全 文 ：《癌症》ChineseJournalofCancer,2008,27(9):910-913
·基础研究·
[ABSTRACT] BACKGROUND&OBJECTIVE:RaddeaninA,atriterpenoid
saponinfromAnemoneraddeanaRegel, hasgoodantitumoractivityinvitro.
Thisstudywastoinvestigateitsantitumorefectsontumorcelxenograftsin
mice.METHODS:TheinhibitoryefectsofraddeaninAontheproliferationof
humannasopharyngealcarcinomaKBcelsandovariancancerSKOV3cels
weremeasuredbyMTTassay.TheinhibitoryefectsofraddeaninAinjection
onthegrowthofsarcomaS180, livercancerH22andcervicalcarcinoma
U14celxenograftsinmiceandtheefectofraddeaninAlavageonthe
growth ofS180 celxenograftswere measured. The acute toxicityof
raddeanin A was also measured. RESULTS: The 50% inhibition
concentration (IC50) ofraddeaninAwas4.64!g/mLforKBcelsand1.40
!g/mLforSKOV3cels.WheninjectedwithraddeaninAatadoseof4.5mg/
kg, thegrowthinhibitionratesofS180, H22andU14celxenograftswere
60.5%,36.2% and61.8%,respectively.WhenlavagedwithraddeaninAat
adoseof200mg/kg, thegrowthinhibitionrateofS180celxenograftswas
64.7%.Themedianlethaldose(LD50)ofraddeaninAlavagewas1.1g/kg
and thatofraddeanin A injection was16.1 mg/kg. CONCLUSION:
RaddeaninAhasgoodantitumoractivitybothinvitroandinvivo,andwould
beapotentialantitumormedicine.
KEYWORDS: AnemoneraddeanaRegel; RaddeaninA; Antitumorefect;
S180cel;H22cel;U14cel;Mouse;Xenograft
【摘 要】 背景与目的:有研究证明,从两头尖中分离得到的三萜皂甙银莲花素
A在体外具有较好的抑瘤活性。本研究将观察银莲花素 A在体内对小鼠移植瘤
的抑制活性。方法:MTT法检测银莲花素 A对人鼻咽癌 KB细胞和人卵巢癌
SKOV3细胞的抑制率。体内实验选取小鼠肉瘤 S180细胞、小鼠肝癌 H22细胞和
小鼠宫颈癌 U14细胞,观察银莲花素 A注射给药对 S180、H22和 U14细胞小鼠
移植瘤的抑瘤率,以及灌胃给药对小鼠肉瘤 S180移植瘤的抑瘤率。测定银莲花
素 A的急性毒性。结果:银莲花素 A在体外对 KB细胞和 SKOV3细胞的 IC50分别
为 4.64!g/mL和 1.40!g/mL。4.5mg/kg银莲花素 A腹腔注射对 S180、H22和
U14细胞小鼠移植瘤的抑瘤率分别为 60.5%、36.2%和 61.8%。200mg/kg灌胃给
药时抑瘤率为 64.7%。灌胃给药和腹腔注射银莲花素 A的 LD50分别为 1.1g/kg
和 16.1mg/kg。结论:银莲花素 A在体内外均具有较好的抑瘤作用,体内可抑制
小鼠移植瘤的生长,是一个有潜力的抗癌药物。
关键词:两头尖;银莲花素 A;抑瘤活性;S180细胞;H22细胞;U14细胞;小
鼠;移植瘤
中图分类号:R73-36 文献标识码:A
