全 文 ：DOI:10． 3724 /SP． J． 1096． 2011． 01917
超高效液相色谱串联质谱联用法快速测定生物样品中莽草毒素
张秀尧* 蔡欣欣
(温州市疾病预防控制中心，温州 325001)
摘 要 建立了超高效液相色谱三重四极杆质谱法检测血浆、尿液、呕吐物和药材中八角属植物有毒倍半萜
内酯标志物莽草毒素的检测方法。血浆样品经多重机制杂质吸附萃取净化柱萃取，尿液样品经硅藻土柱吸
附叔丁基甲醚萃取、植物样品经叔丁基甲醚液液萃取，以水和甲醇为流动相进行梯度洗脱，在 UPLC BEH C18
柱上实现分离，采用负离子 ESI-MS /MS MRM方式检测。一次进样分析时间为 5 min。血浆和尿液中的平均加
标回收率分别为 92． 6% ～ 100． 3%和 101% ～ 118%;相对标准偏差分别为 3． 8% ～ 11%和 6． 4% ～ 17% (n =
6) ;定量限(S /N = 10)分别 为 2． 0 和 1． 0 !g /L。本方法简单、准确、灵敏，适合于莽草毒素中毒样品的测定。
关键词 超高效液相色谱串联质谱;莽草毒素;血浆;尿液;生物样品
2011-03-31 收稿;2011-06-28 接受
本文系温州市医学重点学科、温州市第三轮“311”工程建设项目基金(No． 2008012)资助
* E-mail:xyzwz123@ 126． com
1 引 言
八角茴香为木兰科植物八角茴香(Illicium verum hook． f．)的果实，有温阳，散寒，理气等功效，用于
治疗寒疝腹痛、肾虚腰痛、脘腹冷痛等病症，民间常用作烹饪调料。由于同属植物果实的形态相似，八角
茴香有许多伪品，如红茴香、莽草、野八角等，有的具有毒性，误用会引起中毒［1，2］，特别是日本莽草
(Illicium anisatum L．)毒性较大。同属多种植物中曾分离出莽草毒素(Anisatin)、新莽草毒素(Neoani-
satin)和伪莽草毒素(Pseudoanisatin)等倍半萜内酯类成分［3，4］，并证实莽草毒素为 γ-氨基丁酸受体非竞
争性拮抗剂［5，6］，小鼠腹腔注射可引起惊厥、死亡，LD50为 0． 76 mg /kg 体重
［7］。饮用八角茴香茶引起的
中毒事件在欧美国家也时有报道［8］。为了控制八角茴香品质和鉴别伪品，可采用热解析-气质联用法测
定挥发油特征成分［9］，采用荧光显微镜和扫描电镜进行显微结构鉴别［10］，采用 PCR 技术分析核酸片
段［11］，采用薄层层析法对植物中黄酮类和酸性成分进行分析，结合液相色谱串联质谱联用法测定莽草
毒素［12］。上述方法中，仅 LC-MS /MS方法可对引起中毒的主要成分莽草毒素进行定量测定。本研究建立
了 UPLC-MS /MS快速测定生物样品中莽草毒素的检测方法，并应用于实际样品的测定，方法简便、快
速、准确和灵敏。
2 实验部分
2． 1 仪器与试剂
Aquity UPLC-Quattro Premier XE 超高效液相色谱-串联质谱仪，配电喷雾源，Masslynx 4． 1 工作站
(美国 Waters公司) ;BRUKER AVANCE 500 MHz超导核磁共振仪(瑞士 Bruker公司) ;MR32i大容量高
速冷冻离心机(法国 Jouan 公司) ;ULTRA-TURRAX T-25 型匀质机(德国 IKA-WERKE 公司) ;R-205 旋
转蒸发仪(瑞士 Burch公司) ;2510 超声波清洗机(美国Branson公司) ;MS2 旋涡混旋器(德国 IKA 公
司) ;N-EVAP氮吹仪(12 孔，美国 Organomation 公司) ;TDZ5-WS 自动平衡离心机(湘仪离心机仪器有
限公司) ;Gradient A10 Mill-Q 超纯水器(法国 Millipore公司)。
乙腈和甲醇 (HPLC 级，德国 Merck 公司) ，叔丁基甲醚 (HPLC 级，美国 Tedia 公司)。Cleanert
MAS-B管(60 mg /1 mL)、Cleanert MAS-A管(60 mg /1 mL)、Cleanert 蛋白沉淀管(1 mL)和 Cleanert SLE
管(200 mg /3 mL) (天津博纳艾杰尔科技公司)。八角茴香，红茴香(市售)。
2． 2 莽草毒素标准品制备
第 39 卷
2011 年 12 月
分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究简报
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第 12 期
1917 ～ 1920
150 g红茴香果实经石油醚脱脂、甲醇提取，浓缩提取物除去甲醇，残渣溶于水，再用乙酸乙酯萃取，
