全 文 ： 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (6): 927−931 · 927 ·




活性数据离散分布下的瑞香狼毒抗肿瘤活性成分筛选研究
杨乾栩 1, 程孟春 1, 王 莉 1, 阚晓溪 2, 朱晓新 2*, 肖红斌 1, 2*
(1. 中国科学院大连化学物理研究所, 中国科学院分离分析化学重点实验室, 辽宁 大连 116023;
2. 中国中医科学院中药研究所, 北京 100700)
摘要: 研究活性数据离散分布下的瑞香狼毒抗肿瘤活性部位和成分的筛选、提取及验证。分别采用 HPD
大孔树脂柱和聚酰胺柱获得具有成分差异的瑞香狼毒部位, 并用 MTT 法考察不同部位对人肺癌细胞 A549 的
抑制活性。结果显示, 不同部位的 A549 抑制活性呈现离散分布。权重分析表明, 色谱保留时间 33.97 min 成分
及 30～39 min 部位对 A549 抑制作用较大。活性实验表明, 30～39 min 部位要优于瑞香狼毒醇提物, 33.97 min 成
分在 100 μg·mL−1 水平内, 与阳性药顺铂作用相当, 但作用方式完全不同。在离散活性条件下, 权重分析方法对
中药活性成分或部位, 具有较好的筛选效果。
关键词: 瑞香狼毒; 离散活性数据; 权重分析; 活性成分; 抗肿瘤
中图分类号: R917 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2014) 06-0927-05
Antitumor components screening of Stellera chamaejasme L.
under the case of discrete distribution of active data
YANG Qian-xu1, CHENG Meng-chun1, WANG Li1, KAN Xiao-xi2, ZHU Xiao-xin2*, XIAO Hong-bin1, 2*
(1. CAS Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry, Dalian Institute of Chemical Physics,
Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China;
2. Institute of Chinese Materia Medica Academy, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

Abstract: This is to report the screening, extracting and validating antitumor components and compounds
from Stellera chamaejasme L. under the case of discrete distribution of active data. In this work, different
components from Stellera chamaejasme L. were collected by HPD macroporous resin and polyamide resin
column, and their antitumor activity on A549 were tested by MTT assay. Activity results indicate that activity
of components at 30−39 min is more potent than that of Stellera chamaejasme L. extract, and the activity of
components at 33.97 min is equivalent to positive drug, cis-platinum at 100 μg·mL−1, but with totally different
mode of action. Under the case of discrete activity, the weight analysis is capable of screening active
components and compounds from natural products.
Key words: Stellera chamaejasme; discrete-active data; weight analysis; bioactive component; antitumor

癌症是人类最主要的“杀手”之一, 抗癌药物的
发现, 一直是药物研究工作者的不朽使命。瑞香狼毒,

收稿日期: 2014-01-15; 修回日期: 2014-02-25.
基金项目: “重大新药创制”科技重大专项资助项目 (2011ZX09307-
002-01, 2013ZX09301307-004).
*通讯作者 Tel / Fax: 86-411-84379756, E-mail: hbxiao@dicp.ac.cn;
Tel / Fax: 86-10-64056154, E-mail: zhuxx59@163.com
瑞香科狼毒属植物狼毒 (Stellera chamaejasme L.) 的
干燥根, 俗名又叫断肠草, 其味苦辛, 性平, 具有逐水
祛痰, 破积杀虫之效, 在我国具有悠久的用药历史[1]。
现代药理表明, 瑞香狼毒提取物具有较强的抗肿瘤、
抗病毒、抗真菌、酶抑制等活性[2]。然而瑞香狼毒成
分复杂, 已报道的主要包括香豆素类、生物碱类、二
萜类和黄酮类[3, 4]。而相关的活性报道, 大部分集中
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在狼毒提取物的活性研究[5, 6], 单体活性研究相对偏
少, 其药效物质基础研究薄弱, 尚需要进一步挖掘。
谱效学研究是建立指纹谱与相应活性之间的关
系, 进而用于发掘中药有效成分或成分群[7, 8], 或基
于此的质量控制研究[9]。目前已有的谱效学相关研究,
大部分集中在采用回归建模为基础的方法[10, 11], 在
模型的基础上, 通过不同的策略实现活性成分的挖
掘。对于采用模型回归分析结合变量筛选的谱效学分
析方法, 其风险性在于对数据要求较为严格, 包括
① 离散点对结果影响较大。离域值较大的实验数据,
会使回归曲线向离散点偏移, 从而造成预测结果的
不准确; ② 活性数据要具有较好的连续性。连续性较
差的活性数据, 其构造的回归模型可信度较低。而目
前的中药分离手段相对较为粗犷, 分离能力有限, 导
致成分差异较为严重, 从而造成不同部位的活性差
异较大。另外由于生物活性的药效曲线特点, 尤其是
当药物作用为 S型药效曲线时, 随机获取组分的活性
往往呈现高低活性较多、适中活性较少的分布特点
(这里所说的活性高中低值是相对于所研究的中药而
言, 中药不同, 高中低活性的分布亦不同), 因而造成
了活性数据分布相对离散的特点。
本文针对中药部位活性差异较大的特点, 提出
了针对离散活性数据的活性成分筛选方法。将化学
计量学中的权重模型[12]引入并应用在瑞香狼毒的抗
肿瘤活性成分分析, 筛选出一个活性较高的部位和
一个化合物, 并对结果进行了验证, 取得了有意义的
结果。

