全 文 ：山东科学
SHANDONG SCIENCE
第 25 卷 第 1 期 2012 年 2 月出版
Vol． 25 No． 1 Feb． 2012
收稿日期:2011-12-10
基金项目:山东省自然科学基金(Y2007D40)
作者简介:齐文静(1988 －) ，女，硕士研究生，主要从事野大豆根瘤菌多样性研究。
* 通讯作者，Email:daimeixue@ sdnu． edu． cn
DOI:10． 3976 / j． issn． 1002 － 4026． 2012． 01． 007
黄河三角洲地区野大豆根瘤菌生物学特性
及其遗传多样性研究
齐文静，何冬华，夏志洁，戴美学*
(山东师范大学生命科学学院，山东 济南 250014)
摘要:野大豆具有耐盐碱、抗寒、抗病等特点，对于研究大豆遗传基因的变迁、改善大豆品质和产量具有重要作用。为了
探明黄河三角洲地区野大豆根瘤菌的生物学特性及其遗传多样性，从黄河三角洲地区的 14 个乡镇 26 个采样点采集了
227 株野大豆，从其根瘤中分离纯化根瘤菌，进行一系列的生理生化实验、抗逆性实验、结瘤能力测定、结瘤广谱性测定、
16S rDNA序列测定和 RAPD分析，共分离纯化出 100 株根瘤菌，其中菌株 3D-21，3D-24，3K-8，3K-23VS等对酸、碱、盐、抗
生素、高温、低温均有较强耐受性，且结瘤能力也较强;菌株 7K-8结瘤能力较强，K-5 抗逆性较强。16S rDNA序列测定表
明所获菌株分属于 3个属 7个种，相近菌株的 RAPD分析呈现明显的多态性。结果表明黄河三角洲地区野大豆根瘤菌
存在着丰富的多样性，部分菌株结瘤能力和 /或抗逆能力强，该研究为挖掘、利用优良菌株资源奠定了基础。
关键词:野大豆;根瘤菌;抗逆性;遗传多样性
中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:1002-4026(2012)01-0032-06
Research on biological characteristics and genetic diversity of
rhizobia of Glycine soja in the Yellow River Delta
QI Wen-jing，HE Dong-hua，XIA Zhi-jie，DAI Mei-xue*
(School of Life Sciences，Shandong Normal University，Jinan 250014，China)
Abstract∶ Wild soybeans (Glycine soja)have such positive characteristics as saline-alkali resistance，cold tolerance and
disease resistance，so they play a significant role in the research on soybean gene evolution and the improvement of
soybean quality and yield． We collected 227 wild soybeans from 26 sites of 14 rural towns in the Yellow River Delta，and
isolated and purified rhizobia strains from wild soybean nodules． We then performed physiological and biochemical
experiments，stress tolerance experiments，nodulation ability determination，nodulation wide spectrum analysis，16S rDNA
sequence determination and RAPD analysis． We isolated and purified 100 rhizobia strains from Glycine soja． Strains 3D-21，
3D-24，3K-8 and 3K-23VS had strong tolerance against acid，alkali，salt，antibiotics，high and low temperature and
