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瑞香狼毒活性成分对东亚飞蝗的生物活性和病理学研究



全 文 :2013年7月 四川大学学报(自然科学版) Jul.2013
第50卷   第4期 Journal of Sichuan University(Natural Science Edition) Vol.50 No.4
收稿日期:2012-09-05
基金项目:国家科技支撑计划(2011BAE06B01-23);国家863计划(2011AA10A202-3);国家自然科学基金(20972106)
作者简介:高嫚潞(1988-),女,硕士研究生.E-mail:452768343@qq.com
通讯作者:侯太平.E-mail:houtplab@scu.edu.cn
doi:103969/j.issn.0490-6756.2013.04.038
瑞香狼毒活性成分对东亚飞蝗的
生物活性和病理学研究
高嫚潞,吴   朗,陈   龙,周   卫,陶   科,侯太平
(四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都610064)
摘   要:采用活体生物试验方法进行活性跟踪,选取瑞香狼毒对东亚飞蝗毒杀活性最高的石
油醚萃取部分,测定瑞香狼毒活性成分对东亚飞蝗的生物活性及其中肠消化道的组织病理学
影响.结果表明:瑞香狼毒活性成分对东亚飞蝗具有拒食、触杀、胃毒活性及生长发育抑制作
用,其中拒食活性最为显著,24h、48h拒食中浓度(AFC50)分别为317.63、113.20mg/L;96h
触杀致死中浓度(LC50)、胃毒致死中浓度(LC50)分别为548.21mg/L、2486.19mg/L;生长发
育抑制作用也十分明显,48h生长发育抑制中浓度(EC50)为39.75mg/L.东亚飞蝗中肠组织
病理学变化研究结果表明,瑞香狼毒萃取物可破坏东亚飞蝗中肠的正常组织结构,引起其中肠
柱状上皮细胞脱落坏死.
关键词:瑞香狼毒;萃取物;东亚飞蝗;生物活性;病理学研究
中图分类号:S43    文献标识码:A    文章编号:0490-6756(2013)04-0875-06
Bioactivity and histopathology study of the active ingredients from
Stellera chamaejasme L.against Locusta migratoria manilensis(Meyen)
GAO Man-Lu,WU Lang,CHEN Long,ZHOU Wei,TAO Ke,HOU Tai-Ping
(Key Laboratory of Bio-resource and Eco-environment,Ministry of Education,
Colege of Life Sciences,Sichuan University,Chendu 610064,China)
Abstract:The activity of ligarine extracts from Stellera chamaejasme L.against Locusta migratoria
manilensis(Meyen)was tested and compared by bioassay methods.The biological activity and
histopathological effects of the active ingredients fromStellera chamaejasme L.on Locusta migratoria
manilensis(Meyen)and mid-gut cels were determined.The results showed that the active ingredients
fromStellera chamaejasme L.had anti-feeding activity,contacting activity,stomach toxicity activity
and inhibition of growth and development on Locusta migratoria manilensis(Meyen).The AFC50of
complete anti-feeding activity were 317.63mg/L,113.20mg/L in 24hour and 48hour;The LC50of
contacting activity were 548.21mg/L and the LC50of stomach toxicity activity were 2486.19mg/L in 96
hour for ligarine extracts from Stellera chamaejasme L.,active ingredients also had strong effect on
growth and development of Locusta migratoria manilensis(Meyen).The EC50of growth inhibition rate
was 39.75 mg/L in 48 hour.The histopathology studies on mid-gut from Locusta migratoria
manilensis(Meyen)showed that the ligarine extracts fromStellera chamaejasme L.damage the normal
  四川大学学报(自然科学版)   第50卷
structure of mid-gut and lead to columnar epithelial cels fel off and death.
