全 文 ：中国农业大学学报 1 9 9 9, 4 ( 3 ) : 2 9一 3 4
J o u r n a l o f C h in a A g r i e li lt u r a l U n iv e r s it y
林生 山黛豆谷氨酸脱梭酶的性质及其比较研究①
穆小民② 杨晓贺 吴显荣 沈黎明
(中国农业大学生物学院 )
摘 要 林生山薰豆谷氨酸脱梭酶的亚基分子为量 70 k D , 天然分子量为 14 0 k D , 是 2 个相同亚基组成的二聚
体 。 N 一末端氨基酸为丙氨酸 。 圆二色谱分析表明 ,该酶在 20 7 . 5 n m 和 2 15 n m 有一平缓的负峰 ,二级结构中 a -
螺旋占 34 . 28 % ,尹一折叠占 3 . 24 % ,无规则卷曲占 32 . 28 % , 紫外吸收表现一般蛋白质的特征吸收光谱 ,在 27 8
n m 处有最大吸收 。 酶最适 p H S . 4 , 对谷氨酸的 K m 值为 1 . 62 x l 。 一 3 m ol · L 一 ’ , 最适温度 40 C , 酶特异性地使
谷氨酸脱梭 , 不能使门冬氨酸等其他氨基酸脱梭 。 比较结果说明该酶在已知结构和性质上与人及大鼠脑的谷
氨酸脱竣酶接近 ,但和已知的几种植物的酶相差较远 。
关键词 林生 山黛豆 ; 谷氨酸脱梭酶 ; 性质 ; 比较研究
分类号 Q 5 5 7 . 2
C o m P a r a t i v e S t u d y o n t h e P r o P e r t i e s o f G l u t a m i e A c i d
D e c a r b o x y l a s e f r o m F l a t P e a
M u X ia o m i n Y a n g X i a o h e W
u X i a n r o n g S h e n L im i n g
( C o l l e g e o f B i o l o g y
,
C A U )
A b s t r a e t G l u t a m ie a e id d e e a r b o x y l a s e ( G A D ) f r o m L a t勺 r u s 划 I v e s t r i s L . ( f l a t p e a ) w a s a
d im e r o f 1 4 0 k D b y s e p h a e r y l 5 2 0 0 g e l f il t r a t i o n a n d s u b u n i t s w e r e id e n t i e a l w i t h m o l e e u l a r
w e i g h t 7 0 k D b y SD S
一
P A G E
.
D e t e r m i n a t i o n o f N
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p o l y a m id e t h i n
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.
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T h e G A D f r o m
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一
g l u t a m a t e a n d e o u ld n o t d e e a r b o x y l a t e o t h e r a m i n o a e id s t e s t e d
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.
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F l a t p e a G A D w a s s im i l a r t o t h o s e f r o m h u m a n a n d r a t b r a i n b u t q u i t e d i f f e r e n t
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.
G A D f r o m f l a t p e a m i g h t b e i n a n e v o l u t i o n p o s i t io n
w h i e h 15 l e s s a d v a n e e d t h a n a n im a l G A D s b u t m o r e a d v a n e e d t h a n o t h e r P l a n t G A D s
.
