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收稿日期: 2011-01-04
基金项目: 北京市教委基金 （KM200510082008）资助。
作者简介: 王 静，女，硕士研究生。E-mail:wangjing2007hehe@sina.com
* 通讯作者: 韩素贞，女，副教授。E-mail: hansuzhen@vip.sina.com
安徽农业大学学报, 2012, 39(2): 273-279
Journal of Anhui Agricultural University
网络出版时间：2012-02-29 14:22
[URL] http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20120229.1422.026.html
野大豆等宿主根瘤菌表型及 16S rDNA PCR-RFLP 研究

王 静，刘 磊，梁 芳，欧明丽，刘少佳，胡玉莹，杨 帆，韩素贞*
(首都师范大学生命科学学院, 北京 100048)

摘 要：采用数值分类和16S rDNA PCR-RFLP对分离自北京部分地区野大豆（Glycine soja sieb）、大豆（Glycine
max）、菜豆（Phaselous vulgaris）和长萼鸡眼草（Kummerowiae stipulacea）等宿主的 60 株菌及 10 株根瘤菌参比菌
株进行了研究。数值分类结果表明，在 70.5%相似性水平上，所有的菌株可分为 3 群：群 I 为未知菌群，群 II 为快
生和中慢生菌，群 III 为慢生菌群。依据 16S rDNA PCR-RFLP 分析建立的树状图，在 69％的相似性水平上所有的
供试菌株可以分为 9 个系统发育分支。分支 I、V、VI、VII、VIII 和 IX 没有参比菌，数值分类中群 I 的供试菌株
基本上都处于这些分支。分支 II 为 Sinorhizobium-Mesorhizobium-Rhizobium，分支 III 为 Agrobacterium 分支，分支
IV 为 Bradyrhizobium 分支。
关键词：根瘤菌；数值分类；16S rDNA； PCR-RFLP
中图分类号：Q939.11 文献标识码：A 文章编号：1672−352X (2012)02−0273−07

Phenotypic analysis and 16S rDNA PCR-RFLP of rhizobial strains isolated
from Glycine max etc.

WANG Jing, LIU Lei, LIANG Fang, OU Ming-li, LIU Shao-jia, HU Yu-ying, YANG Fan, HAN Su-zhen
(Life Science College, Capital Normal University, Beijing 100048)

Abstract: Sixty strains obtained from root nodules of Glycine soja sieb, Glycine max, Phaselous vulgaris and
Kummerowiae stipulacea of Beijing were studied with numerical taxonomy and 16S rDNA PCR-RFLP. Results of
numerical taxonomy indicated that all strains included 10 rhizobium reference strains were divided into 3 groups
at 70.5% similarity. Group I is an unknown group with no reference strains. Group II belongs to fast and mid-
dle-slow-growing type, and group III belongs to slow-growing kind. The dendrogram derived from 16S rDNA
PCR-RFLP showed that all strains divided into nine phylogenetic branches at the similarity of 69％. They are
branches I, V, VI, VII, VIII and XI with no reference strains，II (Sinorhizobium -Mesorhizobium- Rhizobium),
III(Agrobacterium) and IV (Bradyrhizobium).
Key words: Rhizobium; numerical taxonomy; 16S rDNA; PCR-RFLP

我国是大豆（Glycine max）的起源和分布中心，
能与大豆结瘤的根瘤菌资源也十分丰富。野大豆
（Glycine soja sieb）与大豆是近缘种，因其抗逆性
强，农业上利用它培育优良的大豆品种，但其根瘤
菌国内外研究不多。长萼鸡眼草（Kummerowiae
stipulacea）为一年生草本，全草入药，有清热解毒、
健脾利湿等功效，其根瘤菌的研究国内外尚未见报
道。为此，作者对分离自北京部分地区的大豆、野
大豆和长萼鸡眼草等宿主的 60 株菌进行了数值分
类和 16S rDNA PCR-RFLP 研究，目的主要是考察
这些宿主根瘤菌的表型和遗传多样性特征，丰富和
保存根瘤菌多样性的基因库，发掘新的、优良的根
瘤菌种质资源。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
选取从北京海淀区、门头沟区和顺义县采集的
豆科植物野大豆（Glycine soja sieb）、大豆（Glycine
DOI:10.13610/j.cnki.1672-352x.2012.02.017
274 安 徽 农 业 大 学 学 报 2012 年