Key words:Stellera chamaejasme L.,extracts,Locusta migratoria manilensis(Meyen),bioactivity,
histopathology study
1  引   言
东亚飞蝗[Locusta migratoria manilensis
(Meyen)]隶 属 于 昆 虫 纲 (Insecta)、 直 翅 目
(Orthoptera)、斑翅蝗科(Oedipodidae).蝗虫是给
我国农业生产造成危害和损失的重要害虫,历来与
水灾、旱灾并列为我国农业三大自然灾害.根据考
证中国历史上发生的940次蝗灾中,有90% 以上
是由东亚飞蝗引起的[1].数据统计20世纪我国东
亚飞蝗年发生面积最大可达400万hm2[2].以内蒙
古自治区为例,1999~2006年,该区连续暴发蝗
灾,累积草原蝗虫发生危害面积达0.622亿hm2,
虫口密度均在50头/m2 以上,最高可达650头
/m2.蝗灾不但给畜牧业造成巨大的经济损失,而
且严重威胁着我国草原的生态安全[3].一般年景蝗
灾区损失牧草约5.0% ~10%,蝗灾大发生年,损
失牧草可达50% ~70%,甚至可达90% 以上.灾
后禾本科和莎草科的草地基本变成光山秃岭,有些
地方寸草不生,对草原资源造成了严重破坏,加剧
了草原生态环境的恶化[4].以往采用化学农药灭蝗
在我国取得了一定的成效,但由于长期单一的使用
化学农药,使得蝗虫产生了抗药性,导致其后代更
加难以防治.从植物中筛选新的灭蝗活性物质,研
究开发低毒易降解、不易产生抗性的生物农药,已
成为目前关注的热点.
瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)为瑞香
科狼毒属多年生草本植物,广泛分布于我国东北、
华北、西南及西北等地区的草地及高山向阳处,资
源十分丰富[5].瑞香狼毒是需要防除的草地有毒植
物,但由于其含有高活性的杀虫物质,可被开发成
为植物源农药[6].根据本实验室近年来对瑞香狼毒
杀虫活性的深入研究及报道,瑞香狼毒提取物对蚜
虫、蝇、螟虫、菜青虫都具有较强的拒食、毒杀等活
性[7-10],但迄今为止还未见瑞香狼毒对蝗虫生物活
性的研究报道.本研究利用瑞香狼毒提取物进行活
体生物试验研究,筛选出具有灭蝗活性的石油醚萃
取物作为植物源灭蝗剂,探索了瑞香狼毒对蝗虫的
生物活性,并对其作用机理做了初步研究,系列研
究结果将为瑞香狼毒植物源灭蝗剂的研发奠定基
础.
2  材料与方法
2.1  材   料
供试植物:瑞香狼毒(Stellera chamaejasme
L.)采自四川若尔盖草原,将采集的瑞香狼毒全草
洗净、充分晾干、粉碎.
供试昆虫:东亚飞蝗 [Locusta migratoria
manilensis(Meyen)]购于四川成都市双流县蝗虫
室内饲养基地,在室温25±2℃,相对湿度50%,
网笼中黑麦草饲养.挑选健康,大小均匀一致的3
龄幼虫供试.
药品配制:瑞香狼毒提取物丙酮溶解后用1‰
吐温水梯度稀释成所需浓度的供试药液,对照液用
丙酮和吐温水配制.
2.2  方   法
2.2.1  瑞香狼毒活性成分的提取分离   按照瑞
香狼毒粉和溶剂1:10(w/v)的比例加入95% 乙
醇,室温冷浸24h后,50℃水浴搅拌浸提6h后抽
滤,得到棕黄色乙醇提取液,如此浸提3次,合并乙
醇提取液经旋转蒸发仪浓缩后制备得棕黄色膏状
乙醇粗提物.称取乙醇提取物,分别用不同极性溶
剂依次萃取,所用溶剂为石油醚、二氯甲烷、乙酸乙
酯、甲醇,旋转蒸发浓缩至膏状,生物活性测定结果
显示,石油醚萃取物的活性最好.
2.2.2  拒食活性测定   非选择性拒食活性的测
定采用叶碟法[11],将新鲜玉米叶剪成一定大小的
叶碟,放入供试药液内浸3s,取出晾干后放入锥形
培养瓶中,每瓶接入1只饥饿6h东亚飞蝗,重复3
次.24、48h后用方格坐标纸测量取食面积,根据非
选择性拒食公式计算出拒食率、回归方程、拒食中
浓度(AFC50)、AFC50 值的95% 置信限.