K e y w o r d s f l a t p e a ( L a t hy
r u s 划I v e s t r i s L . ) ; g l u t a m i e a e id d e e a r b o x y l a s e ; p r o p e r t y ;
C o n 1 P a r l s o l
收稿 日期 : 1 9 9 7一 0 4一 0 7
①国家自然科学基金资助项目 3 9 2 7 0 7 1 1
②穆小民 , 中科院动物研究所计划 生育生殖生物学 国家重点实验室 ,北京 1 0 0 0 91
3 0中 国 农 业 大 学 学 报 1 9 9 9年
谷氨酸脱梭酶 (g l u tm i e a e id d e e a rb o x yl a e s, G A D )广泛分布于生物体内 ,催化谷氨酸脱竣
生成 y 一氨基丁酸 。 7一氨基丁酸是脊椎动物中枢神经系统内的一种极其重要的神经递质 。 在高
等植物 , 了一氨基丁酸可能参与植物的逆境胁迫反应 lj[ , G A D 的活力与植物种子的活力 、 出苗率
和田间长势密切相关川 。 目前 , 国内外对人 和动物的 G A D 已有大量研究 , 对其性质有了较为
详细的了解川 , 而对于高等植物的 G A D 研究却很少 。 目前只知道胡萝 卜、 大麦和 向日葵等少
数几种植物 G A D 的部分酶学性质比 5〕 , 只有马铃薯的 G A D 得到纯化困 。 我们从美国引种 了林
生山黛豆 ( L at 勿ur : sy l ve st ir : L . f lat eP a ) 。 数年的栽培试验表明其耐干旱 , 耐贫瘩 ,适 于在我
国北方推广川 。 我们在其体内检测到了很高的 G A D 活性川 ,这种高活性与林生山薰豆的抗逆
能力可能有一定关系 。关于林生 山薰豆 G A D 纯化 已另文报道川 。本文报道了林生山薰豆 G A D
的性质及与其他来源的 G A D 性质的研究结果 。
1 材料与方法
材料 林生山黛豆叶片采 自中国农业大学科学园内引种栽培的 2 年龄林生山薰豆 。 L K B
B r o m m a 连续紫外监测仪 、 蠕动泵 、 部分收集器和冰柜 、 P h a r m a e i a 5 0 0 F P L C 系统 、 S h im a d z u
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一
24 0 分光 光度计 、 JA S C O J s o o 圆二 色谱仪 、 日立 8 3 5一 5。 氨基 酸 自动分 析仪 。 试剂 有
D E A E
一
S e p h a r o s e F F 和 S e p h a e r y l 5 3 0 0 凝胶 、 M o n o Q 预装柱 ( P h a r m a e ia 产 品 ) 、 丙烯酞胺 、
甲叉双丙烯酞胺 、 S D S 、 T E M E D 、 丹磺酞氯 、 磷酸毗哆醛和谷氨酸 (S i g m a 产品 ) , 其他试剂为国
产分析纯 。
分子量测定 以 S D S 一 P A G E[ 10] 测 定 G A D 的亚 基分子量 , 分离胶 浓度 10 % , 银染色 。
S e p h a e r y l 5 2 0 0 凝胶过滤法 ,应用有效分配系数 ( K a v ) , 测定 G A D 的天然分子量 L` 。 〕 。
N
一末端测定 以丹磺酞氯法聚酞胺薄膜层析技术 仁“ 〕测定 G A D 的 N 一末端 。 将 3 50 衅 J 纯
化的 G A D 溶液 ( 。 . 5 m g’ m L 一 ` )加人等量浓盐酸后 1 50 ` C水解 4 h , 加人 7 0 爪“ 重蒸水稀释 ,
取 60 0 拼L 上氨基酸 自动分析仪分析氨基酸组成 。
光谱学分析 将纯化的 G A D 溶液 [ 0 . 1 胖g’ m I J 溶于 T ir s 一 H CI ( p H 7 . o ) ]在圆二色谱仪上
测定 2 0 0一 3 0 0 n m 的紫外吸收 e D 谱 ,样品池光径 1 m m ,容量 5 0 0 拜L , 根据 e h e n 等仁旧方法 ,
从圆二色谱图上计算酶分子 中 a 一螺旋 、 月一折叠和无规则卷曲所 占的百分比 , 在紫外分光光度计
上扫描 , 以相同缓冲液做空 白对照 , 测定波长范围 20 0一 35 0 n m 。
酶活力测定 G A D 酶活力测定 以谷氨酸为底物 , 加人磷酸毗哆醛 ( P L P ) 为辅助 因子 , 用
氨 酸 自动分析仪或丹磺酞氯法 聚酞胺 薄膜层析技术 . ` 〕分析产物 7一氨基丁酸 的含 量 。 标准
G A P 酶活力测 定体 系体积 为 1 m L , 包括 下列成 分 : 5 0 m m o l · L 一 ` N a ZH P O 4 / N a H ZP O 4 ( p H
5
.
8 )
,
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·
L 一 ` G l u
,
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.
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·
L 一 ` P L P , 2 m m o l
·
L 一 `二硫苏糖醇 ( D T T ) , 2 拼g · m L 一 `酶
蛋 白 , 反应温度 37 ℃ ,反应时间 30 m in 。 酶的其他性质测定均按文献「1 3 ]方法进行 。
2 结果
2
.