max）、菜豆（Phaselous vulgaris）和长萼鸡眼草
（Kummerowiae stipulacea）等的新鲜根瘤，用无菌
水洗涤后放入 95% 酒精浸泡 5 min，再用 0. 1% 升
汞消毒 5 min，最后用无菌水冲洗 6 次。采用平板
划线法分离纯化菌株，挑取单菌落，选取 60 株革兰
氏染色阴性的杆菌和 10 株根瘤菌参比菌进行研究。
参比菌分属 Agrobacterium 、 Bradyrhizobium 、
Mesorhizobium、Rhizobium 和 Sinorhizobium 5 个属。
菌株及其宿主和来源见表 1。所有菌株都用 YMA[1]
培养基培养，培养温度为 28℃。
1.2 表型测定与数值分类
测试了 60 个菌株 80 个表型特征，包括碳源和
氮源的利用、对抗生素和染料的抗性、pH 范围和
NaCl 耐受浓度以及一些酶活性[1]。将测定结果转换
为二进制数据，根据单匹配系数法（Ssm）考察它
们的相似性，采用无加权平均连锁法（UPGMA）
进行聚类，聚类的结果用树状图表示[2]。
1.3 16S rDNA PCR-RFLP
按文献[3]提取所有菌株总 DNA 作模板，选用位
于 E.coli 16S rRNA 基因序列保守区域 8~27 和
1 524~1 540 的两段序列为引物（P1 和 P6）[4]，进
行 16S rDNA 扩增[5]。10～15 μL 扩增产物用限制性
内切酶 Msp I、Hinf I、Rsa I 和 Hae III 消化[6]，酶
切片段用 3% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测[7] 。对应每
一个酶切电泳图谱照片，凡是电泳图谱上不同菌株
间迁移速率相同的带被认为是同一个性状；相应的，
对应于每一个菌株，在此位置上有带的编码为“1”，
无带的编码为“0”，这样使所有酶切图谱带的数据
转换为计算机能接受的数值，输入 MINTS 分析软
件进行分析，得树状图。
2 结果与分析
2.1 表型测定与数值分类
根据生长速度，可将供试菌分为快生型（培养
3 d 菌落直径大于 3 mm 以上）和慢生型（培养 7 d
菌落直径小于 1 mm）2 种类型。60 株未知供试菌
中，有 43 株是快生型，17 株是慢生型。所有菌株
均能在 pH11.0 的 YMA 培养基上生长，有 6 株菌（3
株快生和 1 株慢生菌，分离自野大豆；2 株慢生菌，
分离自鸡眼草）能在 pH12.0的YMA培养基上生长。
38 株菌能在 40℃生长，其中快生菌 30 株，慢生菌
8 株。快生菌中有 20 株能耐 5%的 NaCl，慢生菌中
只有 5 株能耐 5% NaCl。在 24 种测试碳源中，快生
菌和慢生菌均能利用其中的蔗糖、L-精氨酸、D-山
梨酸、肌醇、半乳糖、D-果糖、乳糖和 DL-脯氨酸
等8种。33株快生菌对红霉素的抗性达300 μg·mL-1，
其中有 18 株对青霉素的抗性达 300μg·mL-1；14 株
慢生菌对红霉素的抗性达 300 μg·mL-1，11 株对氯霉
素的抗性达 300 μg·mL-1。
对 60 株分离自野大豆、大豆、菜豆和鸡眼草的
供试菌和10株参比菌株进行的80项表型性状数据，
采用无加权平均连锁法进行聚类分析，获得了供试
菌的树状图（图 1）。
从图 1 可以看出，在 70.5%相似水平上，所有
的供试菌分为 3 个群，群 I 为未知群，群 II 由
Agrobacterium、Mesorhizobium、Sinorhizobium 和
Rhizobium 组成，群 III 由慢生根瘤菌属 Bradyr-
hizobium 组成。在 80.5%的相似水平上，除了
Bradyrhizobium 的种，参比菌株基本能够按不同的
种彼此分开。
群 I 分为 4 个亚群（亚群 1-4）。亚群 1 包括 8
个菌株，3 株分离自大豆，5 株分离自野大豆。亚群
2 包括 3 株菌，2 株分离自鸡眼草，1 株分离自野大
豆。亚群 3 共 13 株菌，1 株分离自大豆，其余 12
株均分离自野大豆。亚群 4 包括 2 株菌，分离自野
大豆。群 I 各亚群均没有与参比的已知菌聚在一起，
其分类地位需要用其它分类学方法进一步确认。
群Ⅱ分为 7 个亚群（亚群 5-11）。亚群 5 包括 5
株菌，4 株分离自大豆，1 株为参比菌 M. loti
NZP2213。亚群 6 包括 2 个分离自野大豆的 2 个菌
株。亚群 7 有 4 株菌，3 株菌分离自野大豆，1 株为
参比菌 M. huakuiense CCBAU 2609T。亚群 8 包括 2
株菌，1 株分离自野大豆，1 株为参比菌 A.
tumufaciens IAM 13129 T。亚群 9 包括 4 株菌，1 株
菌分离自野大豆，1 株菌分离自鸡眼草，2 株为参比
菌 S. meliloti USDA 1002 T和 102F28。亚群 10 中，
R. leguminosarum USDA 2370 与 1 株分离自鸡眼草
和 1 株分离自野大豆的供试菌聚在一起。亚群 11
包括 2 株菌，1 株分离自鸡眼草，1 株分离自野大豆。
群 II 的 3 个亚群 5、6 及 11 没有与参比菌聚在一起，
它们有可能是根瘤菌新的分类单元，可以通过看家
基因序列分析、DNA-DNA 杂交等分子生物学方法
进一步确定。
群 III 分为 3 个亚群（亚群 12-14）。亚群 12 包
括 3 株菌，2 株分离自野大豆，1 株分离自鸡眼草。
亚群 13 有 8 株菌，4 株分离自鸡眼草，1 株分离自
野大豆，3 株为参比菌 B. japonicum USDA 6 T和 B15
及 B. yuanmingyuanense10073。亚群 14 包括 2 株菌，
1 株分离自野大豆，1 株分离自鸡眼草。群 II 的 2
个亚群 12 和 14 没有与参比菌聚在一起，它们是否
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是慢生根瘤菌属 Bradyrhizobium 的新种，有待其他 分类方法来确定。