非选择性拒食率(%)=
对照组取食叶面积-处理组取食叶面积
对照组取食叶面积 ×100
2.2.3  触杀活性测定   触杀活性采用浸渍
法[12,13],将3龄蝗虫放入滤网中,浸入不同浓度的
药液中,3s后迅速取出,放回饲养笼中喂养,每笼
接入10只东亚飞蝗,重复3组,观察48h、72h、
96h死亡情况,并计算死亡率、校正死亡率和致死
中浓度(LC50).
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第4期    高嫚潞,等:瑞香狼毒活性成分对东亚飞蝗的生物活性和病理学研究  
死亡率(%)=
死亡虫数
供试总虫数×100
校正死亡率(%)=
处理组死亡率-对照组死亡率,
1-对照组死亡率 ×
100
2.2.4  胃毒活性测定   胃毒活性采用浸草
法[14],喂养草料放入供试药液内浸3s,取出晾干
后放入饲养笼中,每笼接入10只饥饿6h的东亚飞
蝗,重复3组,48h、72h、96h后调查试虫死亡情
况,按公式计算试虫的死亡率、校正死亡率和致死
中浓度(LC50).
2.2.5  生长发育抑制作用测定   采用饲喂称重
法[11],喂养草料放入供试药液内浸3s,取出晾干
后放入锥型饲养瓶中,每瓶放入一只饥饿6h的蝗
虫,重复3次,置于室温条件下饲养,取食24h和48
h后称东亚飞蝗3龄幼虫的体重,按公式计算出生
长发育抑制率.
生长发育抑制率(%)=
对照组体重增加量-处理组体重增加量
对照组体重增加量 ×100
2.2.6  对蝗虫胃肠消化道的组织病理学影响2×
104 mg/L石油醚萃取物浸虫浸叶处理蝗虫,分别
选取处理24h、48h和72h的蝗虫,10%甲醛固定
24h,解剖取其腹部组织,放入石蜡包埋盒中脱水、
透明、包埋,常规石蜡切片,厚度为3μm,H.E.染
色,封片,光学显微镜观察并拍照.
2.3  数据处理
对触杀、胃毒活性数据用Abbott公式进行校
正;对结果进行方差分析,并用Duncan’s新复极差
法进行各处理间的差异显著性分析;线性回归按照
机率对数绘图法分析求得;用SPSS17.0版完成试
验数据的 Duncan’s检验及标准误差计算[15],用
Excel求 出 AFC50、LC50、EC50 及 95% 置 信 区
间[16].
3  结   果
3.1 瑞香狼毒石油醚萃取物对东亚飞蝗的拒食活性
测定结果表1显示,由表1可看出瑞香狼毒石
油醚萃取物对东亚飞蝗有很好的拒食作用:瑞香狼
毒石油醚萃取物对东亚飞蝗的非选择性拒食率的
方差分析均达到显著水平,随着石油醚萃取物质量
浓度的增大,拒食率明显增加.48h拒食活性明显
高于24h,所以瑞香狼毒石油醚萃取物对东亚飞蝗
的拒食作用具有持久性.以其浓度对数为自变量
(X),拒食率的机率值(Y)为因变量作回归,则:
24hy=0.828x+2.927,R=0.980,AFC50及95%
置信区间317.63(294.21-342.91)mg/L,SE=
12.41;48 h y=1.532x+1.855,R=0.979,
AFC50及95%置信区间113.20(107.02-119.74)
mg/L,SE=3.24.
表1  瑞香狼毒石油醚萃取物对东亚飞蝗的拒食活性
Tab.1 Anti-feeding activity of ligarine extracts fromStellera chamaejasme L.against
Locusta migratoria manilensis(Meyen)
浓度
(mg/L)
24h平均
取食面积 (mm2)
24h拒食率
(%)
48h平均
取食面积(mm2)
48h拒食率
(%)
5×103  147±80e 88.18  4.33±3e 99.75
1.25×103  491.33±100d 60.50  115.33±22e 93.45
3.13×102  664±51cd  46.62  711.67±111d 59.60
7.81×10  832.33±51bc  33.09  1083±108c 38.52
1.95×10  1033.67±79b 16.91  1436±66b 18.49
CK  1244±2a 1761.67±82a
注:表中数据为平均数±标准误差,同列数据后标不相同字母者,表示经Duncan’s新复极差测验差异显著(P<0.05).
