全 文 ：文章编号:0253-2468(2003)05-0689-05　　　中图分类号:X503.23　　　文献标识码:A
外源亚精胺缓解荇菜(Nymphoides peltatum)
Cr
6+毒害的生理研究
王　学 ,施国新 ,徐勤松 ,马广岳 ,拉非克 ,张小兰 ,周红卫　(南京师范大学生命
科学学院 ,南京　210097)
摘要:研究了不同浓度的Cr6+胁迫下 ,荇菜叶中叶绿素含量 、可溶性蛋白含量 、O 2 产生速率 、保护酶———超氧化物歧化酶
(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性的动态变化及外施亚精胺后对上述各指标的影响.结果表明:(1)单一
Cr6+处理下 ,叶绿素和可溶性蛋白含量在 Cr6+浓度为 1 mg L时达到最大值 , 而后迅速下降;外施亚精胺(Spd)可显著提高二
者的含量 ,延缓它们的下降速度.(2)单一 Cr6+处理下 ,SOD、POD、CAT 活性分别在 2、4 、2mg L Cr6+处理下达到最大值 ,而后
下降;外施亚精胺可提高这三种保护酶的活性 ,使其上升或稳定时期变长 ,从而降低 O 2 等活性氧的产生速率.由此可见外
源亚精胺可缓解 Cr6+对荇菜的胁迫效应.
关键词:荇菜;Cr6+;亚精胺;缓解
Toxic effects of Cr6+ on Nymphoides peltatum mitigated by exogenous
spermidine
WANG Xue , SHI Guoxin , XU Qinsong , MA Guangyue , Rafeek Khaled , ZHANG Xiaolan , ZHOU Hongwei 　
(College of Life Science , Nanjing Normal University , Nanjing 　210097)
Abstract:Changesof chlorophyll content , soluble protein content , O 2 generating rate and activity of protective enzymes(SOD , CAT , POD)in
leaves of Nymphoides peltatum(Gmel)O.Kuntze under different concentration gradient of Cr6+ stress or exogenous spermidine treatment were
studied.The results showed that:(1)under single 1mg L Cr6+ stress , chlorophyll and soluble protein contents of the Nymphoides peltatum
reached maxima , then decreased quickly;the contents of them were much higher in additionally spraying spermidine(Spd)than those in the
only single Cr6+ treatment.(2)under single Cr6+ stress, the maxima of SOD , CAT andPOD appeared at 2 , 4 and 2mg L Cr6+ respectively ,
and decreased afterward;the activities of these protective enzymes were markedly higher in spermidine treatment than those of control while the
increasing and steady periods lasted longer , thereby it decreased the generation rate of active oxygen species(for example , O 2 ).So it was
concluded that spermidine could alleviate the toxic effects caused by Cr6+ stress.
Keywords:Nymphoides peltatum(Gmel)O.Kuntze;Cr6+;Spermidine;mitigate
收稿日期:2002-09-10;修订日期:2002-10-30
基金项目:国家自然科学基金(39770046);教育部科学技术研究重点项目(01043);江苏省教育厅自然科学基金资助项目
作者简介:王　学(1974—),女 ,硕士研究生
随着工业“三废”的大量排放以及矿产开发的泛滥 ,水体重金属污染日益加重.由于重金属
毒性大 ,且难以解除 ,因此越来越引起人们的特别关注.Cr6+作为工业“五毒”之一 ,是一种毒性
较大的致畸 、致突变剂[ 1] ,前人详细研究了它对种子萌发 、细胞分裂 、染色体畸变 、植物生理生
化的影响以及对细胞超微结构的损伤[ 2—4] ,但对如何解除 Cr6+所引起的伤害却稀有报到.
多胺作为植物的天然成份 ,广泛分布于高等植物体内 ,其中腐胺 、亚精胺和精胺分布尤为
普遍.近几十年的研究表明 ,多胺具有刺激生长 、延缓衰老的作用 ,并与植物的抗逆性关系密
第 23 卷第 5期
2003 年9 月
环　境　科　学　学　报
ACTA SCIENTIAE CIRCUMSTANTIAE
Vol.23 , No.5
Sep., 2003
DOI :10.13671/j.hjkxxb.2003.05.024
切[ 5 ,6] .前人研究发现当植物遭受水分胁迫 、酸胁迫 、盐胁迫等各种逆境胁迫时 ,多胺合成酶活
力增加 ,内源多胺大量累积.然而对外源多胺缓解各种胁迫 ,尤其是重金属胁迫却报到很少.本
文以水生植物荇菜为材料 ,研究了外施亚精胺对 Cr6+胁迫下荇菜叶中叶绿素 、可溶性蛋白含
量 、保护酶(POD 、SOD 、CAT)活性 、O 2 产生速率的影响 ,以期为缓解重金属胁迫提供参考依据.
