全 文 ：农杆菌介导的中华补血草遗传转化体系的建立
李维焕 ,张霞 ,张慧 ,赵彦修　(山东师范大学生命科学学院 ,山东济南 250014)
摘要　[目的]为利用转基因技术培育中华补血草新品种奠定基础。[方法]对农杆菌介导的中华补血草转化体系中的各种影响因素进
行了系统研究 ,以构建中华补血草的遗传转化体系。[结果]中华补血草叶片对卡那霉素敏感 ,以 50 mg/L卡那霉素作为补血草叶片转化
受体较为适宜。400mg/L特美汀能有效抑制农杆菌 ,而 500 mg/L头孢曲松钠则不能。菌株EHA105对中华补血草的转化率达 15%,远高
于菌株 LBA4404和GV3101。对于侵染中华补血草无菌苗叶片的重悬菌液 ,以 OD 600为 0.7～ 1.0为宜。4 d共培养的效果较好 , 15.6%外
植体可分化成芽。PCR检测结果表明 30株卡那霉素抗性植株均为阳性 ,而阴性对照未扩增到条带 ,表明NPTⅡ外源基因已整合到受体植
物基因组中。[结论]影响中华补血草转化率的关键因素是农杆菌菌株的选择。
关键词　中华补血草;农杆菌;遗传转化;影响因子;PCR
中图分类号　S 567.23+9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)07-02668-02
Establishment of the Genetic Transformation System of Limonium sinense Mediated by Agrobacterium tumefaciens
LI Wei-huan et al　(College of Life Science , Shandong Normal University , Jinan , Shandong 250014)
Abstract　[ Objective] The research aimed to lay the foundation for breeding new varieties of Limonium sinense by using transgenic technologies.
[Method] The influencing factors in the transformation system of L.sinense mediated by Agrobacterium tumefaciens were systemically studied to construct
the genetic transformation system of L.sinense.[ Result] The leaves of L.sinense were sensitive to kanamycin and it was suitable to take 50 mg/L
kanamycin as the transformation acceptor of L.sinense leaves.400 mg/L timentin could inhibit A.tumefaciens effectively , but not 500 mg/L ceftriaxone
sodium.The transformation rate of Strain EHA105 to L.sinense reached 15%, greatly higher than that of Strain LBA4404 and Strain GV3101.For the
suspended bacteria liquid that infected the leaves of L.sinense aseptic seedlings , its suitable OD600 was 0.7～ 1.0.The effect of co-culture for 4 d was
better and 15.6% explants could be differentiated into buds.The results of PCR detection showed that 30 plants with the resistance to kanamycin were all
positive and no band was amplified in negative control , which indicated that NPTⅡ exogenous gene had been integrated into the genome of acceptor plant
L.sinense.[ Conclusion] The key factor that affected the transformation rate of L.sinense was the strain selection of A.tumefaciens.
Key words　 Limonium sinense;Agrobacterium tumefaciens;Genetic transformation;Affecting factors;PCR
基金项目　国家重点基础研究发展“ 973”计划(2006CB100100)。
作者简介　李维焕(1979-),女 ,山东青岛人 ,博士研究生, 研究方向:
