全 文 ：第29卷第6期　　　　　　　　 　西南 大学学 报 (自然科学版)　　　　　　　　　　　2007年 6月
Vo. 29　No. 6 Journal of Southw est Unive rsity (N atural Science Edi tion) Jun. 　2007
文章编号:1673-9868(2007)06-0131-05
南方红豆杉内生真菌 Bionectria sp.
的分离 、鉴定及代谢产物活性研究①
余　艳 , 　胡昌华
西南大学 药学院 , 现代生物医药研究所 , 重庆 400716
摘要:从南方红豆杉树皮中分离到 30株内生真菌 , 结合形态学和 ITS-5. 8S rDNA 序列两种鉴定方法 , 确定其中 1
株(XH004)为生赤壳属(B ionectria)真菌 , 这是目前世界上首次从红豆杉科植物中分离到该属内生真菌. 通过抑菌
实验 、细胞毒实验 、 TLC 检测和 H PCL 检测证明 XH004 代谢产物具有明显的抗菌和杀细胞作用 , 且极可能含有紫
杉醇或紫杉醇类似物.
关　键　词:南方红豆杉;内生真菌;生赤壳属;紫杉醇
中图分类号:Q93 文献标识码:A
内生真菌是指那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内 , 对植物组织没有引起明显病害症
状的真菌 , 主要由子囊菌及其无性型组成 , 也有少数担子菌和接合菌[ 1 , 2] . 内生真菌长期与植物共同生
活 , 因此不少种类具有与宿主相同或相似的有用物质. 开发利用重要经济植物体内的内生真菌具有深远
的现实意义.
南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)特产于中国 , 是国家一级保护植物 , 也是红豆杉属中分布最
广的树种. 由于南方红豆杉树皮中含有抗癌药物紫杉醇[ 3] , 导致该树种被大量砍伐 , 自然资源遭到极大破
坏. 为了获得可持续利用的药物资源 , 人们将目光转向南方红豆杉内生真菌 , 发现了众多产紫杉醇及其他
有用代谢产物的菌株[ 4-6] .
生赤壳属是 1999年 Rossman等根据形态学及分子生物学特征将一部分丛赤壳科菌种独立出来建立的
生赤壳科中的一个属[ 7] , 被归类为生赤壳科 , 肉座菌目 , 子囊菌纲 , 子囊菌门. 由于是新定义的一个属 , 所
以国内外对它的研究很少. 本研究发现一株新的南方红豆杉内生真菌 ———Bionectria sp. (编号 XH004), 并
以此为对象研究其代谢产物的活性.
1　材料与方法
1. 1　材　　料
南方红豆杉树皮采自重庆市北碚区缙云山 , 采集地海拔约 800 m , 树龄450 a , 胸径1. 3 m , 高约 20 m;
HeLa细胞为谈锋教授赠送;白色假丝酵母(Candida albicans)[ CMCC(F) 98 001] 、金黄色葡萄球菌
(S taphy lococcus aureus)[ CMCC(B) 26 003] 、枯草芽孢杆菌(Baci llus subt i lis)[ CMCC(B) 63 501] 、铜绿
假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)[ CMCC 10 104] 、大肠杆菌(Escherichia coli)[ CMCC(B) 44 103]为重
① 收稿日期:2006-12-28
基金项目:重庆市科技攻关资助项目(2003-8110).
作者简介:余　艳(1980-), 女 , 重庆江津人 , 硕士研究生 , 主要从事功能基因组与新药筛选的研究.
通讯作者:胡昌华 , 教授.
庆药品检验所提供;四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、紫杉醇对照品购自 Sigma公司;Pfu
高保真酶及其 Buf fer 、 dN TP 、 PCR产物纯化试剂盒购自北京赛百盛公司;引物合成及序列测序由大连宝
生物工程有限公司完成;BIO-RAD PCR仪;Molecular Devices Spect ra MAX 190酶标仪;岛津 20 A 高效
液相色谱仪.
1. 2　菌株分离
取新鲜南方红豆杉树皮 , 切成 2 cm×2 cm 块状 , 用 75%乙醇消毒 10 min , 再用灭菌双蒸水漂洗 6 ～ 7
次 , 取出置于 PDA 平板上 , 28 ℃培养 3 ～ 5 d. 肉眼观察挑出形态不同的菌株 , 分别传代至新鲜 PDA 平板
上培养. 传代 2 ～ 4次可将不同的内生真菌分离纯化.
1. 3　菌株鉴定
1. 3. 1　菌株形态特征
挑取少量菌丝于载玻片上 , 或者将培养后的带有菌丝的插片 , 用棉兰染液染色 , 在光学显微镜下观察
拍照.
1. 3. 2　菌株 5. 8S rDNA 及转录间隔区(I TS)序列的扩增与分析
用 CTAB法[ 8] 提取菌株基因组 DNA , 并以此为模板扩增 ITS-5. 8S rDNA 序列(真菌通用引物[ 9] :
ITS1 5-TCCG TAGGTGAACCTGCGG -3和 ITS4 5-TCCTCCGCTTA TTGA TAT GC-3;扩增条件:
94 ℃1 min , 56 ℃40 s , 72 ℃2 min , 30个循环).
