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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):199-204
γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），一
种非蛋白质氨基酸，以自由态形式广泛存在于自然
界中，是哺乳动物中枢神经系统的抑制性传递物
质［1］。GABA 具有多种生理功能，如镇静神经［2］、
降血氨［3］、健肝利肾［4］及治疗癫痫［5］等。此外，
研究表明 GABA 可以作为工业上合成 N-甲基吡咯烷
酮［6］、生物塑料及尼龙［7，8］等含氮化学制品的环保
型前体物质。因此 GABA 正被广泛应用于医药、食
收稿日期： 2015-09-17
基金项目：国家杰出青年基金项目（31425020），111 计划（111-2-06）
作者简介：黄燕，女，硕士研究生，研究方向：重组酶的制备和应用；E-mail ：18206180508@163.com
通讯作者：吴敬，女，博士生导师，研究方向：食品与发酵；E-mail ：jingwu@jiangnan.edu.cn
重组谷氨酸脱羧酶制备 γ-氨基丁酸的工艺条件优化
黄燕  宿玲恰  吴敬
（江南大学  食品科学与技术国家重点实验室  生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，无锡  214122）
摘 要： 谷氨酸脱羧酶，一种磷酸吡哆醛（PLP）依赖性酶，能专一、不可逆地催化 L-谷氨酸脱羧得到 γ-氨基丁酸（GABA）。
构建了产 Lactobacillus brevis WJH3 谷氨酸脱羧酶重组大肠杆菌 E.coli BL21（DE3）/pET-24a-gad，以此作为菌种进行摇瓶发酵诱导
培养，发酵过程中一次性添加 0.05 mmol/L PLP 培养 24 h，破壁上清酶活达 81.7 U/mL，是不添加 PLP 对照酶活的 1.8 倍。对酶转化
L-谷氨酸钠生成 GABA 反应条件进行了优化，结果表明，在转化体系不添加 PLP 的情况下，底物谷氨酸钠浓度为 250 g/L，反应初
始 pH5.0，温度 37℃，加酶量 60 U/g 底物，转速 200 r/min，在此条件下反应 18 h，GABA 转化率达到 100%，为 γ-氨基丁酸的工业
化生产奠定基础。
关键词 ： 谷氨酸脱羧酶 ；酶转化 ；磷酸吡哆醛 ；谷氨酸钠 ；γ-氨基丁酸
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.029
Optimization of γ-aminobutyric Preparation by Recombinant
Glutamate Decarboxylase
HUANG Yan  SU Ling-qia  WU Jing
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Biotechnology and Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of
Education，Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract:  Glutamate decarboxylase（GAD），a pyridoxal 5-phosphate（PLP）-dependent enzyme，irreversibly catalyzes  the 
decarboxylation of L-glutamate to be the valuable food additive γ-aminobutyric acid（GABA）. In this study，a recombinant Escherichia coli 
BL21（DE3）/pET-24a-gad producing Lactobacillus brevis WJH3 GAD was constructed as strain in  the flask culturing of  fermentation and 
induction. The activity of GAD produced in the supernatant of culturing for 24 h medium supplemented one-time with 0.05 mmol/L PLP was 81.7 
U/mL，and this was 1.8-fold of that without PLP supplementation. Furthermore，the condition for GABA preparation by enzymatic conversion 
was optimized ；under the condition of 250 g/L monosodium glutamate（MSG），pH5.0，37℃，60 U GAD per gram substrate incubated for 18 
hours，and rotation rate 200 r/min，100% of the MSG was transformed into GABA. These results establish the utility of PLP supplementation 
and lay the foundation for large-scale enzymatic production of GABA.