3.2 瑞香狼毒石油醚萃取物对东亚飞蝗的触杀活性
测定瑞香狼毒石油醚萃取物对东亚飞蝗的触
杀活性,结果见表2.由表2可看出瑞香狼毒石油醚
萃取物对东亚飞蝗有较好的触杀活性:随着质量浓
度的增大和时间的延长,东亚飞蝗的校正死亡率都
在升高.以其浓度对数为自变量(X),死亡率的机
率值(Y)为因变量作回归,48h、72h、96h,LC50
分别为2599.91mg/L、1328.68mg/L和546.21
mg/L,观察用药后蝗虫出现麻痹症状,即貌似死
亡,但经刺激后仍有微弱反应,弹跳能力明显下降,
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  四川大学学报(自然科学版)   第50卷
表2  瑞香狼毒石油醚萃取物对东亚飞蝗的触杀活性
Tab.2 Contacting activity of ligarine extracts fromStellera chamaejasme L.against
Locusta migratoria manilensis(Meyen)
处理时间(h) 毒力回归方程(y) 相关系数(R) LC50(95% 置信区间)(mg/L)
48  1.148x+1.078  0.985  2599.91(1551.02-4358.08)
72  1.242x+1.122  0.987  1328.68(846.25-2086.12)
96  2.767x-2.579  0.941  548.21(352.34-852.96)
四肢无法支撑虫体,部分蝗虫在用药后无法正常蜕
皮,在蜕皮过程中死亡.
3.3 瑞香狼毒石油醚萃取物对东亚飞蝗的胃毒活性
测定不同质量浓度石油醚萃取物对东亚飞蝗
的胃毒活性,结果见表3.瑞香狼毒石油醚萃取物
对东亚飞蝗有胃毒活性:随着质量浓度的增大和时
间的延长,东亚飞蝗的校正死亡率升高;以其浓度
对数为自变量(X),死亡率的机率值(Y)为因变量
作回归,48h、72h、96h,LC50分别为11770mg/L、
4213.75mg/L和2486.19mg/L.观察死亡虫体,
有虫体发黑,肛门排出褐色液体现象.
表3  瑞香狼毒石油醚萃取物对东亚飞蝗的胃毒活性
Tab.3 Stomach toxicity activity of ligarine extracts fromStellera chamaejasme L.against
Locusta migratoria manilensis(Meyen)
处理时间(h) 毒力回归方程(y) 相关系数(R) LC50(95% 置信区间)(mg/L)
48  1.345x-0.477  0.973  11770(6909.53-20049.55)
72  1.559x-0.650  0.981  4213.75(3095.81-5735.40)
96  1.819x-1.175  0.993  2486.19(1872.56-3300.91)
3.4  瑞香狼毒石油醚萃取物对东亚飞蝗的生长
发育的抑制
测定结果表4显示,由表4可看出瑞香狼毒石
油醚萃取物对东亚飞蝗体重具有显著的抑制作用,
生长抑制率随药物质量浓度的增加和用药时间的
延长而升高.以其浓度对数为自变量(X),增长抑
制率值(Y)为因变量作回归,则:24hy=0.63x+
3.487,R=0.994,EC50为250.49mg/L;48hy=
1.65x+2.362,R=0.980,EC50 为39.75mg/L.
显著的生长发育抑制作用,可能也与拒食作用相联
系.根据观察,瑞香狼毒石油醚萃取物除了使东亚
飞蝗的体重减轻之外,部分蝗虫也出现蜕皮过程受
阻,发育畸形等现象.
表4  瑞香狼毒石油醚萃取物对东亚飞蝗的生长抑制
Tab.4 Inhibition activity of ligarine extracts fromStellera chamaejasme L.against
Locusta migratoria manilensis(Meyen)
浓度
(mg/L)
24h体重增重
(mg/insect)
24h增长
抑制率(%)
48h体重增重
(mg/insect)
48h增长
抑制率(%)
3.13×102  24.73±6b 51.50  4.5±9d 94.74
1.56×102  28.23±2ab  44.64  19.67±5d 77.025
7.81×10  30.73±2ab  39.74  26.7±3cd  68.81
3.91×10  35.6±11ab  30.20  38.53±4bc  54.98
1.95×10  38.97±6ab  23.59  60.83±1ab  28.93
CK  50.97±11a 85.63±19a
注:表中数据为平均数±标准误差,同列数据后标不相同字母者,表示经Duncan’s新复极差测验差异显著(P<0.05).