1　材料和方法
1.1　仪器与试剂
实验仪器采用 Beckman J2-Mc型冷冻离心机;Beckman DU-8B 型紫外-可见分光光度计;上
海第三分析仪器厂产 UV-754型分光光度计 ,上海天平仪器厂产HHS-4S型电热恒温水浴锅.
亚精胺(Spermidine ,Spd)为 Sigma公司产品(A.R),K2Cr2O 7为上海浦江化工厂产品(A.R),
考马斯亮蓝G250为Fluka公司产品(A.R),标准牛血清白蛋白(BSA)为上海生工生物工程有限
公司产品(A.R).SOD试剂盒 、CAT 试剂盒购于南京建成生物工程研究所.
1.2　实验材料
荇菜(Nymphoides peltatum (Gmel)O.kuntze),龙胆科荇菜属植物.采自江苏省苏州市吴县
东山镇太湖 ,将其移植于水生植物培育池中培养.
1.3　实验方法
5月下旬(30 ～ 33℃),将实验材料放在实验室内无底泥的大玻璃缸(20L)中 ,用自来水驯化
培养 , 3d后选取生长较为一致的植株(并事先确定大小 、颜色等较为一致的幼叶作为各项生理
指标的待测叶片)分成2组 ,分别用含有 0 、1 、2 、4 、8mg L K2Cr2O7(以纯Cr6+计)的培养液处理.
对照组:每天于 7:00和19:00各向叶面喷施蒸馏水一次.亚精胺(Spd)处理组:于相同时间向
叶面喷施 0.1mmol L Spd(预实验表明此浓度的 Spd对植物生长较为有利).第 5 d取样测定.实
验重复3次.
叶绿素含量按照 Arnon[ 7] 的方法测定.可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝 G-250法[ 8] 测定 ,
以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白.O 2 产生速率测定按照王爱国和罗广华的方法[ 9] .SOD活
性用 SOD试剂盒(黄嘌呤氧化酶法)测定[ 10] ,其活性单位定义为:以每 mL反应液中 SOD抑制
率达 50%时所对应的 SOD量为一个亚硝酸盐单位.POD活性测定采用愈创木酚法[ 11] ,以每
min吸光度的变化值表示酶活大小.CAT 活性用 CAT 试剂盒[ 12] 测定 ,其活性单位定义为:每 g
植物材料每 s分解 1μmol H2O2的 CAT 量为一个活力单位.
1.4　数据处理
实验数据用统计学方法进行处理.结果用平均值±标准误差表示 ,用相关系数对各生理指
标与 Cr6+浓度间进行相关性统计 ,用 t-检验法对组间数据进行差异显著性分析.
2　实验结果
2.1　外源亚精胺(Spd)对Cr6+胁迫下荇菜形态的影响
对照组:从 2mg L起 ,第 3 d ,老叶褪绿 ,第 4 d ,嫩叶开始褪绿;并且在 Cr6+浓度为 8 mg L
时 ,老叶和嫩叶上皆有黄褐斑出现 ,其中嫩叶斑点黄色 ,老叶斑点黑色 ,而无 Cr6+胁迫的对照
植物则正常生长.
Spd处理组:第 3 d ,整个浓度梯度的荇菜嫩叶都无显著变化 ,只有 8mg L处理的老叶有褪
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绿现象;第 4 d ,8mg L处理的嫩叶也有明显的褪绿现象 ,且逆光下可以看到内部有斑点出现 ,
但在顺光下却难以看出 ,而此时的老叶已出现了明显的黄褐斑.
图 1　外源 Spd对叶绿素及
可溶性蛋白含量的影响
Fig.1　Effects of exogenous spermidine
on the content of chlorophyll
and soluble protein
因本实验处理时间短 ,Cr6+浓度低 ,无论对照组还是 Spd
处理组 ,芽心和根部都无显著变化.但从幼叶与老叶的变化
上仍可以看出 ,Spd对荇菜 Cr6+毒害有缓解作用.