Key words:  glutamate decarboxylase ；enzymatic conversion ；pyridoxal 5-phosphate ；monosodium glutamate ；γ-aminobutyric
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6200
品保健、化工及农业等行业。
GABA 天然存在量很低，很难从天然组织中大
量分离，阻碍了它的工业生产。目前，GABA 的制
备方法有化学合成法、植物富集法和微生物合成法。
相比而言，化学合成 GABA 安全性差、环境污染严
重，植物富集 GABA 含量较低，而微生物合成生产
法因具有条件温和、成本低，能耗低，产量高等优
点而成为主要的生产方法。微生物合成法的原理是
采用谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD；
EC4.1.1.15）专一、不可逆地催化 L-谷氨酸裂解为
GABA和 CO2。
Li 等［9］采用 Lactobacillus brevis NCL912 野生菌
发酵 48 h 时，发酵液中 GABA 浓度达到 102.78± 
5.30 g/L，无谷氨酸钠残留。根据 Plokhov 等［10］报道，
在大肠杆菌基因来源的 Escher-ichia coli BL21（DE3）
重组菌发酵过程中添加 0.02 mmol/L 的 PLP，能使
GAD 产量提高 2 倍，同时又有文献报道短乳杆菌
GAD与辅酶 PLP 紧密结合，经破壁、蛋白纯化等步
骤均不会丢失［11，12］，因此我们猜想如果在发酵过
程中添加一定量的 PLP，所得到的短乳杆菌的粗酶
液应该可以用于在不添加辅酶的条件下生产 GABA，
以达到节约成本的目的。为探索出一种重组谷氨酸
脱羧酶无需辅酶 PLP 转化合成 GABA 的生产工艺，
本研究从实验室现有菌株短乳杆菌（Lactobacillus
brevis WJH3）［13］PCR 获得 GAD 基因并连接到表达
载体 pET-24a（+），进行重组表达，并在此基础上，
对酶转化过程中不添加辅酶 PLP 的酶转化工艺进行
优化，以期获得高效生产 GABA的方法。
1 材料与方法
1.1  材料
1.1.1  菌株和质粒  短乳杆菌（Lactobacillus brevis 
WJH3）：实验室筛选获得，保藏编号为 CCTCC 
M2014150 ；E.coli JM109、E.coli BL21（DE3）：本实 
验室保藏；克隆载体 pMD18-T Simple vector ：购
自 TaKaRa 公 司；表 达 载 体 pET-24a（+）：购 自
Novagen 公司。
1.1.2  培养基  MRS，LB，TB，SOB，SOC 培养基：
细菌常规通用培养基；重组大肠杆菌培养基中添加
终浓度为 30 μg/mL 的卡那霉素。
1.1.3  主要试剂和仪器  基因组试剂盒、胶回收试
剂盒、质粒抽提试剂盒和 PCR 产物纯化试剂盒均
购自天根生化科技有限公司；限制性内切酶、T4 
DNA 连接酶、PrimeSTAR®HS DNA 聚合酶、蛋白质
相对分子质量标准、核酸分子量标准及琼脂糖购自
TaKaRa 公司；氨苄那霉素、卡那霉素、异丙基 -β-D-
硫代半乳糖苷（IPTG）购自于生工生物工程（上海）
有限公司；γ-氨基丁酸、邻苯二甲醛购自 Sigma 公司；
蛋白胨、酵母粉购自英国 Oxoid 公司；其他所用试
剂购自于中国国药集团。
主要仪器：PCR 仪、UVP 凝胶成像系统、蛋
白电泳仪购自美国 Bio-Rad 公司；DYY-6C 型核酸
电泳仪购自北京六一仪器厂；高效液相色谱仪购自
Agilent 公司；细胞破碎仪购自北京科实兴业科技有
限公司；紫外可见光分光光度计购自日本 Shimadzu
公司。
1.2  方法
1.2.1  工程菌的构建  提取 Lactobacillus brevis WJH3
的基因组 DNA，并以此为模板 PCR 扩增目的基因
gad。PCR反应条件为：94℃ 4 min；94℃ 45 s，60℃ 
45 s，72℃ 130 s，循环 30 次，72℃ 10 min。PCR 引 
物如下：P1（5-3）：CGCCATATGGCTATGTTGTA-
TGGAAA（正向引物）；P2（5-3）：CCC0AAGCTT-
AGTGCGTGAACCCGTATTT（反向引物）。P1、P2 分
别含 Nde Ⅰ和 Hind Ⅲ的限制性酶切位点。将 PCR 
产物经胶回收试剂盒回收纯化后连接至克隆载体
pMD18-T，连接产物经热激法转入 E.coli JM109 感受