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第4期    高嫚潞,等:瑞香狼毒活性成分对东亚飞蝗的生物活性和病理学研究  
3.5  瑞香狼毒石油醚萃取物对蝗虫胃肠消化道
的组织病理学影响
正常蝗虫中肠消化道由外至内由肌肉层
(ml)、肠壁细胞层和围食膜(pmb)组成,肠壁细胞
主要由再生细胞(rgc)和上皮消化细胞(dgc)组
成,再生细胞的细胞质染色较浅,细胞核大.对照组
蝗虫上皮消化细胞排列整齐,肌肉层、肠壁细胞层、
围食膜完整,部分细胞有分泌现象(图1A);处理
24h后,围食膜消失,上皮消化细胞有萎缩脱落现
象,再生细胞增多,细胞核膨大,肌肉层完整(图
1B);处理48h后,上皮消化细胞出现大面积脱落,
残留肌肉层和再生细胞(图1C);处理72h后,再生
细胞坏死,试虫中肠的肠壁细胞层基本脱落消融而
只残留肌肉层(图1D).
图1  蝗虫中肠的组织病理变化
A.空白对照组中肠切片;B.处理24h中肠切片;C.处理48h中肠切片;D.处理72h中肠切片
Fig.1 The histopathological changes of grasshopper midgut
A.The blank control group of mid-gut slice,B.The mid-gut slice for 24hafter processed,
C.The mid-gut slice for 48hafter processed,D.The mid-gut slice for 72hafter processed
4  讨   论
研究表明,瑞香狼毒石油醚萃取物对东亚飞蝗
具有显著的拒食、触杀、生长发育抑制作用,而胃毒
作用则较为一般,这可能是由于实验时,瑞香狼毒
石油醚萃取物对东亚飞蝗较高的拒食作用,使得蝗
虫取食量减少,主要依靠体内水分和脂肪来维持生
命.
根据实验中东亚飞蝗出现的取食量下降,死亡
蝗虫肛门排出褐色液体等现象,推测瑞香狼毒石油
醚萃取物对蝗虫的胃肠消化道产生影响.由于中肠
是蝗虫分泌消化酶和消化食物、吸收营养物质的主
要部位,又由于中肠常为各种药物作用的靶标部
位,故用药物处理后蝗虫中肠做切片研究.研究结
果显示药物处理24h后中肠柱状上皮细胞受到破
坏,局部脱落,72h后中肠仅残留肌肉层,围食层及
肠壁细胞病变坏死这也再一次证实了瑞香狼毒中
含有不利于蝗虫消化的有毒物质,影响蝗虫对食
物的正常摄取及吸收.由于瑞香狼毒对蝗虫毒理机
制比较复杂,有待对受瑞香狼毒影响的靶标酶系开
展进一步的系统研究.
蝗虫一直是造成农业损失的重要害虫,几个世
纪以来,人们都一直在探寻防治蝗虫的方法.化学
农药防治蝗虫具有快速和高效的特点,但化学农药
毒性强、残留时间长、对环境污染严重、对人畜有害
及杀伤天敌,而且长期使用单一的化学农药,容易
使蝗虫产生抗药性,使其后代更难以防治.与化学
农药相比,生物农药具有对环境污染小,对人畜相
对安全,病虫害不易产生抗性等优点而符合IPM
和农业可持续发展的要求.瑞香狼毒资源丰富,生
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  四川大学学报(自然科学版)   第50卷
命力旺盛,这些有利的天然条件为我们将其开发为
生物农药提供了充足的材料来源.据《中药大辞典》
载,瑞香狼毒可入药,有逐水祛痰、破积杀虫的功
效[17].近年医学研究表明瑞香狼毒还具有抗病毒
和抗肿瘤作用[18],Ikegawa等发现狼毒素 A,B,C
显示有
较强的抗 HIV病毒作用,由瑞香狼毒根分离
得到的木脂素类化合物桉素也具有抗 HIV病毒作
用[19].孔洁等(2009)报道瑞香狼毒提取物对小白
鼠经口急性毒性的LD5 0>500mg/kg.根据国家
标准 GB15670-1995,可以判定瑞香狼毒的急性经
口毒性属于低毒级,对白兔的急性皮肤刺激属无刺
激性,对白兔的眼刺激属轻度刺激性[20],所以瑞香
狼毒作为农用植物灭蝗剂安全可靠,可为瑞香狼毒
进一步利用开发提供参考.