萃取物经硅胶柱多次层析，氯仿-甲醇(97 ∶ 3，V /V)洗脱，得无色针晶(30 mg) ，ESI －质谱图见图 1。
1HNMR谱(CD3OD，500 MHz)δ:0． 998(1H，d，J = 7． 5 Hz，15-H) ，1． 503(1H，s，12-H) ，1． 72-1． 97(2H，
图 1 莽草毒素的 ESI －质谱和化学结果图
Fig． 1 ESI － Mass spectrum and chemical structure of
anisatin
m，2α，2β-H) ，2． 479(1H，dd，J = 3． 5 /14． 5 Hz，8α-
H) ，2． 494(1H，m，1-H) ，4． 031(1H，d，J = 6． 5 Hz，
14α-H) ，4． 188(1H，s，10-H) ，4． 217(1H，dd，J =3． 5 /2．
0 Hz，7-H) ，4． 472(1H，d，J =6． 5 Hz，14β-H) ，4． 85
(1H，dd，J = 9． 6 /4． 8 Hz，3β-H) ;13CNMR谱(CD3OD，
125 MHz)δ:13． 56，21． 77(q，15-C，12-C) ，27． 93，41．
93，65． 65(t，，8-C，2-C，14-C) ，38． 12，70． 62，71． 99，82．
53(d，1-C，10-C，3-C，7-C) ，51． 19，65． 54，75． 41，82． 53，
85． 71，169． 55，176． 05(s，，9-C，5-C，6-C，7-C，4-C，
13-C，11-C) ，以上数据与文献［7，13］相符，鉴定为莽草
毒素。固体标准物用甲醇配制成 1． 0 g /L 标准贮备
液，再稀释成标准使用液，保存于 － 35 ℃冰箱中。
2． 3 色谱和质谱条件
ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(50 mm 2． 1 mm 1． 7 !m)和VanGuard BEH C18保护柱(5 mm ×2． 1 mm
1． 7 !m)，购于Waters公司;流动相 A为甲醇，B为水，梯度洗脱:0 ～3． 0 min，10% ～40% A;3． 0 ～3． 1 min，
40% ～95% A;3． 1 ～4． 0 min，95% A;4． 0 ～5． 0 min，10% A。流速 0． 3 mL/min;柱温 45 ℃;进样体积 10 !L。
电喷雾离子源负离子多反应监测(MRM)模式。ESI 毛细管电压:－ 2． 7 kV;离子源温度:120 ℃;
锥孔反吹气流量:50 L /h，脱溶剂温度:380 ℃;脱溶剂气流量:500 L /h;碰撞室氩气压力:0． 352 Pa;
锥孔电压:28 V;母离子 m/z 326． 9，子离子为 m/z 296． 9(定性离子)和 m/z 126． 8 (定量离子) ，其碰撞
能量分别为12 和 14 eV。运行开始时，色谱柱流出液经六通切换阀切换至废液中，直到 1． 80 min;质谱开
始采集数据，直到2． 7 min结束，同时六通切换阀又将柱流出液切换至废液中。
2． 4 样品前处理
2． 4． 1 血浆样品 100 !L血浆移入 Cleanert MAS-B柱中，快速加入 500 !L乙腈-甲醇 (9∶ 1，V /V)混
合液，旋涡 15 s，静置 3 min以上，以 3500 r /min离心 5 min，流出液于 50 ℃以氮气吹干，加入 50 !L 10%
甲醇，旋涡，待测。在 6只MAS-B柱中各加入 100 !L空白血浆，再分别加入莽草毒素标准溶液浓度分别为 2．
0，5． 0，10，20，50和 100 !g /L，旋涡 15 s，放置 30 min后，与样品一起处理，制作标准工作曲线。
2． 4． 2 尿液样品 吸取 200 !L尿液加至 Cleanert SLE柱中，静置 5 min以上，将 2． 1 mL叔丁基甲醚分
3 次加入，在重力作用下进行洗脱，洗脱液在 50 ℃以氮气吹干，加入 100 !L 10%甲醇复溶，待测。
在 6 只试管中分别加入适量标准溶液，在 50 ℃以氮气吹干，加入 1． 0 mL尿液，使莽草毒素的浓度
分别为 1． 0，2． 0，5． 0，10，50 和 100 !g /L，放置 30 min后，与样品一起处理，制作标准工作曲线。
2． 4． 3 呕吐物 称取 1． 00 g 样品于 50 mL 具塞离心管中，加入 10 mL 甲醇，超声提取 10 min，
10000 r /min离心 5 min，吸取 2． 0 mL上清液于 50 ℃以氮气吹干，加入 200 !L 水溶解残渣(必要时用
1 mL正己烷脱酯 1 次) ，吸取 100 !L水液加至 MAS-B柱中，按 2． 4． 1 节操作。