态细胞，在含 100 μg/mL 氨苄青霉素（Amp）平板上
培养过夜，挑取单克隆在含 100 μg/mL Amp 液体 LB
培养基中培养 8-10 h，抽提质粒得到 pMD18-T-gad，
并采用酶切电泳和测序鉴定。序列测定由上海生工
生物工程有限公司完成。
将 pMD18-T-gad 经 Nde Ⅰ和 Hind Ⅲ双酶切后回
收目的片段，再与同样处理酶切处理的表达达载体
pET-24a（+）用 T4 连接酶连接，连接产物转入 E.coli
JM109 感受态细胞中，在含 30 μg/mL 卡那霉素（Kan）
平板培养过夜，挑取单克隆在含 30 μg/mL Kan 液体
LB 中 37℃培养 8-10 h，提取得到重组质粒 pET-24a
（+）-gad。将重组质粒双酶切验证，验证正确后转
2016,32(6) 201黄燕等：重组谷氨酸脱羧酶制备 γ- 氨基丁酸的工艺条件优化
入 E.coli BL21（DE3）中，37℃培养过夜，保存甘油管。
1.2.2  摇瓶发酵生产 GAD  将 -80℃保藏的重组菌
Ecoli BL21/pET-24a（+）-gad 从甘油管中接入种子培
养基，初始 pH7.0-7.2，回转恒温摇床 37℃、200 r/min
培养 8 h 后，按 5% 的接种量接种至 TB 中，37℃
培养 2 h 后加入一定量浓度的 IPTG 和 0.05 mmol/L 
PLP，降温至 25℃进行重组蛋白的诱导表达，诱导
24 h 后，每隔 3 h 取样、离心收集菌体。当 OD600 低
于 5.0 时直接用 50 mmol/L pH 5.5 Na2HPO4- 柠檬酸缓
冲液悬浮菌体，当菌体生长至 OD600 大于 5.0 时，采
用缓冲液稀释至 5.0，超声破碎后离心，破壁上清即
为 GAD粗酶液，单位体积酶活根据相应体积发酵液
菌体稀释倍数折算得出。
1.2.3  GAD 活 性 测 定  取 40 μL GAD 粗 酶 液 加
入 360 μL 底物（底物体系：采用 50 mmol/L pH4.8 
Na2HPO4- 柠檬酸缓冲液溶解 0.15 mmol/L PLP 和 0.1 
mol/L 谷氨酸），于 37℃恒温水浴反应 4 min，然后
用 600 μL 0.2 mol/L pH10 硼酸缓冲液终止反应。采
用 HPLC-OPA 柱前衍生法测量 GABA 生成量。酶活
单位定义为在酶活测量体系下，在 1 min 内能转化
生成 1 μmol GABA 的酶量。
1.2.4  GABA的制备及含量测定  用pH5.0 Na2HPO4-
柠檬酸缓冲液配制浓度为 250 g/L 的谷氨酸钠溶液，
与一定量的粗酶液（上述 1.2.2 添加辅酶 PLP 发酵
所得菌体经浓缩高压匀浆破壁所得）充分混匀后
在 37℃、200 r/min 水浴摇床中控制反应 pH 5.0，反
应 4 h 后，每隔 2 h 补加 50 g/L 谷氨酸钠固体至相
应底物浓度反应 18 h，酶转化过程中反应体系未添
加 PLP，转化后的反应液加入等体积的三氯乙酸后，
静置 2 h，12 000 r/min 离心 10 min，取上清进行分析。
产物采用HPLC-OPA 柱前衍生法进行检测。
转化率定义为：生成的 GABA的摩尔数 /L-谷氨
酸的摩尔数 *100%。
1.2.5  HPLC-OPA 柱 前 衍 生 法 测 量 GABA  利
用 HPLC-OPA 柱前衍生法进行氨基酸分析的色
谱 条 件 是：Agilent 1200 HPLC 色 谱 仪（Agilent 
Technologies，Palo Alto，CA，USA），Agilent 自 动
进 样 器，XDB-C18（4.6 mm × 150 mm） 色 谱 柱，
Agilent 紫外检测器（338 nm）；流动相 A ：醋酸钠 
4.52 g/L，200 μL/L 三乙胺，5 mL/L 四氢呋喃，醋酸
调节 pH7.2。流动相 B：醋酸钠 22.6 g/L / 乙腈 / 甲
醇 = 1∶2∶2（体积比）。二元梯度洗脱；流速 0.8 
mL/min ；柱温 40℃［14］。
2 结果
2.1  GAD重组菌的构建
2.1.1  重组质粒 pET-24a（+）-gad 的构建  以提取
的 Lactobacillus brevis WJH3 基因组为模板，PCR 扩
增得到目的基因 gad，其长度大小经凝胶电泳验证
为 1.4 kb。将 gad 基因片段插入 pMD18-T simple 质
粒中，测序后发现 gad 基因所编码的氨基酸序列与
Lactobacillus brevis NCL912 同源性 99%。纯化回收目
的基因后与同样酶切、纯化回收的 pET-24a（+）连
接，连接后转入 E.coli JM109，培养重组菌并抽提