stronger nodulation capability． Strain 7K-8 had stronger nodulation capability and strain K-5 had stronger stress tolerance
capability． 16S rDNA sequence analysis shows that all the isolated strains belong to 3 genera and 7 species，and that
RAPD analysis of similar strains exhibits obvious polymorphism． Results indicate that rich diversity exists in the rhizobia of
wild soybean in the Yellow River Delta． Some strains have strong nodulation ability and /or stress tolerance ability． This
research lays a foundation for the excavation and utilization of better strain resources．
第 1 期 齐文静，等:黄河三角洲地区野大豆根瘤菌生物学特性及其遗传多样性研究
Key words∶ wild soybean (Glycine soja) ;rhizobium;stress tolerance;genetic diversity
根瘤菌 －豆科植物共生固氮体系是自然界固氮效率最高、固氮量最多的生物固氮体系，生物固氮可以增
加土壤生物氮源、培肥地力和改良土壤［1］，因此研究大豆根瘤菌对于提高生物固氮能力，促进农业可持续发
展有着重要的意义。黄河三角洲植被稀少，生态脆弱，拥有大量的盐碱化土地，多数土地土壤含盐量在 1%
以上，土壤呈弱碱性。这里散片式生长着一定数量的野大豆(Glycine soja)。野大豆具有耐盐碱、抗寒、抗病
等许多特点，与大豆是近缘种，对于研究大豆遗传基因的变迁、改善大豆品质、提高大豆产量具有重要作
用［2］。1984 年，国家将野大豆确定为珍稀濒危野生植物，为更好地保护、利用野大豆这一宝贵的野生植物资
源，早在 2004 年，国家在地处黄河三角洲地区的垦利县建立了 1000 亩的国家级野大豆自然保护区，并组织
农业专家深入湿地、草场，对野大豆及其伴生植物的分布状况、种类，生长发育状况、生育特性、生育期等进行
了详细调查。但到目前为止，对这一地区野大豆根瘤菌的研究鲜见报道。本文就该地区野大豆根瘤菌的抗
逆性、结瘤能力、结瘤广谱性以及遗传多样性做了较为系统的研究，筛选获得几株结瘤能力强、抗逆性强的优
良菌株，为野大豆优良根瘤菌资源的挖掘、开发、利用奠定了基础［3 － 5］。
1 材料与方法
1． 1 菌株的分离和培养
从黄河三角洲地区的垦利县(黄河口镇、永安镇、胜坨镇、董集乡、西宋乡)、利津县(陈庄镇、盐窝镇、汀
罗镇、明集乡)、东营区(牛庄镇、龙居镇)、河口区(孤岛镇、仙河镇、义和镇)共 26 个取样点采集 227 株野大
豆，编号分类，从其根部取出根瘤，无菌水冲洗干净，75%的乙醇处理 5 min，0． 1%的 HgCl2(或 10%的 H2O2)
处理 1 ～ 3 min，无菌水冲洗 5 ～ 10 次，无菌条件下将根瘤压碎，挤出汁液，接种于 YMA培养基平板上，28℃培
养;采用稀释涂布法和平板划线法进一步纯化，挑取单菌落，进行革兰氏染色、镜检，接入试管斜面中保存备
用。
1． 2 生理生化特性测定
依据文献［6 － 8］对分离纯化的菌株进行以下生理生化特性实验:刚果红培养基实验、3-酮基乳糖反应、
柠檬酸盐利用实验、牛肉膏蛋白胨培养基实验、牛奶石蕊实验、BTB反应、唯一氮源实验等。
1． 3 抗逆性研究
以 YMA培养基为基础培养基。耐盐性实验分别添加终浓度为 1%，2%，3%，4%，5%和 6%的 NaCl。
耐酸碱实验所用 pH值为 4，5，9 ～ 15。温度范围测定选择 4 ～ 50 ℃。抗药性实验分别添加终浓度 50 μg /mL
青霉素、15 μg /mL四环素、20 μg /mL卡那霉素。
1． 4 结瘤能力及结瘤广谱性研究
菌株的回接实验采用水培法，将萌发两天的野大豆幼苗放在灭菌过的 Fahraeus 无氮培养液［6］中，分别