文章编号:1000-467X(2008)09-0910-04
银莲花素A对S180、H22和U14细胞小鼠移植瘤
的抑制作用
王明奎, 丁立生, 吴凤锷
AntitumorEfectsofRaddeaninAonS180,H22andU14Cel
XenograftsinMice
WANGMing-Kui,DINGLi-Sheng,WUFeng-E
中国科学院成都生物研究所
天然产物研究中心,
四川 成都 610041
NaturalProductResearchCenter,
ChengduInstituteofBiology,
ChineseAcademyofSciences,
Chengdu,Sichuan,610041,
P.R.China
通讯作者:王明奎
Corespondenceto:WANGMing-Kui
Tel:86-28-85229073
Fax:86-28-85222753
E-mail:wangmk@cib.ac.cn
收稿日期:2007-12-17
修回日期:2008-04-30
910
两头尖又名竹节香附、多被银莲花,是毛茛科
莲花属植物红被银莲花 AnemoneraddeanaRegel
的根状茎,具有祛风利湿、消肿止痹的功效,用于
癌症及风湿性关节炎、痹症、腰腿疼痛的治疗[1]。对
两头尖成分的研究已经有大量的报道,其中主要
是三萜皂甙类成分,已经分离鉴定了多种三萜皂
甙[2-7]。我们的研究发现,其中的一种三萜皂甙银莲
花素 A在体外有细胞毒活性[8],任风芝等[9]后来也
报道了两头尖的抗肿瘤活性成分。由于活性成分
是三萜皂甙,分子量大,有一定的水溶性,虽然体
外可直接杀灭肿瘤细胞,但有可能因为其溶解性
和进入体内后被水解而没有活性。因此,为了评价
该化合物的应用前景,需要进行体内抗肿瘤活性
实验来确认其抗癌活性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要药品与试剂 注射用环磷酰胺由上海
第十二制药厂生产,其他试剂均为分析纯。两头尖
药材购自兰州市中药材批发站,由中国科学院成
都生物研究所肖顺昌研究员鉴定。
1.1.2 实验动物 ICR小鼠,体重 18～22g,雌雄
不拘,由四川抗菌素工业研究所实验动物室提供,
合格证号:川实动管质第 68号。同一批实验中的
小鼠性别相同,每组至少 10只。
1.1.3 细胞株 人鼻咽癌细胞株 KB由中国医学
科学院北京药物研究所引进。人卵巢癌细胞株
SKOV3由四川大学华西医学中心引进。
1.1.4 肿瘤瘤株 小鼠肉瘤 S180、小鼠肝癌 H22
和小鼠宫颈癌 U14由四川抗菌素工业研究所药理
室提供。
1.2 方法
1.2.1 银莲花素 A的制备 3kg两头尖粉碎后用
95%乙醇室温浸泡 3次,每次用乙醇 15L。回收乙
醇得到浸膏800g。将浸膏分散在 2500mL水中,
乙酸乙酯萃取3次,每次 1500mL。将下层水溶液
置于圆底烧瓶中,加入 75g固体 KOH,80℃加热
水解 2h。加入 5%的盐酸调节 pH至 7。然后用正
丁醇萃取 4次,每次 500mL,合并萃取液后减压回
收正丁醇,得到总皂甙 540g。取 180g总甙溶于
1000mL甲醇,加入 600g100～200目硅胶后,减
压回收甲醇,得到吸附了总甙的硅胶。另取 3kg同
样的硅胶,用氯仿∶甲醇(10∶1)湿法装柱。将吸附总
甙的硅胶加入装好的柱顶,用氯仿∶甲醇(10∶1)洗
去低级性的成分后,逐渐增加甲醇的比例,TLC检
测洗脱的组分,收集只含银莲花素 A的组分,合并
浓缩,甲醇结晶得到纯品 25g,相对于原料植物的
收率为 2.5%。
1.2.2 体外抑瘤实验 取 96孔板,各孔分别加入
190!L、密度为 5×104个/mL的 KB和 SKOV3细
胞,然后加入用 PBS稀释的不同浓度的药物溶液
10!L,每组设 4个复孔,同时设无细胞无药物的
培养液空白对照孔和有细胞无药物的阴性对照
孔。加药后,将 96孔板置于 37℃、5%CO2及饱和
湿度的培养箱中培养 96h,然后每孔加浓度为 10
mg/mL的 MTT10!L。在同样条件下继续培养 4
h。然后吸去上清液加 DMSO溶解,用 DG-3022A型
酶联免疫测定仪于 540nm波长处测各孔吸光度
值(A值),并按下式计算样品对细胞生长的抑制
率。细胞生长抑制率=(阴性对照孔平均 A值-实验
