全 文 ：Vol. 33 No. 3
Mar. 2013
第 33卷 第 3期
2013年 3月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
收稿日期：2012-10-16
基金项目：“十二五”农村领域国家科技计划课题 (2011BAD38B0204)；国家林业局推广项目 (2012-64)；湖南省自然基金项目
(10JJ3003)；湖南省林业厅项目；湖南省普通高校青年骨干教师培养对象
作者简介：郁培义（1984-），男，山西太原人，硕士研究生，主要从事城市生态学研究工作
通讯作者：朱 凡（1973-），女，湖南武汉人，副教授，博士，主要从事森林生态方面的研究；E-ma il：forestranger33@hotmail.com
土壤微生物作为森林土壤重要组成部分，在
凋落物分解、养分循环和植物养分利用过程中发
挥着关键作用 [1]。土壤微生物对环境变化反应敏感，
是土壤环境质量的重要指标 [2]。土壤微生物群落
功能多样性是土壤微生物群落状态与功能的指标，
反映土壤中微生物的生态特征。1991年 Garland
等首次将 BIOLOG微平板技术应用于描述混合的
微生物群体特征 [3]。近十几年来，BIOLOG技术
在微生物生态及环境微生物检测方面的应用取得
了长足进步。BIOLOG主要是通过测定微生物对
各类碳源利用程度的差异来反映土壤中微生物群
氮添加对樟树林红壤微生物群落代谢功能的影响
郁培义 1,2，朱 凡 1,2，王志勇 1,2，闫文德 1,2，宿少锋 1,2，李天平 1,2
(1. 中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004；
2. 南方林业应用技术国家工程实验室，湖南 长沙 41 0004)
摘 要：为探讨氮添加对土壤微生物群落代谢功能多样性的影响，采用 BIOLOG AN、FF、GenIII 和 YT 4种微生
物平板测定 了氮添加不同水平樟树林红壤微生物的代谢活性及其多样性。结果表明 :(1)高浓度施氮对樟树人 工
林土壤微生物厌氧菌的代谢功能具有促进作用，而低浓度施 氮抑制其活性。(2)氮添加不同水平 处理均促进土壤
微生物革兰氏好氧菌的活性，且施氮浓度越 高促进作用越明显。(3)氮添加不同水平处理均抑制土壤微生物真菌
和酵母菌活性。多样性的研究结果也与土壤微生物代谢活性的变化相似。
关键词：氮添加；BIOLOG；微生物群落 ; 代谢功能；多样性
中图分类号：S792.23 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2013)03-0070-05
Effects of nitrogen addition on metabolic function of microbial community
in red soil of Cinnamomum camphora forest
YU Pei-yi1,2, ZHU Fan1,2, WANG Zhi-yong1,2, YAN Wen-de1,2, SU Shao-feng1,2, LI Tian-ping1,2
(1.School of Life Science and Technology, Central-South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China;
2. National Engineering Lab. For Applied Technology of Forestry & Ecology in South China, Changsha 410004, Hunan, China)
Abstract: In order to study the effects of nitrogen addition on soil microbial metabolic characteristics，the metabolic activity and the
diversity of soil microbial community were determined by four kinds of plates(BIOLOG AN, FF, GenIII and YT plates)with different
nitrogen treatments on Cinnamomum camphora forest in Hunan Botanical Garden. The results show that (1) a high concentration of
nitrogen promoted metabolic function of soil microbial anaero bic bacteria, and low nitrogen concentration inhibited its activity; (2) For
the soil microbial gram aerobic bacteria，the metabolic function were enhanced signifi cantly under different nitrogen additions; (3) In
addition, the metabolic activity of soil microbial fungi and yeast were avoided by different nitrogen additions. The research results of soil
microbial diversity were similar to the trend of soil microbial metabolic activity.