加入分离纯化出的 100 株菌的菌悬液(浓度约 1 × 108 mL －1)1 mL，45 d之后观察、统计结瘤情况。根据回接
结果，比较 100 株根瘤菌的结瘤能力。除以野大豆作为供试植物外，还分别以蚕豆(临蚕 5 号)、花生(鲁花 9
号)进行了结瘤实验，以同样条件下培养的不接种根瘤菌悬液的植株作对照。
1． 5 多样性的研究
1． 5． 1 16S rDNA序列分析
利用百泰克细 菌 基 因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 提 取 菌 株 的 基 因 组 总 DNA。使 用 引 物 Fd1:
5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和 rD1:5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3进行 PCR 扩增，产物由上海生
工进行测序。将测得的 16S rDNA 序列在 GenBank 数据库中进行 BLAST 同源性检索并进行序列分析，用
ClustalW进行多序列比对，采用 MEGA4． 1 软件中的 Neighbor-joining法构建进化树。
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山 东 科 学 2012 年
1． 5． 2 随机引物多态性技术(RAPD)分析
文献［9］筛选 2 条扩增效果好的引物，分别为引物 S241:ACGGACGTCA 和引物 S301:CTGGGCACGA。
反应条件为:92 ℃变性 3 min，94 ℃变性 1 min，38 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，共 35 个循环，72 ℃再延伸
3 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测片段长度。
2 结果与分析
2． 1 根瘤菌的分离与回接
对黄河三角洲 26 个取样点的 200 多株野大豆进行了根瘤菌的分离，经纯化共获得 100 株根瘤菌。根据
形成菌落所需培养时间的长短大致将获得的根瘤菌分为快生根瘤菌(2 ～ 3 d)和慢生根瘤菌(5 ～ 7 d)两类，
其中快生根瘤菌有 99 株，而慢生根瘤菌仅有一株(编号为 7K-8)。快生根瘤菌在 YMA结晶紫固体培养基上
菌落大，凸起，乳白色(少部分菌落为浅黄色) ，半透明，表面粘稠、光滑，边缘整齐;YMA液体培养基中呈乳白
色絮状沉淀，无可溶性色素生成。慢生根瘤菌菌落除直径较小，菌落较不透明外，与快生根瘤菌无太大的区
别。回接实验结果显示，获得的 100 株根瘤菌均能使野大豆植株结瘤。
2． 2 生理生化实验测定
对分离获得的根瘤菌菌株进行了生理生化特性测定，表 1 列出部分菌株测定结果。所有供试菌株均表
现为 3-酮基乳糖、淀粉水解反应阴性，表明菌株不具备利用相关物质的酶。慢生型菌株表现为柠檬酸盐利
用阳性反应，快生型菌株表现为牛肉膏蛋白胨阳性反应。BTB 产酸产碱反应和石蕊牛奶反应均显示，快生
菌代谢产酸，而慢生型菌株代谢产碱。通过刚果红培养基实验、牛肉膏蛋白胨培养基实验、3-酮基乳糖培养
基实验、柠檬酸盐培养基实验、BTB 实验、牛奶石蕊实验、唯一氮源等实验，更加确定地将根瘤菌属与其他易
于和根瘤菌属相混淆的土壤杆菌属区分开来。
表 1 野大豆根瘤菌生理生化实验结果(部分菌株)
Table 1 Results of physiological and biochemical experiments of wild soybean rhizobia (part strains)
菌株 BTB反应
刚果红
培养基
3-酮基
乳糖
牛肉膏
蛋白胨
柠檬酸盐
唯一氮源培养
L-精氨酸 L-组氨酸 对照
石蕊牛奶 水解淀粉 过氧化氢酶
3D-7 产酸 + + + 阴性 + + － + + + + + + + 产酸 阴性 产气
3D-21 产酸 + + + 阴性 + + － + + + + + + + 产酸 阴性 产气
7K-8 产碱 + 阴性 － + + + + 产碱 阴性 产气
10K-1 产酸 + + 阴性 + + + － + + + + + 产酸 阴性 产气
13K-3S 产酸 + + 阴性 + + + － + + + + + + + 产酸 阴性 产体