材料与方法
药品与试剂 瑞香狼毒 (Stellera chamaejasme
L.) 药材, 由中国中医科学院中药研究所朱晓新研究
员提供, 并由何希荣副研究员鉴定为瑞香狼毒正品。
HPD100 大孔树脂和聚酰胺树脂购于沧州宝恩化工
有限公司。DMSO 和 MTT 购于 Amresco 公司。阳性
药注射用顺铂, 山东罗欣药业股份有限公司。DMEM
培养基购于 GIBCO 公司。胎牛血清购于杭州四季青
公司。胰蛋白酶购于 Solarbio 公司。乙腈和甲醇为色
谱纯试剂, 购于 Sigma 试剂公司。
实验仪器 美国Waters2690液相系统, 配有 PDA
检测器, 柱温箱, 自动进样器。美国 Waters DP400 制
备系统, 配有 DAD 检测器和手动进样器。实验用水
由 Milli-Q 制备 (Millipore, 美国)。酶标仪 (TECAN,
瑞士)。CO2 饱和湿度培养箱 (HEAL FORCE, 澳大利
亚)。
细胞株 A549 细胞株购于中国科学院典型培养
物保藏委员会细胞库 (上海)。细胞用含 10% 胎牛血
清的 DMEM 培养基培养, 置于 37 ℃、5% CO2 饱和
湿度培养箱孵育以供实验。
瑞香狼毒提取 称取 1 kg 瑞香狼毒药材, 用 7 L
80% 乙醇浸泡 (以浸没药材为准) 1 h 后, 回流提取
3次, 每次 2 h, 合并浓缩提取液至浸膏状即获得瑞香
狼毒提取物。
瑞香狼毒分段分离 HPD 大孔树脂分段分离部
位: 称取 HPD100 大孔树脂填料 69.5 g 装入内径
1.3 cm 的玻璃柱, 活化及水平衡后, 上样瑞香狼毒提
取物 2.9 g。分别用 3 倍柱体积的水、10% 乙醇、20%
乙醇, 依次 10% 递增至 80% 乙醇, 再用 100% 乙醇洗
脱。收集不同浓度乙醇洗脱部位后, 浓缩冻干获得
瑞香狼毒大孔树脂洗脱部位; 聚酰胺树脂分段分离
部位: 称取聚酰胺树脂填料 37.76 g 装入内径 1.3 cm
的玻璃柱, 活化及水平衡后, 上样瑞香狼毒提取物
3.36 g。其他分离条件与 HPD 大孔树脂操作相同。
分析色谱条件 采用 Capcell PAK C18 色谱柱
(250 mm × 4.6 mm, 5 μm, Shiseido)。流动相含乙腈 (A
相) 和水 (B 相), 梯度洗脱, 洗脱条件: A 相起始为
25%, 25 min 升至 50%, 40 min 升至 80%, 并维持至
55 min。流速 1 mL·min −1, 选择检测波长 290 nm, 进
样 20 μL。
制备色谱条件 采用Chromatorex C18 (250 mm ×
10 mm, 10 μm, Fuji), 60% 甲醇等度洗脱, 流速 18
mL·min−1, 选择检测波长 290 nm。
潜在活性部位及活性成分制备 针对 HPD 大孔
树脂的组分分离结果, 及30～39 min部位和33.97 min
成分的保留时间, 发展了它们的制备方法, 制备流程
如下: ① 将瑞香狼毒提取物过 HPD 大孔树脂分离柱,
分别用 60% 乙醇和 100% 乙醇洗脱, 收集 100% 乙醇
洗脱部位, 浓缩即获得 30～39 min 部位; ② 将 100%
乙醇洗脱部位过 HPD 大孔树脂分离柱, 分别用 80%、
90% 和 100% 乙醇洗脱, 收集 90% 乙醇洗脱部位; ③
将 90% 乙醇洗脱部位适当浓缩后, 用高效制备色谱
纯化, 即获得 33.97 min 成分。33.97 min 成分经核磁
初步鉴定为狼毒宁 B (chamaejasmenin B)。
A549 抑制实验 取对数生长期 A549 细胞, 常
规消化, 计数并调整细胞浓度为 5×104 个/mL, 取 96
孔细胞培养板, 每孔加入细胞悬液 100 μL, 于 37 ℃、
5% CO2 饱和湿度的培养箱中培养过夜后, 每孔分别
加入不同浓度的瑞香狼毒实验样品 100 μL, 每个浓
杨乾栩等: 活性数据离散分布下的瑞香狼毒抗肿瘤活性成分筛选研究 · 929 ·


