全 文 ：瑞香狼毒杀虫活性成分的提取与分离
王亚维1)　张国洲1 ,2)　徐汉虹2)　赵善欢 2)　(1)湖北农学院植物保护系 ,湖北荆州 430025;2)华南农业大学资源环境学院)
摘要　以菜粉蝶(Pieris rapae L.)5龄幼虫为试虫 , 进行生物活性跟踪;采用浸提、萃取 、层析等多种方法 , 从瑞香狼毒(Stellera
chamaejasme L.)根中分离出 3种活性成分单体 ,并通过物质结构的四大谱(IR , UV , NMR ,MS)鉴定 ,它们分别为伞形花内酯、瑞香亭
和狼毒色原酮。
关键词　瑞香狼毒;菜粉蝶;伞形花内酯;瑞香亭;狼毒色原酮
中图分类号　S 482.39　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2004)04-0671-02
Separation and Identification of Extraction of Stellera Chamaejasme
Wang Yawei et al　(Department of Plant Protection ,Hubei Agricultural College , Jingzhou ,Hubei 434025)
Abstract　Stellera chamaejasme from the root was separated with a lot of methods , such as dip , extraction , and chromatography ,which bioassay ag-
nist the fifth instar larvae of Pieris rapae , 3 kinds of active ingredients were isolated.Themolecular structure of the compounds were definitely i-
dentified to be 7-hydro-coumarin , daphnoritin , and chamaechromone respectively by the spectrum analysis including IR , UV , NMR , and MS.
Key words　Stellera chamaejasme , Pieris rapae ,7-hydro-coumarin , Daphnoritin , Chamaechromone
　　瑞香狼毒广泛分布于我国高山和亚高山草地 ,是青
藏高原上重要的杀虫植物。它的根乙醇提取物(简称
SCEE)对菜粉蝶幼虫有很强的生物活性。如能将之开发
为一种新型的植物性杀虫剂 ,对充分利用该植物资源具
有重要意义 。为此 ,笔者对其中的活性成分进行了提取、
分离 、纯化以及结构鉴定。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　供试物质。瑞香狼毒采自青藏高原的青海省西宁
市郊区(海拔 3 000 ～ 4 000 m)。将采集的植物洗净 、阴干 ,
然后将其根 、根木质部 、韧皮部、茎、叶分别放入恒温箱中
烘干(40 ～ 45 ℃)至材料发脆 ,再分别磨碎过 150μm筛 ,装
入塑料袋密封贮于冰箱中备用。95%印楝素由华南农业
大学昆虫毒理室提供 。
1.1.2　供试昆虫。菜粉蝶(Pieris rapae L.)在养虫室内用
甘蓝(Brassica oleracea L.)叶饲养 ,温度(25±1)℃,相对湿
度(85±10)%,光照 12 h/d。
1.1.3　供试仪器。LI -1000 叶面积测定仪(美国 Lincoin
公司制造);RFX-65A型红外光谱仪(美国 Analect公司制
造);DU-600 型紫外扫描仪(美国杜邦公司制造);DRX-
400型核磁共振仪(德国 Bruker公司制造);ZAB-HS 型质
谱仪(英国VG公司制造)。
1.2　方法
1.2.1　提取方法。将一定量的植物干粉2kg装入大型广
口瓶中 ,加入 5倍量的乙醇 10 L ,浸提 3 ～ 5 d ,过滤 ,滤液
注:国家自然科学基金资助课题(39300087)。
作者简介:王亚维(1968-),女 ,陕西省礼泉县人 ,副教授 ,从事植物保
护教学和研究工作。
收稿日期:2004-02-11
减压浓缩后 ,再加入 5倍量的乙醇浸提 3 ～ 5 d ,过滤 ,滤