注:“ + + +”为生长极旺，“ + +”为生长较旺，“ +”为生长少，“ －”为不生长
2． 3 抗逆性实验
2． 3． 1 耐盐性实验
将实验分离的菌株在含有不同浓度 NaCl的 YMA培养基中进行培养，以测定其耐盐性。实验表明，所分
离的根瘤菌菌株均可在无盐培养液中生长，而少量氯化钠的添加则有助于根瘤菌的生长。在氯化钠浓度为
0 ～ 1%的培养基中，实验分离的根瘤菌各菌株生长良好。NaCl浓度为 2%时，80 株菌株能够生长;NaCl浓度
为 3%时，55 株菌株能够生长;当 NaCl浓度为 4%或更高时，仍有 16 株根瘤菌能够生长。这些根瘤菌的耐盐
性明显高于其他地区报道的根瘤菌耐盐度［10］。推测其与分离地点黄河三角洲地区土壤盐浓度较高有一定
关系。
2． 3． 2 耐酸碱实验
本实验获得的 99 株快生型根瘤菌中，89 株菌能在 pH =8 的条件下生长，30 株菌株在 pH = 11 及以上仍
能生长，甚至有 3 株菌株能在 pH =14 的条件下生长，但它们的耐酸性却很弱，最高耐酸度仅为 pH = 5。相
对而言，虽然慢生根瘤菌 7K-8 的耐碱性相对较弱，仅为 pH = 8，但其耐酸性却强于快生型根瘤菌，最高耐酸
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第 1 期 齐文静，等:黄河三角洲地区野大豆根瘤菌生物学特性及其遗传多样性研究
度能达到 pH =4。这些特点除了与快生型根瘤菌产酸，慢生型根瘤菌产碱的特性相关，推测还与该地区土壤
环境的盐碱化程度较高有关。土壤盐和 pH 值可能是影响菌株抗逆能力的主要因子［11 － 12］，其中土壤高盐含
量和高 pH值环境对菌株耐盐、耐碱能力表现为促进作用［13］，对菌株耐酸能力表现为抑制作用，且土壤盐的
作用大于土壤 pH值的作用，本实验结果与黄玲等的报道［14］较为一致。
2． 3． 3 温度敏感性实验
黄河三角洲四季温差明显，年平均气温 11． 7 ～ 12． 6℃，极端最高气温 41． 9℃，极端最低气温 － 23． 3℃，
高温或低温在一定程度上会抑制根瘤菌的生长，耐高、低温菌株的筛选有利于提高根瘤菌的生存与竞争能
力。实验表明，25 ～ 32℃较适于根瘤菌的生长，4 株菌能在 10℃下生长，7 株菌能在 40℃下生长，其中，菌株
3D-21，3D-24，3K-23VS，11K-2S的生长温度范围较广，是优质菌株。当温度小于 4℃或者大于 50℃，所有菌
株均不生长。
2． 3． 4 抗药性实验
在本实验分离获得的根瘤菌中，90 株菌株能够耐受 50 μg /mL 浓度的青霉素，20 株菌株分别能够耐受
15 μg /mL浓度的四环素和 20 μg /mL浓度的卡那霉素。其中 7K-8，3D-28，14K-3 在浓度为 50 μg /mL的青
霉素、15 μg /mL的四环素和 20 μg /mL卡那霉素的培养基中均生长良好，具有多重抗药性。
2． 4 结瘤能力及结瘤广谱性研究
100 株野大豆根瘤菌虽然都能
使大豆幼苗根系结瘤，但在结瘤能
力方面表现不相同。通过对大豆幼
苗根系结瘤时间和结瘤大小的观
察，比较了实验所得 100 株野大豆
根瘤菌的结瘤能力，部分结果如表
2 所示。实验结果表明，尽管慢生
型菌株生长速度不及快生型菌株，
但结瘤能力并不比快生型菌株差，
这可能与它的生活力强、菌苔粘稠
丰满、不易退化有关。另外，结瘤能
表 2 野大豆根瘤菌结瘤能力比较(部分菌株)
Table 2 Nodulation capability comparison of wild soybean rhizobia strains (part strains)
菌株 根瘤数 /植株 平均单株瘤重 / g 植株长度 / cm 长势
7K-8 20 0． 734 52． 4 长势良好，植株健壮
3K-8 13 0． 752 53． 2 长势良好，植株健壮
D-3VS 22 0． 746 48． 8 长势良好，植株健壮
3D-21 6 0． 738 45． 3 长势良好，植株健壮
12K-4 9 0． 757 56． 2 长势良好，植株健壮
10K-12 7 0． 735 44． 2 长势良好，植株健壮
D-4S 10 0． 729 31． 8 长势良好，植株健壮
14K-2 29 0． 749 52． 6 长势良好，植株健壮
11K-3 17 0． 738 52． 8 长势良好，植株健壮