2.2　外源 Spd对叶绿素含量的影响
如图 1a ,随 Cr6+浓度的增加 ,对照组和 Spd处理组的叶
绿素含量皆为先升后降 ,并且都在 1 mg L Cr6+时达到最大
值.对照组叶绿素含量与 Cr6+浓度间呈显著负相关(r =
-0.85＊).对无Cr6+胁迫的植株喷施Spd可使叶绿素含量增
加11.5%,而对生长在 Cr6+浓度分别为 4 mg L 、8 mg L 的植
株喷施 Spd ,则可分别提高 24.3%、46.1%, 由此可见 ,外施
Spd可显著提高叶绿素含量(t =3.56＊),且随 Cr6+浓度加
大 ,Spd对Cr6+毒害的缓解作用越加显著.
2.3　外源 Spd对可溶性蛋白含量的影响
图 2　外源 Spd对 O 2 产生速率及
SOD活性的影响
Fig.2　Effect s of exogenous spermidine
on O 2 generation rate
and SOD activi ty
对照组的可溶性蛋白含量与 Cr6+浓度间呈显著负相关
(r=-0.83＊).可溶性蛋白含量在单一 1 mg LCr6+处理时最
大 ,而喷施 Spd则在 2 mg L 达峰值 ,且蛋白含量均比相对应
的对照组高(t=3.65＊).对无 Cr6+胁迫的植株喷施 Spd 可使
叶片蛋白含量提高 33.1%,这表明 Spd对蛋白质的合成有促
进作用.在较高 Cr6+浓度下(对照组大于 1mg L ,Spd处理组大于 2mg L),可溶性蛋白含量逐渐
下降.当Cr6+浓度为8mg L 时对照组的蛋白含量已下降了
62.4%,而 Spd处理组却仅下降了 9.4%,这表明 Spd 除了
能促进蛋白合成外 ,对蛋白降解也有强烈的抑制作用.
2.4　外源 Spd对O 2 产生速率的影响
多项研究表明 ,O 2 的损伤作用主要表现在使核酸链
断裂[ 13] 、多糖解聚及不饱和脂肪酸过氧化 ,进而造成膜损
伤[ 14] ,改变线粒体氧化磷酸化等.Cr6+胁迫 4 d后 ,无论是
否喷施 Spd ,荇菜幼叶中O 2 的产生速率均在低 Cr6+浓度
范围内急剧上升 ,并在 2 mg L 时达到最大值 ,而后随处理
浓度的加大逐渐降低 ,其中对照组比 Spd处理组下降幅度
大.由图 2a可见 ,Cr6+在低浓度处理时 ,就对植物产生了
毒害效应 ,诱导O 2 大量产生 ,Cr6+在较高浓度下引起 O 2
产生速率的降低可能是由于细胞内代谢速度大幅度下降.
喷施Spd降低各对应组的O 2 的产生速率(t =3.16＊),可
能与它延缓代谢的下降速度有关 ,从而减轻 Cr6+对植物的
伤害.
2.5　外源 Spd对保护酶系统的影响
6915 期 王　学等:外源亚精胺缓解荇菜(Nymphoides peltatum)Cr6+毒害的生理研究
图 3　外源 Spd对 CAT、POD
活性的影响
Fig.3　Effects of exogenous spermidine on
the activity of CAT and POD
由图 2b可见 ,对照组SOD活性先升后降 ,变化缓和.外
施 Spd ,可在低 Cr6+浓度(1 mg L)下极大的刺激其活性 ,使
其升高幅度高达单一 1 mg L Cr6+处理的 64.7%.但在高
Cr
6+浓度(2 ～ 8mg L)处理下 ,Spd对 SOD活性的影响很小 ,
甚至没有影响.
单一 Cr6+处理下 ,CAT活性先快速上升 ,在 Cr6+浓度为
4mg L时达其峰值 ,随后急剧下降 ,CAT 活性与 Cr6+浓度间
呈极显著正相关(r=0.99＊＊ , n=4).外施 Spd可极显著的
提高CAT活性(t=4.63＊＊),如对 Cr6+浓度分别为 0 、1mg L
的培养液中生长的植株喷施 Spd可使 CAT 活性分别提高
87.1%、107.6%,与 SOD活性变化不同的是在高 Cr6+浓度
下 ,Spd处理组的 CAT 活性仍可保持在较高水平 ,其下降幅
度显著低于对照组(见图 3a).