本文以对农业生产危害严重的东亚飞蝗作为
室内活性试验模型,测试了瑞香狼毒石油醚萃取物
对东亚飞蝗的室内拒食、触杀、胃毒及生长发育抑
制作用.首次报道了瑞香狼毒石油醚萃取物对东亚
飞蝗的生物活性及组织病理学研究结果,为进一步
开发和研究出高活性、低毒、低残留的新型抗蝗生
物源农药提供了有价值的参考.
参考文献:
[1]  孙福来.荒地垦植与洼地育苇对东亚飞蝗的控制作
用 [J].植物保护,2006,32(5):92.
[2]  冯晓东.近年我国东亚飞蝗发生特点及原因分析
[J].中国植保导刊,2007,27(10):34.
[3] 刘艳,张泽华,王广军.草地蝗虫防治的经济阈值与
生态阈值研究进展 [J].草业科学,2011,28(2):
308.
[4]  王俊梅,豆卫,冯今,等.草原蝗虫为害对高寒草原
生物量影响的研究 [J].草原与草坪,2010,30(5):
59.
[5]  郭霞,丁文姣,杨甲月,等.瑞香狼毒根提取物及不
同溶剂萃取物对马铃薯腐烂茎线形虫触杀活性研究
[J].植物保护,2011,37(1):128.
[6]  张可君,何义国,周俗,等.瑞香狼毒对菜粉蝶幼虫
的杀虫活性 [J].植物保护学报,2005,32 (3):
305.
[7] Liu Q,Jia H,Xiao B,et al.A new compound
against Peries rapae from Stelera chamaeiasme[J].
Natural Product Research,2008,22(4):348.
[8]  何义国,张可君,肖波,等.瑞香狼毒素对菜粉蝶幼
虫的拒食活性及其作用机制 [J].中国生物防治,
2006,22(增刊):33.
[9]  曹威,张可君,龚晓霞,等.瑞香狼毒素对蚜虫防治
的初步试验 [J].四川动物,2005,24(4):548.
[10]  田仁君,马均,周丽,等.瑞香狼毒对稻螟的生物
活性研究 [J].四川大学学报:自然科学版,2005,
42(6):1266.
[11]  秦小萍,赵红艳,杨美林.坡柳种子提取物对菜青
虫取食和生长发育的影响 [J].农药,2007,46
(7):494.
[12]  赵成爱,余梅燕,吴现芳,等.八宝景天乙醇提取
物对菜青虫的生物活性 [J].农药,2012,51(1):
62,70.
[13]  李廷刚,段友臣,邓鹏.银杏叶乙醇提取物对菜青
虫的触杀和拒食活性 [J].山东农业科学,2011,
1:76.
[14] 李莉,李文庆,卢代华,等.麻疯树萜醇I的杀虫活
性及其对菜粉蝶幼虫PKC活性的影响 [J].四川大
学学报:自然科学版,2010,47(6):1402.
[15]  齐君山,辛志梅,李林,等.应用SPSS软件进行农
药实验数据的统计分析 [J].山东农业科学,2008,
7:100.
[16] 张志祥,徐汉虹,陈东美.Excel在毒力回归计算中
的应用 [J].昆虫知识,2002,39(1):67.
[17]  江苏新医学院.中药大辞典(下)[M].上海:上海
科学技术出版社,1986.
[18] Feng W J,Ikekawa T,Yoshida M.The antitumor
activities of gnidimacrin isolated from Stellera
chamaejasme L.[J].Chinese Journal of Cancer
Research,1996,8(2):101.
[19] Ikegawa T, Ikegawa A. Chamaejasmin and
euchamaejasmin  extraction  from  Stellera
chamaejasme and their antiviral activities[P].Jpn
Kokai Tokyo Koho JP:08 311,056 [96311,
056](CI.C07D311/32),1996-11-26.
[20]  孔洁,吴佳君,史冠莹,等.瑞香狼毒提取物对试
验动物急性毒性及活性的初步研究 [J].四川动
物,2009,28(2):171.
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