质粒进行双酶切验证，如图 1 所示，分别在 5 300 
bp 和 1 400 bp 附近有明显的条带，条带大小与预
期相符，表明重组表达载体 pET-24a（+）-gad 构建 
成功。 
bp
10000
5000
4000
2000
1000
750 500
250
100
gad
pET-24a+M1 M2 1
M1 ：2000 bp DNA Ladder Marker ；M2 ：10000 bp DNA Ladder marker ；1 ：质
粒双酶切后的条带
图 1 重组质粒 pET-24a（+）-gad 酶切验证
2.1.2  重组菌 E.coli BL21（DE3）/ pET-24a（+）-gad
的构建及培养  将重组质粒 pET-24a（+）-gad 转化
E.coli BL21（DE3）感受态细胞，经 0.2 mmol/L IPTG
诱导并同时添加 0.05 mmol/L PLP 发酵培养 24 h 后
离心收集菌体，超声破碎后离心得到 GAD 粗酶液。
结果如图 2所示，随着时间的推移，重组 GAD酶活
不断增加，诱导 15 h 胞内酶活达到 81.7 U/mL，是
不添加 PLP 对照酶活的 1.8 倍。SDS-PAGE 分析结
果见图3，从图 3可见在 54 kD处出现一条蛋白条带，
与理论 GAD 分子量相符，表明 GAD 在 E.coli BL21
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6202
（DE3）中成功表达。
2.2  重组GAD制备GABA工艺优化
2.2.1  反应 pH 对 GABA 合成的影响  以 250 g/L
的谷氨酸钠作为底物，加酶量 80 U/g 底物，温度
37℃，转速 200 r/min，分别控制在 pH 3.5、4.0、4.5、
5.0、5.5 和 6.0 转化环境中反应 18 h。产物用HPLC-
OPA衍生法进行检测。结果如图 4所示，当 pH为 5.0
时，GABA 转化率为 100%。与文献报道短乳杆菌
的 GAD 最适转化 pH 范围 4.8 接近［13］。当 pH 低于
5.0 时，谷氨酸钠容易以谷氨酸形式析出形成白色乳
浊液，不利于酶催化反应；当 pH大于 5.0 时不利于
酶活性中心的赖氨酸残基以 shifft-碱与辅酶（PLP）、
底物结合，从而不利于 GABA 的合成［15］。因此过酸
或过碱对酶促反应都不利，在 pH为 5.0 时 GABA 转
化率最高。
2.2.2  反应温度对酶转化的影响  以 250 g/L 的谷氨
酸钠作为底物，加酶量 80 U/g 底物，pH5.0，转速
200 r/min，分别在 30℃、37℃、40℃、50℃和 60℃
反应 18 h。产物用 HPLC-OPA 衍生法进行检测。如
图 5 所示，反应温度 37-40℃时，GABA 转化率达
到 100%，与其他大部分来源 GAD 的最适酶转化温
度一致［13，16，17］。随着温度的升高或下降，GABA转
化率下降。60℃条件下，GABA 转化率只有 12.4%，
这可能是在高温下酶与辅酶的不稳定，从而影响
GABA 的产率。为了与其他文献对比，我们采用
37℃为最佳转化温度。
100
80
60
40
20
0
0 3 6
䞦⍫/U·mL-1 
9 12 15䈡ሬᰦ䰤h 18 21 24 27
␫࣐PLPਁ䞥ሩ➗
图 2 重组菌在摇瓶发酵中的产酶曲线
kD
97.2
66.4
44
31
20
GAD
M 1
M：标准分子量蛋白；1：GAD破壁上清
图 3 谷氨酸脱羧酶 SDS-PAGE 分析
100
80
60
40
20
0
3.5 4.5 5.5 6.05.04.0
pH
䖜ॆ⦷%
图 4 反应 pH 对酶转化的影响
100
80
60
40
20
0
30 37 605040⑙ᓖć䖜ॆ
⦷%
图 5 反应温度对酶转化的影响
2.2.3  加酶量对酶转化的影响  以 250 g/L 的谷氨酸
钠作为底物，加入不同量的 GAD，加酶量分别为每
克底物 20、40、60、80、100 U/g，pH 5.0，反应温
度 37℃，转速 200 r/min 反应 18 h。产物用 HPLC-
OPA 衍生法进行检测。如图 6 所示，随着加酶量的
增多，GABA 转化率逐渐增大，在 60 U/g 时转化率
达到 100%，之后加酶量增加，转化率不变，转化时
间缩短。考虑到经济性因素，选择加酶量为 60 U/g。
2.2.4  底物浓度对 GABA酶转化的影响  通过温度、
pH 等优化结果显示，当底物浓度为 250 g/L 时转化
2016,32(6) 203黄燕等：重组谷氨酸脱羧酶制备 γ- 氨基丁酸的工艺条件优化