Key words: nitrogen addition；BIOLOG；microbial community; metabolic function; diversity
落代谢功能的不同，此方法已广泛应用于评价土
壤微生物群落的功能多样性 [4]。
氮素被认为是陆地生态系统初级生产力的限
制性养分元素，因此人类大量使用氮肥来增加土
壤可利用性氮素的水平，促进植物的生长。但是
研究表明，外加氮输入会增加土壤溶液的氮淋溶，
导致土壤的进一步酸化 [5]。那么土壤微生物为了
适应该环境，必需对自身特性和适应机能进行修
饰和改造，使其组织机能和群落结构具有一定的
特异性。
中国南方林地许多分布在对酸敏感的红壤
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地区 [6]。外源氮的添加对林地土壤质量影响关
系到林业可持续发展，已引起广泛关注。樟树
Cinnamomum camphora是我国南方地区重要的材
用及造林经济树种。为此，文章采用BIOLOG 技术，
利用 AN、FF、GEN和 YT 4种微孔板分别对外源
氮添加不同水平下樟树人工林红壤微生物代谢功
能多样性进行研究，以期为深入研究外源氮输入
对土壤微生物群落代谢功能的影响，以及为我国
林业的可持续发展及环境保护提供参考。
1 材料与方法
1.1 研究区概况
试验地位于湖南省森林植物园（113°02′E，
28°06′N）。该地气候属于典型的亚热带湿润季风
气候，年均气温约为 17.2℃，年均降水量约为
1 422 mm，全年无霜期为 270～ 310 d。试验地海
拔 50～ 100 m，坡度 12°～ 21°；地层主要是第四
纪更新世的残积性网纹红土和砂砾，属典型红壤
丘陵区。樟树林是亚热带常见的人工林，在中性
以至强酸性红壤丘陵地是很好的经济林树种，大
约种植于 1982年，其基本特征见表 1。
表1 供试土壤的理化特性
Table 1 Physicochemical properties of experimental soils
in C. camphora forest (n = 3)
森林
类型
林龄
/a
土壤全 C
/(g·kg-1)
土壤全 N
/(g·kg-1)
土壤
C/N pH值
樟树 30 16.80±1.05 1.41±0.08 11.99 3.87±0.23
1.2　实验设计
植物园模拟氮沉降处理样地建于 2010年 5月，
在樟树林设置了面积 25 m×25 m样方 9个。分
别设置 3个处理组，即对照处理 N0、低氮处理 N1
和高氮处理 N2，分别按： 0、5、15 g·m-2 y-1进行
外加氮处理，每个处理组 3个重复。根据样地坡
度，将高氮处理样地设置于坡度较低处，防止因
施氮后短期内雨水冲刷将未溶解于土壤表层和灌
木表层的氮冲刷。2010年 6月，对样地进行氮处
理。方法是根据氮处理水平，将每个样方所施的
NH4NO3(固体分析纯 )溶解在 20 L自来水中后，
以背式喷雾器人工来回均匀喷洒，喷洒高度 1.5 m
左右。对照样方 N0则喷洒等量清水，以尽量减少
不同处理间的差异。
1.3 土壤样品采集
于喷施氮 1个月 (2010年 7月 )对各样方进行
取样，依照均匀并随机的原则，去除凋落物层 , 使
用直径 5 cm“洛阳铲”采 0～ 10 cm的土层，按照
“品”字形三点取样，将每个样方的土样充分混合后，
手捡粗根、石块和其它杂物后，迅速装入塑料袋并
置于冰块上，运至实验室，4℃冰箱保存。
1.4 测定方法
试验使用的 BIOLOG AN、FF、GenIII和 YT
4种测试板各有 96个孔，除对照组孔（第一个孔）
仅有水和指示剂以外，其余孔均含有不同碳源和
四唑盐指示剂。微生物在利用单一碳源的代谢过
程发生氧化还原反应，产生电子转移，从而使四
唑盐指示剂变成紫色，通过测定各板孔的吸光值
及其变化来反映微生物的代谢能力的多样性 [7]。
BIOLOG GenIII板适用于测定革兰氏好氧
细菌，BIOLOG FF 板适用于测定丝状真菌，
BIOLOG YT板适用于测定酵母菌，BIOLOG AN
板适用于测定厌氧细菌。
具体实验步骤是，实验前应先将待测土壤从
冰箱内提前 4小时拿出，放置于室温下恢复土壤
微生物的活性。称取 10 g土样倒入装有 90 mL灭
菌生理盐水的三角瓶中，200 r/min振荡 30 min，
使土壤中微生物均匀分散，制成 10-2稀释度的土
壤稀释液。然后按 10倍稀释法进行稀释，取 10-3
倍数的上清菌液用 8道移液排枪接入 BIOLOG 4
种微平板 (150 μL/孔 )。放入 28 ℃恒温培养箱培养，
每隔 24 h进行读数，连续 10 d。
土壤微生物多样性指数计算方法 [8-9]如下：
BIOLOG 微平板反应一般采用每孔颜色平均
