 ,
2006年 6月
第 43卷第 3期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan Universi ty (Natural Science Edition)
Jun.2006
Vol.43　No.3
乙酸乙酯萃取物的抑菌活性最强.采用乙酸乙酯萃取物上大柱 ,溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-丙酮(体积
比为 3∶3∶2 、1∶2∶1 、1∶10∶1)、乙酸乙酯-丙酮(体积比为 4∶1),梯度洗脱 ,经薄层检测 ,分段收集得 4 个流
分 ,各流分分别进行生物活性测定 ,选择活性最好的流分进行中柱细分 ,依次采用氯仿-乙酸乙酯(体积比
为 3∶1)、乙酸乙酯进行洗脱 ,获得 3个流分 ,选择活性最好的流分进行小柱柱层析分离 ,依次采用氯仿-乙
酸乙酯(体积比为 20∶1 、15∶1 、10∶1)进行梯度洗脱 ,获得 6个流分 ,分别进行生物活性测定.
1.2.3　活性测定[ 9] 　抑菌活性测定采用试管内药基法测定最低抑菌浓度(M IC).将样品以丙酮做溶媒稀
释成一系列浓度 ,空白对照(CK)为相应的溶媒丙酮 ,加入装有融化的琼脂培养基的试管中 ,混合均匀后放
置成斜面 ,置于 37℃培养箱中静置待丙酮挥发完全后划线接种 ,然后置于 37℃恒温培养箱中培养.以空白
对照长出大量菌落为参照 ,5 ～ 7d后观察各菌生长情况 ,以有无真菌生长为指标 ,确定无菌生长的最低药
物浓度为该样品的最低抑菌浓度(M IC).
2　结果与分析
分别对总提取物及其石油醚萃取物 、乙酸乙酯萃取物和 90%甲醇萃取物进行了抑菌活性测定 ,活性
结果见表 1 、表 2所示.
表 1　总提取物对石膏样毛癣菌的抑菌作用＊
Tab.1　Antifungal activity o f the total extractfrom S tellera chamaejasme L.
样品浓度(g·L-1) 200 100 50 25 12.5 6.25 3.125
总提取物 - - - - + + +
　　　　　＊:“ -”表示无真菌生长“ +”表示有真菌生长(下同)
表 2　不同极性溶剂萃取物对石膏样毛癣菌的抑菌作用
Tab.2　Antifungal activity ofother ex tracts from Stellera chamaejasme L.
样品 样品浓度(g·L
-1)
10 5 2.5 1.25 0.625 0.3125 0.1563
石油醚萃取物 - - - - + + +
乙酸乙酯萃取物 - - - - - - +
90%甲醇萃取物 - - + + + + +
　　从表 1可以看出总提取物对供试菌有一定的抑制作用.从表 2可见乙酸乙酯萃取物对石膏样毛
癣菌的最低抑菌浓度(M IC)为 312.5 mg·L-1 ,抑制作用显著优于石油醚萃取物和 90%甲醇萃取物.因此
下一步将乙酸乙酯萃取物进行分段柱层析 ,收集四段洗脱流分 ,分别为A 、B 、C 、D ,薄层层析检测结果见图
1.各流分经浓缩干燥后进行活性测定 ,结果见表 3.
表 3　大柱层析流分对石膏样毛癣菌的抑菌作用
Tab.3　The antifungal activity of the composing against Trichophy ton gypsum
样品 样品浓度(g·L-1)
0.625 0.3125 0.1563 0.0781 0.0391 0.0195
A - - - - - +
B - - - + + +
C - - + + + +
D + + + + + +
　　表 3结果显示 ,大柱流分 A的抑菌活性最好 ,其 MIC值为 39.1 mg·L-1 ,故将 A进行中柱细分 ,
收集得到三段洗脱流分 A1 、A2 、A3 ,薄层层析检测结果见图 2.浓缩后干燥 ,并进行活性测定 ,结果见表 4.
698 四川大学学报(自然科学版) 第 43卷
表 4　中柱层析流分对石膏样毛癣菌的抑菌作用
Tab.4　The antifungal activity of the composing against Trichophy ton gypsum
样品 样品浓度(g·L
-1)
0.3125 0.1563 0.0781 0.0391 0.0195 0.0098
A1 - - - - - +
A2 - - - + + +
A3 - - + + + +
　　根据上述结果可知 ,中柱流分 A1具有较好的生物活性 ,对其进行进一步分离纯化 ,分段收集获得 6
个流分 ,分别为 A1-1 、A1-2 、A1-3 、A1-4 、A1-5 、A1-6.薄层层析检测结果见图 3 ,生物活性测定结果见表 5.