植物耐逆分子生物学。
收稿日期　2007-10-05
　　中华补血草(Limonium sinense Kuntze)为白花丹科补血草
属多年生泌盐草本植物[ 1] 。它具有特殊的泌盐结构———盐
腺 ,可将体内盐离子排出体外 ,从而避免盐分胁迫的伤害。
中华补血草可使盐土脱盐 ,改善土壤结构 ,被誉为盐碱地改
造的“先锋植物” 。通过对补血草盐腺泌盐过程和泌盐机理
的研究 ,人们对盐腺的形态构造及其泌盐过程和规律已有初
步了解[ 2] 。但还不清楚中华补血草具有较高抗盐能力的关
键因子。要确定某一推测目的基因对中华补血草抗盐能力
的作用 ,基因敲除或 RNAi技术无疑是强有力的工具。这就
需要建立中华补血草的遗传转化体系 。笔者在已建立的中
华补血草再生体系的基础上[ 3] ,对影响农杆菌转化补血草的
各种因素进行了系统研究 ,旨在构建良好的遗传转化体系 ,
为研究补血草泌盐机制和利用转基因技术培育和改良补血
草品种奠定基础。
1　材料与方法
1.1　试验材料　农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105、
LBA4404和GV3101菌株(由山东师范大学生命科学学院实验
室保存),均含有空 pROKⅡ质粒[ 4] ,质粒筛选标记基因为卡那
霉素抗性基因 NPTⅡ。中华补血草(Limonium sinense Kuntze)
种子采自山东东营 ,组织培养条件为 20 ～ 25 ℃,每日光照 12
h ,光强 2000～ 3 000 lx。卡那霉素(Kanamycin , Km)为Amresco
公司产品;注射用头孢曲松钠(Ceftriaxone Sodium for Injection)
为山东鲁抗医药股份有限公司产品;特美汀(Timentin)为美国
史克必成公司产品。
1.2　培养基　YEB培养基 ,用于农杆菌培养。补血草培养
基包括芽诱导与增殖培养基 BI(MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA
0.1 mg/L)和生根培养基 I(MS+IBA 0.1 mg/L)[ 3] 。
1.3　转化与再生　将鉴定后的农杆菌单菌落接种于 50 ml液
体YEB培养基(含 34mg/L利福平、50mg/L卡那霉素和 4mg/L
乙酰丁香酮)中培养至 OD600 =1.0～ 1.5。离心菌液 ,用含 40
mg/L乙酰丁香酮的液体MS0重悬菌液至OD600=0.7～ 1.0。取
株高 11 cm的无菌苗叶片 ,面积为 1 cm×1 cm ,置于BI 培养基
中预培养 2 d。将预培养好的叶片浸入重悬菌液中摇动 20 min
后 ,取出叶片用无菌滤纸吸干多余菌液 ,把叶片接种于 BI培养
基上 ,于暗处共培养 4 d。第 5天 ,将叶片转接到含 50 mg/L卡
那霉素和 400 mg/L特美汀的BI筛选培养基上进行转化体的筛
选培养。每 15 d转接 1次 ,随着继代次数的增加 ,可适当减少
特美汀的用量。转接 4次后统计转化率。
转化率=(分化芽的外植体数/总外植体数)×100%(1)
转接至抗性芽长1 cm时 ,切取抗性芽转接到含 25mg/L卡
那霉素和 80mg/L特美汀的 I 培养基上诱导生根。数周后 ,将
植株移栽至温室中。
1.4　转基因植株 PCR检测　随机选取 30株卡那霉素抗性
植株 ,用 CTAB 法提取其叶片总 DNA[ 5] 。参照文献[ 5]进行
PCR扩增 ,获得的扩增片断长度为 795 bp 。
2　结果与分析
2.1　补血草叶片对卡那霉素筛选剂的敏感性　由表 1可以
看出 ,补血草叶片对卡那霉素是敏感的。当Km的浓度为 25
mg/L时 ,愈伤分化情况较好 ,但芽的分化率为 0;当Km的浓度
为 50 mg/L时 ,芽的分化率仍为 0 ,且只有少部分叶片产生愈
伤;而当Km 的浓度升至 75、100 mg/L时 ,叶片外植体出现褐
化 、坏死现象 ,已不能产生愈伤 ,更不能分化出芽。由此可见 ,
50mg/L是卡那霉素筛选补血草叶片转化受体的适宜浓度。
2.2　头孢曲松钠和特美汀的抑菌效果　研究发现 ,头孢曲
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008, 36(7):2668-2669　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　陈玉敏　责任校对　马君叶
表 1　补血草对卡那霉素筛选剂的敏感性
Table 1　The sensitivity of L.sinense to Km
卡那霉素质量浓度
Km concentration
mg/L
愈伤分化率
Rate of callus
differentiation∥%
芽分化率
Rate of bud
differentiation∥%
　　　　0 　　　100.0±0.0 　　　100.0±0.0
25 37.5±3.1 0.0±0.0
50 8.3±1.0 0.0±0.0
75、100 0.0±0.0 0.0±0.0
　注:数据为M±SE , n=3。下同。
　Note:Data were presented by M±SE, n=3.The same as below.