测序后 , 用 NCBI 数据库中 BLAS T , 进行同源性比较 , 并利用“Vecto r N TI”软件做系统进化树分析.
1. 4　菌株代谢产物活性检测
1. 4. 1　代谢产物的提取
将菌株接种于含有 200 mL PDA 液体培养基的三角瓶中 , 180 r /min 、 28 ℃培养 3 d , 作为种子液. 然
后将种子液以 3%的接种量接入 4 L PDA 液体培养基 , 180 r /min 、 28 ℃培养 7 d , 即为发酵液. 发酵液
4 ℃、4 000 r /min , 离心30 min , 收集上清液. 向上清液中加入等体积的乙酸乙酯在超声波下萃取 30 min ,
静置 1 h使分层. 收集有机相 , 等分为 2 份 , 分别于 50 ℃减压蒸馏至干. 一份用 4 mL 甲醇溶解 , 用于
T LC 、HPLC和抑菌活性检测. 另一份用 2 mL 硅胶柱层析洗脱液(氯仿 /乙酸乙酯 /异丙醇=18. 2 /1. 5 /0. 3
(v /v /v))溶解 , 过硅胶柱分离收集洗脱组分(每 40 min收集 1管)作为细胞毒检测样品.
1. 4. 2　抑菌活性检测
在双碟法的基础上略做改进. 将直径 5 mm 的 3层滤纸片置于涂布有指示菌株的平板上 , 点样(每 3层
滤纸片上样 20 μL 被测样品), 37 ℃培养 24 h测量抑菌圈直径.
1. 4. 3　细胞毒活性检测
MTT 法[ 10] 检测被测样品对 HeLa细胞的细胞毒活性 , 并计算细胞杀伤率. 计算公式为:
细胞杀伤率 =(1 - 试验组 OD /对照组 OD) ×100%
1. 5　菌株代谢产物中紫杉醇的检测
1. 5. 1　TLC分析
将 2 ～ 5 μL被测样品点在 GF254 硅胶板上 , 以氯仿 /甲醇=9 /1(v /v)作为展开剂 , 80 ℃烘干后 , 用
0. 1%香兰素硫酸溶液显色.
1. 5. 2　HPLC 分析
HPLC检测条件为:岛津 ODS柱(150 mm×4. 6 mm , 5 μm), 甲醇 /水=65 /35(v / v), 流速 1 mL /min ,
柱温 25 ℃, 检测波长 227 nm.
2　结　　果
2. 1　菌株鉴定
2. 1. 1　形态特征
XH004在 PDA 平板上 , 28 ℃培养 3 d其菌落直径约 3 mm. 菌落微微隆起 , 正面白色 , 背面黄褐色 ,
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A. XH 004子囊;B. XH 004产孢结构.
图 1　菌株 XH004的显微照片(×400)
培养 7 d以后有色素分泌出来使培养基颜色变黄. 发
酵培养时菌丝结成 2 ～ 4 mm 的菌球. 菌丝松软 , 较
短 , 有隔;子座肉质 , 子囊球形(图 1-A). 产孢结构中
顶囊不明显 , 轮状分支出双层小梗;小梗紧密团结 ,
椭圆形分生孢子串生其上(图 1-B).
2. 1. 2　分子生物学分类鉴定
XH004的 I TS-5. 8S rDNA 扩增序列有 530 bp.
该序列在 NCBI 数据库中 BLAST , 显示与生赤壳属
(Bionectria)有极高的同源性(99%). 利用“Vecto r
NTI”软件 , 以最大简约化法做 XH004的系统进化树(图 2), 发现与生赤壳属真菌的亲缘关系最近.
图 2　XH004菌株 ITS-5. 8S rDNA的系统进化树
2. 2　XH004代谢产物活性检测
2. 2. 1　抑菌活性
通过对白色假丝酵母等 5株指示菌株的抑菌能力检测 , 表明 XH004发酵液中总代谢产物对白色假丝
酵母 、金黄色葡萄球菌 、枯草芽孢杆菌都有较好的抑菌活性 , 特别是对白色假丝酵母 , 抑菌圈达到 18 mm
(表 1).
表 1　XH004 发酵液中总代谢产物的抑菌活性
指　示　菌　株 抑菌圈直径 /mm
Candida albicans [ CMCC(F) 98 001] 18
S tap hy lococcus aureus [ CM CC(B) 26 003] 16
Bacillus subti lis [ CMCC(B) 63 501] 11
Pseudomonas aeruginosa [ CMCC 10 104] 7
Escherichia coli [ CMCC(B) 44 103] 7
2. 2. 2　细胞毒活性
经硅胶柱层析分离的组分中 , 6号组分和 8号组分细胞毒作用强(浓度范围 0. 1 ～ 0. 02 μg /mL). 在阴
性对照合理的情况下 , 经 6号和 8 号组分处理后 , HeLa 细胞形态明显改变 , 细胞膜破损 , 大量内容物溢
出. 6号组分 OD 570是 0. 025 , 对照组OD570是 0. 076. 计算 6号组分的细胞杀伤率为 67. 1%, 高于等体积的
0. 01 μg /mL 紫杉醇标准品的细胞杀伤率.