1 分子 t
根据 图 1 S D S 一 P A G E 的结 果 , 以分子量对数对 电泳相对迁移 率作图 , 测得林生 山薰豆
G A D 的亚基分子量为 70 k D 。 经 S e p h a cr y l 5 20 0凝胶过滤 ,通过有效分配系数 ,计算出其分子
量为 14 0 k D (图 2 ) 。 表明该酶是 由 2 个相 同亚基构成 的二聚体蛋 白 , 分子量和人及大鼠脑
G A D 的分子量接近 , 而与其他来源 G A D 的相差较远 。

中 国 农 业 大 学 学 报 1 9 9 9年
2
.
4光谱学性质
从林生山黛豆 G A D的远紫外区圆二色谱 (图 3)可知林生山薰豆的 G A D在 20 7 . 5 n m和
2 15 n m有一个平缓的负峰 , 呈现 出球蛋 白的特征 。 根据 C h en 一 Y a gn l[ 2〕的方法 , 经微机计算 , 林
生山薰豆 G A D 二级结构中 a 一螺旋 占 34 . 48 % , 口一折叠占 3 . 24 % , 无规则卷 曲占 32 , 28 % 。 我
们未见到其他来源的 G A D 的圆二色谱分析图谱 , 故无法 比较 。
将纯化 的林生山黛豆 G A D 溶液于 2 0 一 3 50 n m 范围内进行紫外扫描 。 结果表明 ,林生山
薰豆的 G A D 具有典型的蛋 白质紫外吸收光谱 ,在 2 80 n m 处有明显吸收 , 其最大吸收波长为
2 7 8 n m
o
2
.
5 最适 p H 值和最适温度
在材料与方法中叙述 的标准反应条件下 ,在 p H 3 ~ 8 范围内 , 改变反应体系的 p H 值 , 以
氨基 酸 自动分析仪分析产物 y 一氨基丁酸的生成量 , 结果测得最适 p H 值为 5 . 4 , 稍低于其他
已知的几种植物和动物的酶的最适 p H 值 (表 2 ) 。
表 2 不同来源谷氨酸脱数酶 的性质比较
分子量 k D材料来源 最适 p H 最适 p H 值 参考文献天然 亚基
N
一末端
氨基酸
对谷氨酸
的 K m 值
叫困圈川4j[一3073 . 8
4
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.
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人脑
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大鼠脑
大麦胚
大麦根
向 日葵子叶
马铃薯块薯
林生山熬豆
9 1 4 3
1 4 0 7 0 A la 5
.
4
P
r e s e n t
w
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在前述标准反应条件下 ,改变反应温度 ,用丹磺酞氯法和聚酞胺薄膜层析技术测定相对活
力 ,求得在本实验条件下 ,该酶反应 的最适温度为 40 ℃ , 比报道的其他植物 G A D 的最适温度
稍高 (表 2 ) 。
2
.
6 热稳定性
取一定量酶液 , 在不同反应温度下分别保温一定时间 , 到时迅速冷却 , 然后再调至 37 ℃ 。
按标准方法进行酶活力测定反应 。 结果表明 ,林生 山薰豆的 G A D 50 ℃保存 l h ,酶活力明显下
降 , 60 ℃保存 l h , 酶活力完全丧失 ,和大麦 G A D 的热稳定性相近川 。
2
,
7 酶的 K m 值
改变底物浓度 , 按酶活力测定标准方法进行酶促反应 , 用氨基酸 自动分析仪分析产物 y -
氨基丁酸 的生成量 , 将测定结果按 iL en w ea ve r 一 B ur k 作图法 , 求得该酶作用于谷氨酸的 K m 值
为 1 . 62 x 10 一 ’ m ol · L 一 ` (图 4 ) 。 该数值比已知大麦 、 向 日葵 和马铃薯等植物 G A D 的 K m 值
(表 1) 低 , 和人及鼠脑 G A D 的 K m 值接近 。
第 多期 穆小 民等 :林生山薰豆谷氨 酸脱梭酶的性质及其 比较研究
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图 3林 生山黛豆谷氨酸脱梭酶的
圆二色谱 图
一 0 . 5
图 4
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〔 S〕 , /m m o l · I厂 1
谷氨酸浓度对反应速度的
L i n e w e a v e r
一
B u r k 双倒数图
2
.