孔 A值)/阴性对照孔平均 A值×100%,并根据量
效关系和直线回归法计算半数抑制浓度(IC50)。
1.2.3 体内抑瘤实验 每批 ICR小鼠腋窝皮下
分别接种 1∶3的小鼠 S180、H22和 U14细胞悬
液,次日将小鼠随机分为 5组,每组 10只,其中
一组小鼠注射阳性对照药环磷酰胺 15mg/kg,
每天一次,连续 10d;三组小鼠分别腹腔注射或
灌胃不同浓度的银莲花素 A溶液,每天一次,连
续 10d;另一组小鼠作对照组,每天灌胃等体积
蒸馏水。于停药后次日处死各组小鼠,称体重,解
剖剥离瘤块并称重,计算抑瘤率,用 T检验比较
各治疗组和阴性组的差异。抑瘤率=(对照组平均
瘤重-实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×
100%。
1.2.4 小鼠急性毒性实验 实验小鼠按体重随机分
为5组,每组10只,雌雄各半,分别灌胃和腹腔注射
不同浓度的银莲花素A溶液,灌胃和腹腔注射剂量
均为20mL/kg。给药后立即观察小鼠反应情况,并
继续观察2周,记录小鼠毒性反应和死亡情况。小
鼠死亡后及时尸检,记录病变情况,按 Bliss法计算
半数致死浓度(LD50)及其95%可信区间。
2 结 果
2.1 银莲花素 A对 KB和 SKOV3细胞的抑制作
用
银莲花素 A对 KB和 SKOV3细胞均有一定的
抑制作用,其 IC50值分别为 4.64!g/mL和 1.40
!g/mL,再次确认了其体外抑瘤活性。
王明奎,等.银莲花素 A对 S180、H22和 U14细胞小鼠移植瘤的抑制作用 911
2.2 银莲花素 A对小鼠实体瘤生长的抑制作用
注射银莲花素 A对小鼠 S180、H22、U14移植
瘤和灌胃银莲花素 A对小鼠 S180移植瘤的作用
结果分别见表 1、表 2。
Control
Cyclophosphamide
RaddeanaA
15
0.5
1.5
4.5
Tumorweight
(g)
2.15±0.44
0.89±0.18a
1.59±0.15a
1.22±0.17a
0.85±0.15a
Inhibitionrate
(%)
-
58.6
26.1
43.3
60.5
Tumorweight
(g)
1.85±0.79
0.73±0.43a
1.28±0.52
1.21±0.55b
1.18±0.31b
Inhibitionrate
(%)
-
60.5
30.8
34.6
36.2
Tumorweight
(g)
2.83±0.70
0.70±0.29a
2.13±0.84
1.75±0.35a
1.08±0.49a
Inhibitionrate
(%)
-
76.9
24.7
38.2
61.8
S180celxenografts H22celxenografts U14celxenografts
Dose(mg/kg)Treatment
表 1 注射银莲花素 A对小鼠肉瘤 S180、肝癌 H22和宫颈癌 U14移植瘤的作用
Table1 TheefectsofraddeanaAinjectionongrowthofS180,H22andU14tumorcelxenograftsinmice
Alvaluesoftumorweightarepresentedasmean±SDof10miceinrelevantgroups.aP<0.01,bP<0.05,vs.controlgroup.
Control
Cyclophosphamide
RaddeanaA
15
50
100
200
Tumorweight(g)
3.12±0.89
1.22±0.48
1.94±0.86a
1.80±0.75a
1.10±0.56a
Inhibitionrate(%)
60.9
37.8
42.3
64.7
S180celxenograftsDose
(mg/kg)Treatment
表 2 银莲花素 A灌胃给药对小鼠肉瘤 S180的作用
Table2 TheefectofraddeanaAlavageongrowth
ofS180tumorcelxenograftsinmice
Alvaluesoftumorweightarepresentedasmean±SDof10micein
relevantgroups.aP<0.01,vs.controlgroup.