2． 4． 4 八角茴香和红茴香等伪品 称取 1． 00 g样品，按 2． 4． 3 节提取，取 500 !L上清液，于 50 ℃以氮
气吹干，加入0． 5 mL水溶解残渣，用 2 mL正己烷脱酯 1 次，再用各 2 mL 叔丁基甲醚萃取 3 次，合并萃
取液，于 50 ℃以氮气吹干，加入 500 !L 10%甲醇，旋涡，过 0． 20 !m 滤膜后，待测。红茴香提取液用
10%甲醇适当稀释，待测。红茴香药酒以氮气吹去乙醇后，用 10%甲醇稀释，待测。
3 结果与讨论
3． 1 质谱和色谱条件的优化
分别在电喷雾正、负离子检测方式下对质谱测定条件进行优化，使样液中目标化合物的分子离子对
8191 分 析 化 学 第 39 卷
信号达到最大，莽草毒素只能在电喷雾负离子模式下离子化，最终选择 ESI 负离子 MRM 模式进行测
定。遵循国际惯例，确证分析需要 4 个识别点，选择两对分子离子对，设定合适的峰驻留时间确保色谱
峰的采样点数在 15 ～ 20 点，从而得到较好的定量重复性。
比较 UPLC BEH C18色谱柱(50 mm × 2． 1 mm ×1． 7 !m)和 UPLC HSS T3 色谱柱(100 mm ×2． 1 mm
×1． 7 !m)发现，前者分离效果好，分析时间短。以水-甲醇和水-乙腈系统作为流动相，实验表明，水-
甲醇作为流动相时，莽草毒素的离子化效率高，既有足够的灵敏度，又能与其它成分完全分离、得到良好
的峰型，一次进样分析仅需 5 min。
3． 2 样品前处理方法的选择
植物果实中的莽草毒素的前处理可先用正己烷脱脂，除去挥发油等弱极性成分，再用甲醇提取。提
取物的水液吸附在 Extrelut柱(硅藻土柱)上，用叔丁基甲醚萃取净化［13］。
血浆样品分别通过 MAS-A，MAS-B和蛋白沉淀柱。比较发现，MAS-B柱去除蛋白和磷酯等杂质效
果最好，基质效应最小;尿液样品采用 SLE 柱吸附叔丁基甲醚萃取可去除尿中基质成分，净化效果明
显。本方法取样量小、操作方便、快速(每小时可处理 15 份样品)、回收率好。血浆样品如果只用乙腈
作沉淀萃取剂，血浆蛋白沉淀时易抱团，可能会包裹待测物。在乙腈中加入 10%甲醇，沉淀成絮状，待
测物易于溶出提取。采用离心洗脱，样品能成批快速处理。
3． 3 基质效应和样品的个体差异性
采用本方法样品前处理与溶剂标准相比较，血浆和尿液样品还存在基质增强效应，约增强 20%，尝
试采用阴性样品基质匹配法克服基质增强效应。由于个体差异，不同来源的血浆和尿液样品可能存在
不同的基质效应，最终影响检测方法的准确度和精密度。本研究对不同来源样品引起的基质效应进行
评估，分别使用 6 种不同个体的空白血浆和空白尿液制作标准工作曲线;6 条的斜率相对标准偏差分别
为 8． 6%(血浆)和 4． 8%(尿液) ，符合 FDA生物分析方法确证指导原则关于斜率的 RSD应小于 15%的
要求［15］，说明样品的个体差异对结果的影响较小，可以采用基质匹配法有效抵消基质增强作用。
红茴香等样品中莽草毒素的含量较高，甲醇提取后再用流动相高倍稀释，可以克服基质效应。八角
茴香及其制品中莽草毒素的含量较低，其甲醇提取物的水溶液经正己烷萃取除去挥发油等弱极性成分
后，用叔丁基甲醚萃取 3 次，回收率大于 90%，去除了杂质，消除了基质效应。
3． 4 方法的线性范围和检出限
在空白样品中，加入系列浓度的标准溶液，制作 6 点系列基质标准溶液，进行样品前处理。在选定
的色谱和质谱条件下测定，莽草毒素的保留时间为 2． 34 min，基质空白均无干扰。采用 Masslynx 4． 1 中
Targetlynx组件，以定量离子对的峰面积对浓度进行回归(权重取 1 /x) ，血浆和尿液中莽草毒素在 2． 0 ～
100 !g /L和 1． 0 ～ 100 !g /L浓度范围的相关系数分别在 0． 9959 ～ 0． 9990 和0． 9939 ～ 0． 9996 之间。
在空白样品中添加系列低浓度的标准溶液，样品经前处理，然后测定。以定量离子对 3 倍信噪比的响
应值对应的样品浓度为检出限(LOD) ，以 10倍信噪比为定量限(LOQ)。血浆和尿液中莽草毒素的检出限
均为 0． 5 !g /L，定量限分别为 2． 0和 1． 0 !g /L，能够满足公共卫生突发事件和临床毒物学检测的要求。
3． 5 方法的精密度和加标回收实验
空白血浆样品添加 2． 0，10 和 50 !g /L 的莽草毒素，空白尿液添加 1． 0，10 和 50 !g /L 的莽草毒
素，进行加标回收和精密度实验，血浆和尿液的加标回收率分别为 92． 6% ～ 100． 3%和 101% ～ 118%，
相对标准偏差分别为 3． 8% ～11%和 6． 4% ～17%(n = 6) ，符合痕量分析的要求。
3． 6 样品的稳定性实验
分别用空白血浆、尿液加标溶液配制成含 10 !g /L莽草毒素的质控样品，进行 3 次冷冻和解冻循环