松钠和特美汀对农杆菌的抑菌效果不同 。500 mg/L头孢曲
松钠不能有效抑制农杆菌 ,污染率较高 ,再提高头孢曲松钠
的浓度又严重抑制补血草叶片的分化。然而 ,400 mg/L特美
汀就能有效抑制农杆菌 , 3～ 4周转接 1次即可 ,且不影响外
植体的分化 ,提高了转化率。
2.3　不同农杆菌菌株对转化率的影响　由表 2可以看出 ,
接种 EHA105菌株时 ,补血草的转化率远高于接种 LBA4404
和GV3101菌株 ,达 15%,而后两者的转化率分别为 2.7%和
4.4%。
2.4　重悬菌液浓度对转化率的影响　由表 2可以看出 ,对
于株高 11 cm左右的补血草无菌苗叶片 ,侵染时重悬菌液浓
度以 OD600=0.7～ 1.0为宜 ,转化率可达 15%。菌液浓度太
高 ,对叶片损伤较大 ,筛选培养时外植体褐化死亡率增加 ,农
杆菌也难抑制 ,导致转化率下降 。
2.5　共培养天数对转化率的影响　由表 2可以看出 ,3或 4
d共培养对补血草转化率的影响没有太大差异 ,以 4 d共培
养的效果较好 ,有 15.6%的外植体可分化出芽。共培养 5 d
2.6　转基因植株的 PCR检测　为进一步鉴定转基因植株
表2　菌株、菌液浓度及共培养天数对转化率的影响
Table 2　Effects strains , A.lumefaciens concentration and co-culture time on transformation rate
农杆菌菌株
Strains of A.lumefaciens
转化率
Transformation rate∥%
重悬菌液浓度
Resuspend cells concentration∥OD600
转化率
Transformation rate∥%
共培养天数
Co-culture time∥d
转化率
Transformation rate∥%
EHA105 15.0±1.0 a 0.4～ 0.6 11.7±1.7 3 13.3±1.7
LB4404 2.7±0.7 b 0.7～ 1.0 15.0±1.9 4 15.6±1.5
GV3101 4.4±0.6 b 1.1～ 1.5 5.0±1.0 5 9.4±1.1
　注:a、b表示平均值间存在 0.01水平上的显著差异(P<0.01)。
　Note:a , b indicate significantly different at 0.01 probability level.
时农杆菌难抑制 ,污染率高 ,致使转化率降低。
的可靠性 ,分别提取 30株卡那霉素抗性植株的叶片总DNA ,
以 pROKⅡ质粒DNA为阳性对照 ,以转基因植株和无菌双蒸水
为阴性对照 ,对 NPTⅡ基因进行PCR检测 。结果发现 ,30株卡
那霉素抗性植株均呈 PCR阳性反应 ,而阴性对照没有扩增到
条带 ,初步表明 NPTⅡ外源基因已整合到受体植物基因组中
(图 1)。
注:1为 DL2000Marker , 2为阳性对照, 3为水对照, 4为非转基因植
株对照, 5～ 8为转基因植株。
Note:1.DL2000 Marker;2.Positive control;3.Water ;4.Non-trans-
genic plants;5～ 8.Transgenic plants.
图 1　部分转基因植株的 PCR检测
Fig.1　PCR identification on some putative transgenic plants
3　讨论
(1)NPTⅡ基因是植物研究中最常用的筛选标记基因 ,其
对中华补血草也有效。研究发现 ,50 mg/L的卡那霉素浓度
作为补血草叶片转化受体的筛选浓度比较适宜。PCR检测
发现 30株那霉素抗性植株均为阳性。
(2)对不同植物材料的转化 ,不同抗生素的抑菌效果不
同。对百脉根子叶受体而言 ,头孢霉素比羧苄霉素更为有
效[ 6] ;而羧苄青霉素比头孢霉素更适合用于农杆菌介导的马
铃薯叶圆片的遗传转化[ 7] 。该研究发现 ,对补血草叶片而
言 ,特美汀比头孢曲松钠能更有效地抑制农杆菌 。
(3)影响补血草转化率的关键因素是农杆菌菌株的选
择。采用 EHA105菌株转化补血草 ,转化率可达 15%,远高于
LBA4404和GV3101菌株 ,表明补血草对EHA105菌株更敏感。
(4)共培养天数和菌液浓度对转化率也有一定的影
响[ 8] 。对补血草而言 ,共培养 4 d可使农杆菌和补血草叶片充
分地相互作用 ,使卡那霉素抗性基因 NPTⅡ在基因组中整合
并表达;菌液浓度以 OD600=0.7～ 1.0为宜。共培养时间过
长 ,菌液浓度过高 ,都会使农杆菌生长过于旺盛 ,筛选培养时
农杆菌难以抑制 ,外植体死亡 ,导致转化率下降。
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266936卷 7期　　　　　　　　　　　　　李维焕等　农杆菌介导的中华补血草遗传转化体系的建立