率已达到 100%，为继续提高反应强度，尝试提高初
始谷氨酸钠浓度，经过实验发现，当底物浓度大于
250 g/L 时谷氨酸钠将以谷氨酸形式析出形成白色乳
浊液，不利于反应进行，且对酶及辅酶稳定性产生
影响。为进一步提高反应强度，我们尝试分批补料
添加一定量的谷氨酸钠固体以提高底物浓度。
初始谷氨酸钠浓度为 250 g/L，加酶量 60 U/g，
控制 pH 5.0，温度 37℃，置于 200 r/min 的恒温水
浴摇床中反应 4 h 后，每隔 2 h 补加 50 g/L 的谷氨
酸钠固体至相应底物浓度（400 或 500 g/L），反应
18 h 后终止反应，产物采用 HPLC-OPA 柱前衍生法
进行检测。如图 7 所示，谷氨酸浓度为 250 g/L 时，
GABA转化率达到100%。随着谷氨酸钠浓度的增加，
GABA 转化率逐渐降低，当谷氨酸钠浓度为 400 g/L
时，GABA转化率为88.4%，GABA产量达到247.8 g/L。
继续增加谷氨酸浓度到 500 g/L 时，GABA 转化率下
降为 74.3%，GABA 产量达到 255.7 g/L。补料添加
GABA 产率比一次性添加的 175.2 g/L 有所提高，但
综合考虑产品中 GABA 的比例和产率，本着节省资
源，降低工业成本的原则，选择 250 g/L 浓度。
3 讨论
目前国内外关于生产 GABA 的报道集中于
从传统食物中筛选产量较高的野生菌进行发酵
生产 GABA。Binh 等［18］从泡菜中筛选得到一株
Lactobacillus brevis，优化培养条件后，GABA 终浓度
达到 4.2 g/L，转化了达到 99.7%。Shi 等［19］从采用
Lactobacillus brevis CGMCC No.3414 菌株发酵结束后
添加 50 g/L 谷氨酸，反应 4 h 后转化率达到 93.15%。
夏江等［20］筛选了一株 Lactobacillus brevis CGMCC 
NO.1306，其 GABA 的最大产量已达到 76.4 g/L。Li
等［21］从泡茶中分离得到一株 Lactobacillus brevis 
NCL912，对发酵条件进行优化后，GABA 产量高达
103.6 g/L，发酵液中无谷氨酸残留。但是野生菌谷
氨酸脱羧酶的表达量很低，无法满足生产需要。另外，
由于发酵液是一个复杂的多相体系，除了目的产物
GABA，还含有蛋白质、残糖及无机盐等杂质，使得
GABA 分离纯化步骤变得十分复杂，因此，利用分
子生物学技术高效表达 GAD并优化酶制备工艺得到
该领域学者、专家的关注。但是，目前报道中的短
乳杆菌 GAD产量都比较低，最高仅有 12.7 U/mL［22］，
且关于采用短乳杆菌 GAD 酶法合成工艺的报也很
少。因此，本实验在 E.coli BL21（DE3）中成功表达
了来源于 Lactobacillus brevis WJH3 的 GAD，且在发
酵过程中一次性添加 0.05 mmol/L PLP 培养 24 h，破
壁上清酶活达 81.7 U/mL，是不添加 PLP 对照酶活的
1.8 倍。我们还分别考察了该重组酶制备 GABA的应
用，考察了 pH、温度、加酶量、底物浓度等对酶转
化的影响，在最优条件下能将 250 g/L 的 L-谷氨酸钠
完全转化成 GABA。下一步的研究重点是将该重组
菌在3 L发酵罐中进行优化，获得更高表达量的酶液，
为工业化奠定基础。
4 结论
本研究成功构建了表达 GAD的重组 E.coli BL21
（DE3）菌株，初步实验表明在发酵过程中添加 0.05 
mmol/L 的辅酶 PLP 重组菌破壁上清液中 GAD 酶活
可达 81.7 U/mL，较空白提高 1.8 倍。采用该重组
GAD粗酶液优化了酶法生产 GABA 的工艺条件。结
果表明，底物谷氨酸钠浓度为 250 g/L，反应 pH 5.0，
温度 37℃，加酶量 60 U/g 底物，转速 200 r/min，转
100
80
60
40
20
0
20 60 80 10040 ࣐䞦䟿U·g-1䖜ॆ⦷
%
图 6 加酶量对酶转化的影响
100
80
60
40
20
0
400 500250 ᓅ⢙⎃ᓖg·L-1䖜ॆ⦷
%
图 7 分批补料浓度对酶转化的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6204
化时间 18 h，GABA 转化率可达 100%；采用 GAD
粗酶液不添加辅酶PLP合成GABA的方法操作简单、
节约成本、利于提取。
参 考 文 献
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（责任编辑  李楠）