(－ 20 ℃至室温) ，与新制备的样品进行测定比较，相对偏差的绝对值均小于 8%;将含 10 !g /L莽草毒
素的血浆和尿液质控样品的处理液置于自动进样瓶中，在样品室中放置 24 h，与新处理的样品进行比较
测定，相对偏差的绝对值均小于 7%，表明在上述条件下样品未发生明显分解。
3． 7 实际样品的检测
2010 年 4 月，温州市泰顺县曾发生一起误饮山木蟹(红茴香植物的根)药酒引起 3 人中毒事件，利
9191第 12 期 张秀尧等:超高效液相色谱串联质谱联用法快速测定生物样品中莽草毒素
用本方法从药酒中检出莽草毒素，其含量为 113 mg /L。对市售 1 份红茴香、2 份八角茴香和 1 份五香粉
进行检测，莽草毒素的含量分别为 645000，191，92 和 18 !g /kg，与文献［13］一致。
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Rapid Determination of Anisatin in Biological Sample by Ultra Performance
Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Mass Spectrometry
ZHANG Xiu-Yao* ，CAI Xin-Xin
(Wenzhou Center for Disease Control and Prevention，Wenzhou 325001)
Abstract A rapid UPLC-MS /MS method was developed for the quantitative determination of anisatin，as a
marker of the sesquiterpene lactones in various Illicium species，in plasma，urine，vomit，and plant samples
using a triple quadrupolep mass spectrometer． The proposed assay includes multi-function impurity adsorption
SPE cleanup procedure for plasma sample，diatomite solid supported liquid / liquid extraction for urine，and
tert-butyl methyl ether liquid / liquid extraction for plant sample． The satisfactory recoveries were obtained．
Chromatographic separation was performed on an UPLC BEH C18 column (50 mm 2． 1 mm 1． 7 !m)using
gradient elution with water-methanol，and detected by the negative electrospray ionization-MS /MS method un-
der multiple reaction monitor mode． The cycle time of each analysis was 5． 0 min． The average recoveries were
92． 6% －100． 3% and 101% －118% with RSDs of 3． 8% －11% and 6． 4% －17% (n = 6)for anisatin in
plasma and urine，respectively． The limits of quantitation (S /N = 10)were 2 !g /L and 1 !g /L for plasma
and urine sample，respectively． The method is simple，selective and sensitive to the determination of anisatin
in biological sample for toxicological purposes．
Keywords Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;Anisatin;Plasma;Urine;
Biological sample
(Received 31 March 2011;accepted 28 June 2011)
0291 分 析 化 学 第 39 卷