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2. 3　XH004代谢产物中紫杉醇的检测
A. 紫杉醇对照品(5μL 1 000μg /m L);
B. XH004代谢产物(2μL).
*表示紫杉醇的位置 , R f =0. 89.
图 3　XH004 代谢产物的 TLC检测
2. 3. 1　TLC分析
在 T LC检测中 , 以紫杉醇为对照 , 发现 XH004代谢产物出
现与对照相同的 R f 值(图 3).
2. 3. 2　HPLC 分析
在 HPLC检测中 , 以紫杉醇为对照 , 发现 XH004代谢产物出
现与对照非常接近的 R t值(图 4), 前者(图 4-A)为 12. 510 m in ,
后者(图 4-B)为 12. 687 m in.
A. XH004代谢产物;B. 紫杉醇对照品.
图 4　XH004 代谢产物和紫杉醇对照品 HPLC的 UV 检测图
3　讨　　论
ITS 是核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacer), 包括 ITS1和 I TS2. ITS1位于 18S rDN A基
因和 5. 8S rDNA 基因之间 , I TS2位于5. 8S rDNA 基因和 28S rDN A基因之间. I TS-5. 8S rDNA 测序是指
针对 I TS1 、5. 8 S rDNA 基因和 ITS2的测序. I TS-5. 8S rDNA 序列既具有保守性 , 又在科 、属 、种水平上
均保持特异性序列的特征[ 11] . 根据 Rossman AY[ 7] 等人对生赤壳属的研究 , 该属真菌都具有子囊 , 且其无
性型中多数具有扫帚状产孢结构. 这与本实验观察到的 XH004的形态特征吻合. 另外 , ITS-5. 8S rDNA
序列比对结果也显示 XH004与生赤壳属真菌的同源性达到 99%. 因此结合菌株形态特征和 I TS-5. 8S rD-
NA 序列分析 , 我们可以确定 XH004为生赤壳属真菌.
在过去的研究中 , 产紫杉醇内生真菌具有很高的多样性 , 分布在 30多个种属里面[ 5] , 这说明产生紫
杉醇的机制不受内生真菌种属的限制. 分离红豆杉内生真菌成为获得抗肿瘤物质的有效途径 , 也为内生
真菌的研究不断提供新的线索和资源. 本研究为红豆杉科内生真菌家族带来了新的成员 ———生赤壳属 ,
并且通过 T LC与 HPLC检测证明该属真菌 XH004的代谢产物含有紫杉醇或紫杉醇类似物. 这对于生赤
壳属的研究和抗癌药物的开发都具有深远的意义.
白色假丝酵母是人类真菌感染中最普遍的一种 , 通常寄生在正常人腔道粘膜上 , 当人体免疫力下降时
易诱发感染 , 尤其对于 AIDS 和肿瘤患者的危害极大 , 且全身白色假丝酵母感染的死亡率极高[ 12] . XH004
代谢产物不但对白色假丝酵母有显著的抑制作用 , 而且对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌这两种革兰式阳
性致病菌也有明显的抑制作用. 这可能是 XH004代谢产物中存在某种广谱抗生素对这三种菌都有抑制作
用 , 也可能是多种具特异性的抗生素分别产生的作用. 另外 , XH004代谢产物经硅胶柱层析纯化后所得组
分中的 6号和 8号组分还对 HeLa细胞有很强的杀伤作用. 综合该菌为红豆杉内生真菌新报道菌株以及其
代谢产物具有抗菌 、抗肿瘤细胞作用和含有紫杉醇或紫杉醇类似物这四个特点 , 分离纯化其代谢产物是寻
找新型抗菌 、抗肿瘤药物的有效途径.
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Separation and Identification of a New
Taxus chinensis var. mairei Endophytic Fungus
(Bionectria sp.)and the Activity of Its Metabolites
YU　Yan , 　H U Chang-hua
Institute of Modern Biopharmaceutics , School of Pharmaceutical Sciences , Southwest Universi ty , Chongqing 400716 , China
Abstract:Thirty endophy tic fungi have been isolated f rom the bark of Taxus chinensis var. mairei . Mo r-
phologic and ITS-5. 8S rDNA sequence identif ication methods used in combinat ion identified one of them
(XH004) to be B ionectria sp. , which is a new ly-reco rded species in Taxaceae endophy t ic fungi. Bacterio-
static test , cytotox ic test , thin layer chromatog raphy (T LC) and high pe rfo rmance liquid chromatog raphy
(HPLC) conf irmed that the metabolites of XH004 had obvious bacterio static and cy tocidal activit ie s and
sugge sted that they probably contain certain taxo l o r taxo l analo g.
Key words:Taxus chinensis var. mairei;endophy tic fungus;B ionectria;tax ol
责任编辑　胡　杨　　　　
135第6期　　余　艳 , 等:南方红豆杉内生真菌 Bionectria sp. 的分离 、鉴定及代谢产物活性研究