变化率 (AWCD)来描述。
计算公式为：
AWCD=Σ(C-R)/n。
式中：C 为每个有培养基孔的光密度值，R 为对照
孔 ( A1) 的光密度值，n 为培养基碳源种类，YT板
n值为 31，其余微平板 (AN板、GenIII板和 FF板
)n值为 95。
采用 Shannon指数、Simpson指数和Mclntosh
指数来反映细菌群落代谢功能的多样性。
Shannon指数计算公式 :
H=-Σ(Pi×lnPi)。
式中：Pi为第 i孔吸光值与整个平板相对吸光值总
和的比率
Si mpson指数计算公式：
D=1-Σ(Pi×Pi)。
式中，Pi为第 i孔吸光值与整个平板相对吸光值总
郁培义，等：氮添加对樟树林红壤微生物群落代谢功能的影响72 第 3期
和的比率。
Mclntosh指数计算公式：
H= 2in 。
式中：ni为第 i孔的相对吸光值。
1.5 统计分析
本文用 SPSS13.0 对数据进行处理分析，
Sigmaplot10.0 辅助作图。利用 One-Way ANOVA
方差分析不同氮添加处理对土壤微生物多样性差
异显著性 (P＜ 0.05)。
2 结果与分析
2.1 BIOLOG AN平板的 AWCD值的变化
平均颜色变化率 ( AWCD) 是土壤微生物群落
碳源利用能力的重要指标，反映了土壤微生物的
代谢活性。BIOLOG AN板用来测定土壤中的厌氧
菌及其活性，平板共有 96个孔，除第一孔只加水
与指示剂外，其他 95个孔，装有不同的碳源。由
图 1可以看出，不同施氮处理下，AWCD值呈现
先上升后趋于平缓的趋势。在培养的 156 h内，3
条曲线相互交叉，而在培养后期，曲线才明显分
离。说明不同施氮处理对樟树土壤微生物厌氧菌
代谢活性产生一定的影响。表现为：与对照相比，
高浓度施氮 (N2)促进厌氧菌代谢活性，而低浓度
施氮 (N1)抑制其活性。其代谢活性的先后顺序为：
N2＞ N0＞ N1。
树人工林利用平板 95种不同碳源的 AWCD值如
图 2所示。在终止培养的 240 h内，BIOLOG FF
平板均形成较为明显的 S型曲线。即经过 48 h短
暂的调整期后迅速增长直至生长停滞期。整体上
来看，对照组 N0的 AWCD值增加速率显著高于
其余施氮组，代谢活性的先后顺序为，N0＞ N2＞
N1。表明对照组的土壤微生物丝状真菌的代谢活
性较强。而经不同浓度施氮处理后，樟树土壤微
生物生理活性降低，代谢减慢。
图 1 AN板平均每孔吸光度随时间的变化规律
Fig. 1 Variation of AWCD values with time in BIOLOG
AN plate
2.2 BIOLOG FF平板的 AWCD值的变化
BIOLOG丝状真菌鉴定微平板 (FF 板 )主要用
于丝状真菌及其活性的鉴定。不同施氮处理组樟
图 2 FF板平均每孔吸光度随时间的变化规律
Fig. 2 Variation of AWCD values with time in BIOLOG FF
plate
2.3 BIOLOG GenIII平板的 AWCD值的变化
BIOLOG GenIII平板用来测定土壤中革兰氏
阳性好氧细菌与革兰氏阴性好氧细菌利用单一碳
源的能力。其变化速率越快，BIOLOG的代谢
活性就越强。如图 3所示，与其他微孔板相比，
BIOLOG GenIII平板中细菌启动速度较快，在 24
h之后即进入快速生长期直至增长达到平稳，其中
曲线 N0达到平稳期所需时间最长 (192 h)。可以看
出不同施氮处理土壤微生物的好氧细菌代谢活性
AWCD值均高于对照组，且施氮浓度越高代谢活
性越强，到培养后期，差异更加明显。由此进一
步说明，不同施氮处理对樟树土壤样品中好氧菌
均起到不同程度的促进作用。
2.4 BIOLOG YT平板的 AWCD值的变化
BIOLOG YT平板是用来测定土壤中酵母菌活
性。不同施氮处理土壤微生物酵母菌代谢活性产
生一定的影响。由图 4可以看出，同 BIOLOG FF
平板曲线变化相似，经过 48 h调整期立即进入增
长期，且增长速率较快，直至 156 h。总体来看，
在樟树林土壤样品培养的 240 h内，对照样地土壤
微生物酵母菌利用不同碳源的AWCD变化值最高，
73第 33卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
到培养结束时达最高值，与对照样地相比，不同
施氮处理土壤微生物酵母菌活性均降低，大小顺
序依次为：N0＞ N2＞ N1，说明不同施氮处理抑
制土壤微生物酵母菌的活性。
2.5 樟树林土壤微生物群落碳代谢功能多样性的
变化
为了对土壤微生物代谢功能多样性进一步
分析，本文分别计算了不同施氮处理水平，樟
树林土壤微生物 Shannon指数、Simpson指数和