度平行 3 个复孔。设立阴性对照 (每孔加入 100 μL
培养基) 和阳性对照组 (每孔加入不同浓度的顺铂
溶液 100 μL)。在 37 ℃、5% CO2 饱和湿度的培养箱
中培养 48 h 后, 每孔加入 5 mg·mL−1 MTT 15 μL,
4 h 后小心甩去孔内培养液并加入 DMSO 150 μL,
充分振荡溶解后于 570 nm 下酶标仪检测吸收度。分
段组分样品活性实验中, 各组分样品终质量浓度为
100 µg·mL−1, 验证实验的阳性对照药顺铂及验证样
品终质量浓度分别为 1.56、3.12、6.25、12.5、25、
50 和 100 μg·mL−1。计算细胞抑制率公式: 抑制率 =
(A 阴性对照组 − A 实验组) / (A 阴性对照组 − A 空白对照组) × 100%。
色谱数据预处理 将所有组分数据, 以文本形
式 (txt 格式) 导出后, 采用自编软件包 ChromP 进行
色谱峰对齐[13]及基线校正[14], 并输出峰表。
活性数据预处理 根据瑞香狼毒组分对 A549 抑
制活性, 按照如下方法分类: 活性小于 0.15的组分定
义分类为 −1 (低活性组), 活性大于 0.6 的组分定义分
类为 1 (高活性组), 其余组分定义分类为 0 (中等活性
组)。
权重分析 采用文献[11]中的权重分析公式:
C T
C C T T
C T
2 2
1 1
C T
22

1 1 1 1
( )
Weight
( )( )
n n
cj tj
c t
j
n n n n
t j tjc j cj
t tc c
n n
n x x
n n
n x xn x x
 
  







其中, C 和 T 分别代表所研究的两组, nC 和 nT 分
别表示两组的样本数, 要满足 nC + nT = n; j 代表某一
具体变量, 因此 xcj, xc’j, xtj和 xt’j分别代表 j 变量中, 每
组中具体的样本值。本文分组分别是 −1、0、1, 变量
是每一个具体的色谱时间点, 样本值则是具体的色
谱强度值。
变量权重公式从组间方差和组内方差两方面定
义了一个变量对两组分类的贡献大小。变量 j 权重值
越大, 则说明变量 j 对活性分组的分类作用比较大,
则可能是潜在的活性化合物。
权重分析采用自编软件 MultiDA[15]的 Weight
Analysis 模块进行分析。

结果
1 瑞香狼毒提取物及部位
经 HPD 大孔树脂和聚酰胺树脂分离, 共获得 20
个瑞香狼毒组分, 由于聚酰胺 10% 和 20% 乙醇洗脱部
位含量太少, 因此参与后续活性实验的实际只有18个
组分。图 1 是以瑞香狼毒提取物为代表的色谱图。

Figure 1 HPLC chromatogram of Stellera chamaejasme
L. extract. The main components were marked. Peaks 1:
Isomohsenone; 2: Isomer of mohsenone; 3: Isoneochamaejasmine
A; 4: Unknow; 5: Sikokianin A; 6: Sikokianin B; 7: Isomer of
sikokianin; 8: Unknow; 9: Chamaejasmenin B