临床药物达克宁霜剂对石膏样毛癣菌的 M IC测定结果见表 6.A1-5和达克宁霜剂对石膏样毛癣菌的活性
测定结果如图 4所示.
699第 3期 龚晓霞等:瑞香狼毒根中抑菌活性成分的研究
表 5　小柱层析流分对石膏样毛癣菌的抑菌作用
Tab.5　The antifungal activity of the composing against Trichophy ton gypsum
样品 样品浓度(g·L-1)
0.1563 0.0781 0.0391 0.0195 0.0098 0.0049 0.0025
A1-1 - + + + + + +
A1-2 - - - - + + +
A1-3 - - - - + + +
A1-4 - - - + + + +
A1-5 - - - - - + +
A1-6 - - + + + + +
表 6　达克宁霜剂对石膏样毛癣菌的抑菌作用
Tab.6　The antifungal activity of M iconazole Nitrate Cream against Trichophyton gypsum
样品浓度(mg·L-1) 39.10 19.50 9.80 4.90 2.50 1.25 0.625 0.313
达克宁霜 - - - - - - + +
从表 5可以看出 ,小柱分离的流分 5的活性最好 ,其 MIC 值为 9.8 mg·L-1.从表 6可以看出临床药
物达克宁霜剂对石膏样毛癣菌的 M IC 为 1.25mg·L-1.通过比较表明流分 5具有较高活性.
流分 5为淡黄色油状物 ,薄层层析板上检测为一单点(如图 5所示),在紫外灯下呈现强烈荧光.经反
相薄层板检测(展开剂为甲醇)和 HPLC 反相柱层析检测(色谱条件:分析柱为 Apollo C18(5 μm , 250 mm
×4.6 mm),流动相为甲醇溶液 ,流动相流速为 1.0 mL/min ,检测波长为 291 nm),结果见图 6所示.综合
分析表明 ,流分 5为一高纯度物质.这为结构的分析和下一步的实验打下坚实的基础.
3　讨论
有文献表明瑞香狼毒能治疗皮肤病 ,如用狼毒枣治疗寻常型银屑病 ,总有效率达 90.6%;用狼毒水煎
液外洗 ,对多种瘙痒性皮肤病均有明显止痒作用;用狼毒与蒲公英 、芜花 、生军各等分研成细末 ,醋调外敷
患处 ,治疗多种体表化脓性皮肤病 ,收效颇佳;将狼毒等用凡士林调成狼毒软膏 ,可杀虫止痒 ,消除疥疮结
节.
700 四川大学学报(自然科学版) 第 43卷
石膏样毛癣菌 ,是浅部真菌中有代表性的一种真菌 ,是我国引起皮肤癣病的常见病菌.皮肤癣菌病在
我国较为常见 ,北方约占皮肤科门诊量 10%,南方则更多.本文研究表明从瑞香狼毒中分离到的活性成分
在较低浓度时即可抑制石膏样毛癣菌的生长 ,这为利用瑞香狼毒研制天然抗皮肤癣菌新药提供了重要依
据.
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The Research on Antifungal Constituents from the Root of
Stellera chamaejasme L.
GONG Xiao-xia1 , LI Wen-juan1 , OUY ANG Qiu1 ,
WANG Hong
2 , HOU Tai-ping1
(1.College of life Science , Sichuan University , Chengdu 610064 , China;
2.West China Second Hospi tal , Sichuan University , Chengdu 610041 , China)
Abstract:The antifungal activity of Stellera chamaejasme L.against Trichophy ton gypsum was studied , and
the antifungal constituents were isolated and purified.The minimum inhibitory concentration (MIC)of the
ex traction by dipping , sy stematic ext raction f rom the root of Stellera chamaejasme L.was determined.The
results showed that ethyl acetate ex tract f rom Stellera chamejasme L.had signif icant antifungal activity , and
the minimum inhibito ry concentration(M IC)against Trichophy ton gypsum was 312.5mg·L-1.A high puri-
ty and high act ive ingredient w as isolated by chromatog raphy , and the minimum inhibito ry concentration
(M IC)was 9.8 mg·L-1.
Key words:Stel lera chamaejasme L.;antifungal activity;Trichophy ton.gypsum;minimum inhibito ry concen-
tration (M IC)
701第 3期 龚晓霞等:瑞香狼毒根中抑菌活性成分的研究