液减压浓缩 ,如此3次 ,合并3 次的提取浓缩物 ,即得到瑞
香狼毒根乙醇提取物(简称 SCEE)。
称取 SCEE 20 g ,加 10倍量蒸馏水 200 ml ,热溶 ,装入
分液漏斗中 ,采用液 —液分配 ,依次用石油醚 、氯仿、乙酸
乙酯 、正丁醇各萃取 3～ 5次(100ml/次),最后分别将这些
萃取液和水萃取液减压浓缩至稠膏 ,重复 3 次 ,并计算出
萃取率 。具体过程见图 1。
图 1　SCEE液—液分配法分离程序
1.2.2　层析法分离 。取氯仿提取物 4.0 g ,用少量氯仿溶
解 ,与 20 g硅胶混匀 ,室温下挥发除尽溶剂 ,加于硅胶柱
(500 g)上 ,用石油醚—氯仿(体积比为 1∶1)、氯仿 、氯仿—
甲醇[体积比为(49～ 9)∶1] 梯度洗脱 ,得到 24个流分 。第
1 、2流分为石油醚 —氯仿(体积比为 1∶1)洗脱物 ,第 3 ～ 7
流分为氯仿洗脱物 ,第 8 ～ 10流分为氯仿—甲醇(体积比
为49∶1)洗脱物 ,第 11 ～ 15流分为氯仿—甲醇(体积比 95
∶5)洗脱物 ,第16 ～ 24流分为氯仿 —甲醇(体积比为 9∶1)
洗脱物。根据薄板层析结果 ,将它们合并成 14 个流分。
将流分-3 、流分-5、流分-11分别上小柱 ,干装柱 ,上湿
安徽农业科学 , 2004 , 32(4):671-672
Journal of Anhui Agricultural Sciences
DOI :10.13989/j.cnki .0517-6611.2004.04.034
样 ,用氯仿洗脱 ,洗脱溶液为 2滴/s ,每号收集流分 50 ～
100 ml ,经薄层层析检验后合并 ,确定活性高的流分 ,浓缩
后即可得高纯度的单体化合物 。
1.2.3　生物活性测定方法。参照吴文君[ 1]的方法 ,将新
鲜芥兰叶片用圆形打孔器( =2 cm)打成叶碟 ,放入供试
样品的丙酮稀释液(氯仿萃取物的质量浓度为 500μg/ml;
氯仿萃取物各流分的质量浓度为 300 μg/ml;伞形花内酯
等 3种活性成分的质量浓度为 500μg/ml;印楝素的质量
浓度为 80μg/ml)中浸 3 s ,让丙酮挥发干 。然后放入培养
皿中( =9 cm ,内垫滤纸 ,加蒸馏水保湿)。拒食作用试验
时摆入数片处理叶碟 ,另设对照 。每皿放入饥饿了 4 h的
5龄幼虫 1头 ,以 10头为 1组 ,重复 3 次 , 24 、48 h后选出
10头 ,用叶面积测定仪测定剩余叶面积 ,据此计算幼虫取
食叶面积和拒食率。2 d后换新鲜叶片继续饲养 , 7 d后调
查结果 。
R(%)=A1 -A2
A1
×100
其中 ,R 为非选择性拒食率 , A1为对照组取食叶面积 , A2
为处理组取食叶面积 。
1.2.4　物质结构鉴定方法。红外光谱(IR)法 ,将样品与
KBr混合压片 ,精度为±2.000 0/cm;紫外光谱(UV)法 ,所
测样品均用氯仿溶解 ,扫描波长为 200 ～ 400 nm;核磁共振
谱(NMR)法 ,以四甲基硅烷(TMS)为内标准;质谱(MS)法 ,
采用快原子(FAB-MS)轰击法 。
2　结果与分析
2.1　提取物对菜粉蝶的生物活性　由表 1可见 ,氯仿萃
取物的生物活性最强 , 石油醚萃取物次之 ,正丁醇萃取物
和水萃取物对幼虫几乎无活性 。
　　表1　　SCEE几种溶剂萃取物对 5龄菜粉蝶幼虫的生物活性
处理 拒食率∥%
24 h 48h
7 d后校正
死亡率∥%
石油醚萃取物 　89.53a 　85.02a 　　　　58.62 b
氯仿萃取物 93.58a 91.63a 82.76 a乙酸乙酯萃取物 22.97 c 27.81c 31.03 c
正丁醇萃取物 -12.84e 7.64d 3.46 d
水萃取物 8.45d 14.85cd 0.00 d
印楝素 56.59b 77.93b 96.59 a
　注:表中同列数据后字母相同者表示经 DMRT 法检测差异不显著
(5%水平),下同。
2.2　SCEE氯仿萃取物各流分对菜粉蝶的生物活性　由
表 2可见 ,流分 7、8的活性最强 ,流分 1 、3 、4、5 、11次之 。
2.3　结构鉴定结果　因流分-1、流分-4 、流分-7 、流分
-8的样品量少 ,无法进一步分离。由流分-3中分离出
伞形花内酯(7-hydro-coumarin),从流分-5中分离出瑞
香亭(daphnoritin),从流分 -11 中分离出狼毒色原酮
(chamaechromone)。