结果表明,连续注射银莲花素 A4.5mg/kg10
d,对小鼠肉瘤 S180的生长抑制率可达 60.5%;当
剂量为 1.5mg/kg时,抑瘤率还能达到 43.3%,均
有非常显著的抑制肿瘤生长的作用 (P<0.01),有
明显的量效关系。
连续注射银莲花素 A4.5mg/kg10d,对小
鼠肝癌 H22的生长抑制率可达 36.2%,有明显
的抑制肿瘤生长的作用 (P<0.05)。当剂量降至
1.5mg/kg时,抑瘤率达到 34.6%,有明显量效
关系。
连续腹腔注射银莲花素 A4.5mg/kg10d,
对小鼠 U14的生长抑制率可达到 61.8%,有显著
的抑制肿瘤生长的作用 (P<0.01);当剂量降为
1.5mg/kg时,抑瘤率为 38.2%,有明显量效关
系。
连续灌胃银莲花素 A200mg/kg10d,对小鼠
肉瘤 S180的生长抑制率可达 64.7%;当剂量降至
100mg/kg时,抑瘤率为 42.3%,有非常显著的抑
瘤作用(P<0.01)。当剂量降至 50mg/kg,抑瘤率达
到了 37.8%(P<0.01)。每批实验均有明显的量效
关系。
综上所述,银莲花素 A对实体瘤生长的抑制
作用均呈现明显的量效关系。
2.3 银莲花素 A对小鼠急性毒性实验
小鼠灌胃银莲花素 A后一周内死亡情况见表
3。用 Bliss法计算机程序计算 LD50为 1.08g/kg,
95%可信区间为 0.80～1.33g/kg。
小鼠灌胃 5min后自发活动减少,行动失调,
呼吸急促,30min后出现死亡。死亡小鼠尸检肉眼
观察未见各脏器有明显异常。急性毒性反应主要
表现为中枢神经系统和呼吸系统的毒性症状。
小鼠腹腔注射银莲花素 A后 2周内死亡情况
见表 4。用 Bliss计算机程序计算 LD50为 16.1mg/
kg,95%可信区间为 12.7～20.1mg/kg。
小鼠腹腔注射给药 2min后即出现收腹、扭体
反应,其它中毒症状与灌胃给药一致。
王明奎,等.银莲花素 A对 S180、H22和 U14细胞小鼠移植瘤的抑制作用
Dose
(g/kg)
3.00
2.10
1.47
1.03
0.72
Logarithmic
dose
0.477
0.322
0.167
0.013
-0.143
Deadmice
[number(%)]
10(100)
9(90)
7(70)
5(50)
2(20)
Probability
unit
7.12
6.38
5.64
4.90
4.17
表 3 小鼠灌胃银莲花素 A的急性毒性实验
Table3 TheacutetoxicityofraddeanaAlavageinmice
Eachgroupcontained10mice.
912
3 讨 论
注射银莲花素 A对小鼠 S180、H22、U14实体
瘤和灌胃银莲花素 A对小鼠 S180实体瘤都有较
高的抑瘤率,并且具有显著的抑制肿瘤生长的作
用,每批实验都有明显的量效关系,说明银莲花素
A在体内对实体瘤的生长具有明显的抑制作用。
在实验过程中,与作为阳性对照的环磷酰胺组比
较,小鼠死亡数要少一些。急性毒性实验也发现,
没有死亡的小鼠在停药后就没有继续死亡,说明
银莲花素A没有累积性毒性。由于皂甙有溶血性,
注射给药受到限制,口服仍有抗癌活性就显得尤
其重要。
齐墩果酸型皂甙在植物甚至食品中普遍存
在,但是具有抗癌活性的报道很少。我们也曾经
分离到很多齐墩果酸型皂甙,发现少数三萜皂甙
有一定抑瘤作用 [10],但不论体外还是体内的抑
瘤活性都不如银莲花素 A。它们的结构差异只是
3位上糖的种类和次序不同,但是却显示出很大
的活性差别。另外,由于银莲花素 A极性较大,
难以通过胃肠道吸收。尽管如此,灌胃给药仍然
表现出较好的活性。因此,银莲花素 A的在体内
的作用方式及作用机理,值得深入探讨。
银莲花素 A注射给药的治疗指数为 3.6,口服
治疗指数可达到 5.4,与很多抗癌药物仅为 1的治
疗指数相比显得毒性很小,有其独特的优点,是一
种很有潜力的抗癌药物。皂甙类化合物的抗癌活
性近二十年来研究得比较多,由于其毒性小,越来
越受到人们的重视。
[参 考 文 献]
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[编辑及校对:张 菊]
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[6]
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[9]
[10]
Dose
(mg/kg)
36.0
25.2
17.6
12.6
8.6
Logarithmic
dose
1.556
1.401
1.246
1.100
0.934
Deadmice
[number(%)]
10(100)
8(80)
5(50)
2(20)
2(20)
Probability
unit
6.61
5.89
5.18
4.46
3.75
表 4 小鼠腹腔注射银莲花素 A的急性毒性实验
Table4 TheacutetoxicityofraddeanaAinjection
inmice
Eachgroupcontained10mice.
王明奎,等.银莲花素 A对 S180、H22和 U14细胞小鼠移植瘤的抑制作用 913