8 底物特异性和抑制剂对酶活力的影响
林生山薰豆 G A D 特异性地催化谷氨酸的聪竣 ,在本实验 的检测水平上 ,没有发现能催化
天门冬氨酸等 , 撷氨酸 , 谷氨酞胺和 2 , 4 一二氨基丁酸的脱梭 。 加人抑制剂进行标准反应 ,用丹
磺 酞氯法 和聚酞胺 薄膜层析法检测产物 7 一氨基丁酸 ,结果氨基脉 (2 m m ol · L 一 ’ ) 、 经胺 (0 . 12
m m ol
·
L 一 ` ) 和氰化物 ( 0 . 4 m m ol · L 一 ` )产生 80 % ~ 1 0 %的酶活性抑制 ,与文献报道的其他来源
的 G A D 一致 。 碘代乙酞胺 (3 m m ol · L 一 ` ) ,二氨基丁酸 ( 12 m m ol · L 一 ` ) , 天门冬氨酸 (8 m m ol ·
L 一 ` )
, 琉基 乙醇 [。 . 2% (体积分数 )] 对林生山薰豆 G A D 的活性没有影响 。
3 讨论
从表 3 可看出林生山薰豆 G A D 的分子量和马铃薯 G A D 的分子量困差别较大 ,和大麦胚
和根的 G A D 的分子量川差别也很大 ,而和人脑及大 鼠脑的分子量基本相 同 。
从氨基酸组成分析来看 ,林生山薰豆 G A D 的氨基酸组成 中大多数氨基酸 的含量和人脑
及大鼠脑的 G A D 的很接近 (表 1 ) 。 林生山薰豆 G A D 的 N 一末端氨基酸残基为丙氨酸 ,与人脑
和大鼠脑的一致川 。 从酶的动力学性质来看 ,林生 山黛豆 G A D 的 K m 值比 已知的马铃薯 、 大
麦和 向日葵的 G A D 的 K m 值低 , 而与人脑和大 鼠脑 G A D 的 K m 值 (表 3) 相近 。
以上分析表明 , 林生山薰豆的 G A D 在一些结构和性质上和人脑及大 鼠脑 的 G A D 近 。 而
与已 知的植物 G A D 差别较大 , 从文献报道看 , G A D 的进化属于歧异进化 。 各种不同来源的
G A D 最早是属于同一种酶 ,通过不 同方向的进化 ,其结构和性质逐渐发生了改变 , 形成动物 、
植物和微生物等不同来源的 G A D 结构及性质上 的差异 3[, 6 , ` 5」。 哺乳动物在进化上处于较高的
层次 ,其体 内的 G A D 是重要 的抑制性神经递质 7 一氨基丁酸的合成酶 , 具有重要的生理作用 。
所 以人脑和大 鼠脑的 G A D 的进化程度应该是非常高的 。 林生山薰豆 G A D 的结构和性质和人
及 鼠脑的谷氨酸脱竣酶相近 ,说 明林生 山薰豆的 G A D 在长期的 自然选择 中 , 得到了较高程度
的进化 。
林生 山黛豆 G A D 的最适 p H 值 为 5 . 4 , 稍低于已知的其他植 物的 G A D 的最适 p H 值 ,
而且林生山薰豆 G A D 的 K m 值明显地低于已知的其他植物 G A D 的 K m 值 ,其最适温度高于
已知的其他植物 G A D 的最适温度 。 这就意味着林生山薰豆的 G A D 和其他植物的 G A D 相比 ,
在较低的 p H 值条件下 , 较低的底物浓度条件下 , 和较高的温度条件下 , 仍能发挥很强的作
3 4中 国 农 业 大 学 学 报 1 9 9 9年
用 。
关于从植物来源的其他谷氨酸脱梭酶的氨基酸组成 、 N一末端测定 、 圆二色谱等光谱学分
析方面还未见报道 。 所以我们测定的林生 山薰豆谷氨酸脱梭酶的这些性质无法和其他植物的
比较 。 预计今后这方面会有更多的研究 。
参 考 文 献
1穆小 民 , 吴显荣 . 高等植物 的 y 一氨基 丁酸及其代谢的酶学研究 . 生命的化学 , 1 9 95 , 15 (5 ) : 21 一 24
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