由图 3b可见 ,对照组和 Spd处理组的 POD活性均呈先
急剧上升后迅速下降的趋势 ,两者均在 2 mg L 达最大值.
Spd处理组的 POD 活性都比相对应的对照组高(t =
3.71＊).
3　讨论
重金属毒害植物的一个重要特征就是引起植物叶绿素减少 、蛋白质含量降低 ,从而使植物
失绿 ,产生毒害现象[ 15] .叶绿素作为植物光合作用的主要色素 ,其含量的高低与植物光合作用
水平的强弱密切相关 ,尽管低浓度(1 mg L)的 Cr6+处理刺激了叶绿素的合成 ,但 2mg L 处理已
表现出下降趋势 ,尤其是高浓度Cr6+(8mg L)对叶绿素的破坏更加显著.前人研究发现 ,Cr6+胁
迫能引起叶绿体膨胀破裂 ,类囊体膜解体 ,从而导致叶绿素从组织中流失.而带正电荷的多胺
则可与膜上带负电荷的磷脂头部及其它带负电的基团结合 ,提高膜的稳定性 ,延缓 Cr6+胁迫
所引起的类囊体膜的破坏 ,阻止叶绿素丧失[ 16] .多胺也参与蛋白质合成 ,刺激蛋白质合成的各
个中间步骤 ,如激活一系列氨酰-tRNA合成酶与核糖体结合 ,起装备核糖体和稳定亚基的作
用 ,并参与蛋白质合成的起始 、延长 、终止各个过程[ 17] ,因而在无 Cr6+胁迫的情况下 ,喷施 Spd
可使蛋白质含量大幅度增加;Spd延缓高 Cr6+浓度下蛋白质降解的机制可能在于:Spd抑制酸
性蛋白酶和中性蛋白酶活性的提高[ 18] .
植物体内源保护系统抗胁迫的机制和能力决定植物对逆境胁迫响应的特征.逆境胁迫引
起植物体内产生大量 O 2 等自由基 ,造成叶绿素和蛋白质含量降低 ,使植物产生毒害现象 ,同
时启动防御系统.SOD 、CAT 、POD等是植物体内的保护酶系统 ,它们在重金属胁迫中所起的作
用已经得到了许多证明[ 19] .SOD能以O 2 为基质进行歧化反应:2O 2 +2H+※H2O2 +O2 ,从而
起到清除植物体内O 2 的作用 ,CAT 和 POD则能够有效地清除 H2O2 和其它的氧自由基.实验
中低 Cr6+浓度处理时 ,SOD 、CAT 、POD活性受活性氧自由基的诱导而升高 ,但随着处理浓度的
增加 ,这 3种保护酶的活性受到抑制而逐渐下降.外施Spd可提高这 3种保护酶的活性[ 20 , 21] ,
降低活性氧的产生速率 ,减缓 Cr6+对植物的伤害.但 Spd对三种保护酶的作用各不相同 ,在低
Cr
6+浓度下 ,Spd可显著提高SOD的活性 ,而在高 Cr6+浓度下 ,Spd却难以使 SOD活性提高 ,这
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可能是SOD对 Cr6+更加敏感.与此相反 ,CAT活性不仅在低 Cr6+浓度下受 Spd影响大大提高 ,
而且在高 Cr6+浓度下 ,Spd仍能使 CAT 活性稳定在较高水平 ,并在一定程度上几乎不再受Cr6+
浓度的影响.POD 则与两者皆不相同 ,Spd 在各 Cr6+浓度下均能提高 POD的活性.正是因为
CAT 、POD在高Cr6+浓度时仍保持较高活性 ,导致H2O2 浓度下降 ,从而在SOD活性降低的情况
下 ,歧化反应仍能正常进行 ,使 O 2 产生速率低于对照.
综上所述 ,Spd通过大幅度的提高保护酶活性(SOD 、CAT 、POD),降低 O 2 等活性氧的产生
速率 ,从而阻止叶绿素和蛋白质含量降低 ,缓解 Cr6+引起的毒害现象 ,提高植物对重金属胁迫
的抵抗力.
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