McIntosh指数，它们分别从不同侧面反映土壤微
生物群落的丰富度、群落内常见物种的优势度和
微生物物种的均匀度。表 2列出了在培养 156 h的
吸光值计算结果。不同研究人员所采用的时间和
方法并不统一，如侯晓杰等利用 48 h的值 [10]，罗
希茜等采用 72 h[11]，郑华等则采用当 AWCD值接
近 0.6时来确定时间的方法 [12]。在本研究中，土
壤微生物经过延滞期适应 BIOLOG测试板提供的
环境，然后对数生长至 156 h之后生长减缓进入稳
定期。
表 2 不同氮处理樟树样地土壤微生物多样性变化
(平均值±标准误，n=3)
Table 2 Changes of soil microbial diversity in C. camphora
forest under different N treatments(means ± SE,
n = 3)
平板类型 施氮处理 Shannon指数 Simpson指数 McIntosh指数
BIOLOG
-AN板
对照组 N0 9.17±0.13a 0.88±0.01a 0.63±0.02a
低浓度施氮 N1 9.63±1.49a 0.89±0.19a 0.73±0.21a
高浓度施氮 N2 10.83±1.02a 0.94±0.03a 0.79±0.15a
BIOLOG
-FF板
对照组 N0 4.97±0.02a 0.94±0.01a 4.90±0.12a
低浓度施氮 N1 10.84±2.66b 0.69±0.13ac 1.42±0.49b
高浓度施氮 N2 7.57±0.78b 0.84±0.04bc 1.95±0.13b
BIOLOG-
GenIII板
对照组 N0 5.57±0.05a 0.95±0.01a 2.35±0.10a
低浓度施氮 N1 5.75±1.00a 0.92±0.04a 2.81±0.31ac
高浓度施氮 N2 6.54±0.91a 0.96±0.02a 3.25±0.29bc
BIOLOG
-YT板
对照组 N0 3.43±0.05a 0.79±0.01a 2.61±0.15a
低浓度施氮 N1 3.32±0.32a 0.54±0.23a 2.68±0.51a
高浓度施氮 N2 3.92±1.36a 0.68±0.13a 1.15±0.39b
† 同一列中，字母相同表示差异不显著, P＜0.05.
多样性指数结果表明，樟树林样地，不同施
氮处理 BIOLOG AN平板和 BIOLOG GenIII 平板
3个指数均显著高于对照样地，表明一定的施氮促
进土壤微生物细菌代谢功能多样性；BIOLOG FF
平板显示，不同施氮水平 3个指数中除 Shannon
指数较施氮组高外，其他指数均不同程度的低于
对照样地，其中高氮处理样地 N2达到显著水平，
说明外源氮输入抑制土壤微生物丝状真菌代谢功
能多样性；相比之下 BIOLOG YT平板对照样地
N0的 Simpson指数高于其他施氮处理样地，但未
达到显著水平，而 Shannon指数和McIntosh指数
低于施氮组。说明表征土壤微生物酵母菌代谢功
能多样性的 3个指数表现不一致。
3 结论与讨论
本研究通过 BIOLOG 4 种微生物平板对樟树
人工林红壤微生物代谢功能及其多样性的研究表
明，外源氮添加不同水平的处理对土壤微生物群
落代谢功能有不同程度的影响。具体表现为，氮
添加对土壤微生物细菌的代谢功能具有促进作用，
而抑制土壤微生物真菌和酵母菌的活性。大量研
究表明施氮可以通过改变土壤养分的有效性以及
调节土壤养分的储存和转化，改变土壤肥力，从
而刺激土壤微生物的生长 [13-14]，但长期施氮会对
土壤微生物活性起到抑制作用 [15]。这与王曙光 [16]
等中国科学院禹城实验站研究结果不一致，可能
图 4 樟树 YT板平均每孔吸光度随时间的变化规律
Fig. 4 Variation of AWCD values with time in BIOLOG
YT plate
图 3 樟树 GenIII板平均每孔吸光度随时间的变化规律
Fig. 3 Variation of AWCD values with time in BIOLOG
GenIII plate
郁培义，等：氮添加对樟树林红壤微生物群落代谢功能的影响74 第 3期
与施肥量、各地水热条件、土壤类型及理化性质
等的不同而有关，原因有待进一步的研究。土壤
微生物群落功能的多样性与土壤类型及土壤肥力
密切相关 [17-19]。不同的施氮处理对土壤微生物产
生不同的影响。施氮可能通过使土壤中的碳，氮
以及土壤 pH值发生变化影响土壤微生物的代谢功
能，从而进一步使微生物利用碳源的能力以及群
落功能多样性发生变化。
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[本文编校：吴 毅 ]