2.4　伞形花内酯等化合物对菜粉蝶的生物活性　由表 3
可见 , 3种化合物对菜粉蝶幼虫均有较强的生物活性 。这
说明分离出来的 3种化合物是笔者跟踪的活性成分 。
　　表 2　　SCEE氯仿萃取物各流分对菜粉蝶 5龄幼虫的生物活性
流分号 取食面积∥cm2/头
24 h 48 h
拒食率∥%
24h 48h
7d后校正畸
死率∥%
　　1 　2.09 g 　4.44 g 　78.50 　73.03 　　　85.71 ab
3 0.27 j 1.57 j 97.32 90.46 96.43 ab
4 1.60 h 2.53 i 83.54 84.63 89.29 ab
5 0.51 i 0.92 j 94.75 94.41 92.85 ab
6 2.34 f 5.29 f 75.92 67.86 60.71 c
7 0.33 i j 0.96 j 96.60 94.10 100.00 a
8 0.36 i j 1.16 j 96.30 92.95 100.00 a
9 4.63 c 9.49 b 52.37 42.35 50.00 cd
10 3.17 e 5.27 f 67.39 67.98 46.43 cd
11 1.61 h 3.26 h 83.44 80.19 82.14 b
12 3.56 d 7.13 d 63.37 56.68 57.14 cd
13 3.07 e 5.74 e f 68.42 56.13 57.14 cd
14 4.66 c 6.14 e 52.06 62.70 42.86 cd
16 5.44 b 8.83 c 44.03 46.36 50.00 cd
　 CK 9.72 a 16.46 a 0 0 0
　　表 3　　伞形花内酯等化合物对 5龄菜粉蝶幼虫的生物活性
化合物 取食面积∥cm2/头
24 h 48 h
拒食率∥%
24h 48h
7d后校正
死亡率∥%
伞形花内酯 1.00 e 　2.56 d 　83.79 　82.02 　　79.31 ab
瑞香亭 1.22 e 2.58 d 80.45 81.88 75.87 ab
狼毒色原酮 1.87 c 3.80 c 70.03 73.32 65.52 b印楝素 1.56 d 1.82 e 75.00 87.22 89.66 a
CK 6.24 a 14.24 a 0 0 0
3　讨论
(1)植物中的化学成分有数十种乃至数百种 ,但其中
杀虫活性成分可能只有 1 种或几种。为了从中获得有效
成分 ,液—液分配萃取法是一种重要的方法 ,特别适合样
品分离的“预处理” ,它在天然物分离工作中已被广泛采
用 ,如Morgan等[ 2]从沙漠蝗(Schistocerca gregaria)中提取
分离蜕皮激素 ,Galbraith等[ 3] 从植物中提取蜕皮激素等。
(2)由于 SCEE中含有丰富的蛋白质 、脂肪酸 、皂素、
多糖等表面活性物质 ,在对其用石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯
分配萃取操作中遇到了两相溶剂的乳化问题 ,即萃取液
分为 3层 ,其中 1 层为乳化层。为提高其准确性 ,引入了
“非石油醚萃取液” 、“非氯仿萃取液”与“非乙酸乙酯萃取
液”概念 。
(3)从瑞香狼毒中分离出来的 3种化合物纯度越高 ,
生物活性越低 。这充分说明这些活性物质之间的关系是
十分复杂的 ,仅靠其中一种有效成分的含量 ,往往并不能
准确地反映出其粗提物的活性大小。目前所分离的化合
物 ,多是容易分离且含量较为丰富的化合物 ,还要对那些
含量较少、常规方法难以分离的化合物作进一步分离 。
4　参考文献
1　吴文君.化学保护实验技术导论[M] .西安:陕西科技出版社, 1988.
2　Morgan E D.Studies on the morlting hormones of the desert locust[ J] .Insect
Physiol , 1975 , 21:979.
3　Galbraith M N , Horn D H S.Insect moulting hormone Crust ecdysone from
Podocarpus elatus[ J] .Chem , 22:1045.
(责任编辑:金琼琼　责任校对:金琼琼)
672 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2004年