2 A549 细胞活性考察
不同瑞香狼毒组分对A549抑制活性效果见图2。
不同瑞香狼毒组分具有差异较大的活性分布。对于
HPD组分, 活性较高部分位于 70% 至 100% 乙醇洗脱
部位; 对于聚酰胺组分, 活性较高部分分布在 40% 至
60% 乙醇洗脱部位。图 3 是组分活性数据的频率分布
图, 明显可见, 活性较高和活性较低的组分数量较多,
而活性适中的组分数量较少, 活性数据分布连续性
较差。呈现明显的两端样本多, 中间样本少的分布趋
势, 仅有 4 个组分活性在 15%～50% 之间。
3 色谱数据处理
通过 ChromP 软件处理后输出 18*3294 矩阵, 即
18 个瑞香狼毒组分样本, 3 294 个色谱时间扫描点, 每
一数据点为一峰强度。
4 变量权重分析
为了挖掘对高活性和低活性影响较大的部位或


Figure 2 A549 inhibitory activity of Stellera chamaejasme L.
components. From left to right in figure, HH to H10 represent
H2O, 10% ethanol to 100% ethanol components by macroporous
resin, and JH to J10 represent H2O, 10% ethanol to 100% ethanol
components by polyamide resin
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Figure 3 Frequency distribution of A549 inhibitory activity.
The x axis is the activity of all components, and the y axis is the
frequency that an activity occurs

化合物, 即对高活性和低活性分组具有较大区分能
力的化合物或部位, 因此以 −1 组和 1 组之间的权重
分析结果为主, 以 0 组和 1 组之间的权重分析结果为
辅助参考。
图 4 反映了权重分析的结果。从 −1 组和 1 组
(图 4A), 即高活性组和低活性组比较来看, 33.97 min
成分对高活性组和低活性组的区分能力较大, 表明
它可能具有较高的 A549 抑制活性, 而同时该成分
对 0 组和 1 组也具有较高的区分能力 (图 4B)。从图
4A 结合图 4B 来看, 30～39 min 部位的权重值整体上
优于其他部位, 表明该部位可能也具有较好的抑制
A549 活性。
另外, 从权重值来看, 33.97 min 成分对区分 −1 和
1 组的权重值达 5.8, 远高于包括 30～39 min 的其他
部位, 也从一定程度上提示 33.97 min 化合物的 A549
抑制活性优于 30～39 min 部位。


Figure 4 Weight analysis of different groups. A: Weight
analysis of groups −1 and 1; B: Weight analysis of groups 0 and
1. The greater the weight value it is, the more important the
corresponding components are
5 活性验证
图 5 比较了瑞香狼毒提取物中 30～39 min 部位、
33.97 min 成分和阳性药顺铂的药效。


Figure 5 A549 inhibitory activity comparison of Stellera cha-
maejasme L. extract, 30−39 min component, 33.97 min
compound and cis-platinum at different concentration levels

从图5来看, 整体呈现33.97 min化合物优于30～
39 min 部位、30～39 min 部位优于狼毒提取物的特点。
相对于狼毒提取物和 30～39 min 部位, 33.97 min 化
合物具有更小的起效浓度和更大的活性值, 从一定
程度上说明 33.97 min 化合物可能是 30～39 min 部位
的药效物质基础。通过比较 33.97 min 化合物和阳性
药顺铂的药效来看, 当作用浓度在 50 和 100 μg·mL−1
时, 二者具有基本相同的 A549 抑制率。而从药效曲
线来看, 33.97 min 化合物与顺铂完全不同, 33.97 min
化合物呈现典型的 S型浓度药效曲线, 而顺铂则表现
为双曲线型的浓度药效曲线, 表示二者可能具有不
同的药物作用方式[16]。
如果 33.97 min 化合物是瑞香狼毒抗 A549 的主
要药效物质基础, 由于它呈现了 S 型药效曲线, 这也
从一定程度上解释了瑞香狼毒组分活性呈现高低活
性较多、中等活性较少的离散分布特点。

讨论
基于变量筛选的中药活性成分筛选, 可以采用
回归或者判别的方法处理。对于回归的方法, 往往要
求数据分布均匀, 且受离异值影响较大。然而在实际
的生物活性实验中, 由于实验成本的限制, 数据点往
往较少; 且受药物本身作用方式的影响, 使得很多活
性数据分布较为离散。在这种条件下开展中药活性成
分筛选, 采用判别的方法比采用回归的方法更加稳
杨乾栩等: 活性数据离散分布下的瑞香狼毒抗肿瘤活性成分筛选研究 · 931 ·