力测定结果为选育结瘤能力强的优质菌株源提供了基础。结瘤广谱性研究结果显示，供试菌株只能使野大
豆植株结瘤，而不能使同为豆科植物的花生、蚕豆植株结瘤，表明该地区野大豆根瘤菌具有结瘤专一性。
2． 5 野大豆根瘤菌多样性分析
对实验获得的 65 株根瘤菌进行了 16S rDNA序列的扩增，获得预期 1． 5 kb左右的条带并回收测序。将
测得的 16S rDNA序列提交 GenBank数据库进行 BLAST比对，结果表明这些根瘤菌分别属于 α-变形杆菌中
的中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、根瘤菌属(Rhizobium)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)。其中中华根瘤菌
占的比重较高，达到了 98%，是该地区的优势菌群。根据国际原核生物系统学会裁决委员会 2008 年在
IJSEM上正式发布合并 Sinorhizobium与 Ensifer 属的决定［15 － 16］，实验所得菌株属于中华根瘤菌属下的 5 个
种，分别是费式中华根瘤菌(S． fredii)、美洲中华根瘤菌(S． americanum)、新疆中华根瘤菌(S． xinjiangense)、
木本树中华根瘤菌(S． arboris)与墨西哥剑菌(Ensifer adhaerens)。对具有代表性的 22 株根瘤菌采用
MEGA4． 1 软件中的邻接法(neighbor2joining，NJ )构建进化树(图 1)。结果显示，实验分离的 S． fredii，
S． americanum和 S． xinjiangense中的 16 株菌进化关系很相近，集中于一个大的分支下。菌株 3K-23VS，11K-
3，3K-6S，10K-1 和 11K-2S与已报道菌株 S． arboris LMG 14917 聚为一类，3D-7 与已报道菌株 E． adhaerens
4CCS7 聚为一类，而且各自独立分支。
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山 东 科 学 2012 年
图 1 野大豆根瘤菌 16S rDNA序列的系统发育树
Fig． 1 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of Glycine soja rhizobia
注:M，Marker2000;1，10K-9;2，k-2;3，3D-2;
4，2K-9S;5，10K-16S;6，K-12
图 2 RAPD图谱
Fig． 2 RAPD maps
将经 16S rDNA 序列测定同为中华根瘤菌的菌株
进行了 RAPD分析，部分实验结果如图 2 所示。两条
所选随机引物 S241 和 S301 在野大豆根瘤菌中均有较
好的扩增结果多态性，而且 S301 效果更好。其中菌株
10K-9，2K-9S，10K-16S 的 16S rDNA 序列一致，但是
RAPD图谱有明显差异，说明这三株菌确为不同的菌
株，且 RAPD能够作为根瘤菌菌株水平分析的有效技
术。
3 结语
根瘤菌本研究分离获得的 100 株根瘤菌在结瘤能
力及抗逆性方面表现出一定的差异性，其中菌株
3D-21，3D-24，3K-8，3K-23VS 等对酸、碱、盐、抗生素、
高温、低温均有较强耐受性的同时，结瘤能力也较强，这为选育抗逆性、结瘤能力较强的优质菌株资源提供了
基础。
某些菌株表现出较突出的单一优良性状，如 7K-8 结瘤能力强，但抗逆性方面并没表现出优势，菌株 K-5
虽在抗逆性方面表现出较强的优势，但结瘤能力并不强;由于单一菌株生物学性质的限制，其在不同土壤的
适应能力、竞争能力都将影响其最终的定植、结瘤情况，因此发挥多种根瘤菌菌株的优势［17］，是目前菌剂研
究中的重要内容，本研究为实现混合接种、提高综合效应提供了材料。
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第 1 期 齐文静，等:黄河三角洲地区野大豆根瘤菌生物学特性及其遗传多样性研究
通过多样性的分析，发现该地区根瘤菌存在着丰富的多样性，即使同一种属的根瘤菌之间仍然存在着明
显的差异，这为该地区根瘤菌资源的开发利用奠定了基础。
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