健和高效。
权重分析是一种通过比较组内离差和组间离差,
从而确定变量对分组重要性程度的方法。离散活性数
据, 可以根据一定的原则转换为活性分组变量, 因此
对于离散活性情况下的中药活性成分筛选, 可以通
过权重分析的方法, 确定中药活性部位或成分。本文
采用权重分析的方法, 对瑞香狼毒抗 A549 活性进行
了活性成分筛选, 筛选出了 30～39 min 部位和 33.97
min 化合物, 并通过活性验证确定了所筛选部位和化
合物活性的优越性, 表明方法的有效性。
除可采用权重分析的方法筛选离散活性情况下
的中药活性成分外, 也可采用线性判别分析结合变
量筛选的其他模式识别方法, 具体方法的应用应根
据数据特点和需求进行选择。除此之外, 连续活性数
据的离散化后, 也可以采用权重分析处理, 但可能会
丢失部分数据信息。总之, 根据实验活性数据的特点,
选择适合的筛选方法, 不断完善谱效学的相关学科
盲点, 才能促进中药精简, 加快中药现代化。
References
[1] Sun X, Sun F, Wu P. Shennong’s Herbal (神农本草经) [M].
Beijing: Scientific and Technical Documentation Press, 1996.
[2] Liu W, Wang C. Research on chemical constituents, bioactivity,
and application of Stellera chamaejasme [J]. Drugs Clin (现
代药物与临床), 2010, 25: 26−30.
[3] Zhao L, Lou ZY, Zhu ZY, et al. Characterization of constituents
in Stellera chamaejasme L. by rapid-resolution liquid chroma-
tography-diode array detection and electrospray ionization
time-of-flight mass spectrometry [J]. Biomed Chromatogr,
2008, 22: 64−72.
[4] Su XL, Lin RC, Wong SK, et al. Identification and
characterisation of the Chinese herb Langdu by LC-MS/MS
analysis [J]. Phytochem Anal, 2003, 14: 40−47.
[5] Huo Q, Wang Y, Gao R, et al. Study on antioxidation for
extraction of total-flavonoid in Stellera chamaejsme L. in vitro
[J]. Anim Husb Feed Sci (畜牧与饲料科学), 2010, 31: 83−
85.
[6] Fan J, Jia Z, Xie J, et al. Serum-pharmacological effects
of Ruixiang Langdu (Stellera chamaejasme L.) abstract on
proliferation of hepatoma cells [J]. Med J Nat Defending
Forces Northwest China (西北国防医学杂志), 2000, 21: 90−
91.
[7] Chau FT, Chan HY, Cheung CY, et al. Recipe for uncovering
the bioactive components in herbal medicine [J]. Anal Chem,
2009, 81: 7217−7225.
[8] Yang Q, Liu Y, Wang L, et al. Screening of bioactive
components in epimedium for osteoporosis treatment by model
population analysis [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2012,
47: 1205−1209.
[9] Zhang Y, Yan D, Zhang P, et al. Quality control of Shua-
nghuanglian freeze-dried powder for injection based on its
HPLC-ELSD fingerprints and biological profiles [J]. Acta
Pharm Sin (药学学报), 2010, 45: 93−97.
[10] Lu H, Liang Y, Qian P. Profile-effect on quality control of
Houttuynia cordata injection [J]. Acta Pharm Sin (药学学
报), 2005, 40: 1147−1150.
[11] Dumarey M, van Nederkassel A, Deconinck E, et al.
Exploration of linear multivariate calibration techniques to
predict the total antioxidant capacity of green tea from
chromatographic fingerprints [J]. J Chromatogr A, 2008,
1192: 81−88.
[12] Yi LZ, He J, Liang YZ, et al. Plasma fatty acid metabolic
profiling and biomarkers of type 2 diabetes mellitus based on
GC/MS and PLS-LDA [J]. FEBS Lett, 2006, 580: 6837−
6845.
[13] Tomasi G, van den Berg F, Andersson C. Correlation optimized
warping and dynamic time warping as preprocessing methods
for chromatographic data [J]. J Chemom, 2004, 18: 231−241.
[14] Eilers PHC, Boelens HFM. Baseline correction with
asymmetric least squares smoothing [R]. Leiden University
Medical Centre report, 2005.
[15] Yang QX, Zhang L, Wang L, et al. MultiDA: chemometric
software for multivariate data analysis based on Matlab [J].
Chemom Intell Lab Syst, 2012, 116: 1−8.
[16] Chou TC. Theoretical basis, experimental design, and
computerized simulation of synergism and antagonism in
drug combination studies [J]. Pharmacol Rev, 2006, 58:
621−681.