表 1 供试菌株一览表
Table 1 List of strains studied
菌株Strain 宿主 Host 来源 Origin 菌株 Strain 宿主 Host 来源 Origin
bhs01003 Glycine max 北京市门头沟区 sd01051 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bhs01010 Glycine max 北京市门头沟区 sd01052 Glycine soja sieb 北京市顺义县
Bhs01012 Glycine max 北京市门头沟区 sd01060 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bhs01014 Glycine max 北京市门头沟区 sd01067 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bhs01015 Glycine max 北京市门头沟区 sd01071 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bhs01020 Glycine max 北京市门头沟区 sd01107 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bhs01031 Glycine max 北京市门头沟区 sd01108 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bhs01040 Glycine max 北京市门头沟区 sd01109 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bhs01062 Glycine max 北京市门头沟区 sd01120 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bws0101 Kummerowia striata 北京市门头沟区 sd01152 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bws0104 Kummerowia striata 北京市门头沟区 sd01155 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bws0112 Kummerowia striata 北京市门头沟区 sd01160 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bws0114 Kummerowia striata 北京市门头沟区 sd01185 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bws0115 Kummerowia striata 北京市门头沟区 sd01188 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bws0117 Kummerowia striata 北京市门头沟区 sd01241 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bws0126 Kummerowia striata 北京市门头沟区 sd010721 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bws0129 Kummerowia striata 北京市门头沟区 sd010722 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bws0130 Kummerowia striata 北京市门头沟区 sd010723 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bws0132 Kummerowia striata 北京市门头沟区 sd011111 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bws0134 Kummerowia striata 北京市门头沟区 sd011352 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bws0141 Kummerowia striata 北京市海淀区 sd011482 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bws0146 Kummerowia striata 北京市海淀区 sd011541 Glycine soja sieb 北京市顺义县
bws0148 Kummerowia striata 北京市海淀区 sd011781 Glycine soja sieb 北京市顺义县
sd01003 Glycine sojasieb 北京市顺义县 sd011782 Glycine soja sieb 北京市顺义县
sd01013 Glycine sojasieb 北京市顺义县 sd011783 Glycine soja sieb 北京市顺义县
sd01017 Glycine soja sieb 北京市顺义县 sd01193 Phaselous vulgaris 北京市顺义县
sd01020 Glycine soja sieb 北京市顺义县 Rhizobium leguminosarum USDA2370 Pisum satium 美国
Sdo1021 Glycine soja sieb
北京市顺义县 Sinorhizobium meliloti
102F28
USDA 1002 T
Medicago sativa 美国
sd01025 Glycine soja sieb 北京市顺义县 Agrobacterium tumefaciens IAM 13129 T Neptunia natans 日本
sd01036 Glycine soja sieb 北京市顺义县 Mesorhizobium ciceri USDA 3378 T Cicer aret inum 美国
sd01046 Glycine soja sieb
北京市顺义县 Bradyrhizobium japonicum
USDA 6 T
B15
Glycine max 美国
sd01047 Glycine soja sieb 北京市顺义县 B. yuanmingyuanense USDA 10073 Glycine max 美国
sd01048 Glycine soja sieb 北京市顺义县 Mesorhizobium huakuii CCBAU2609 Astragalus sinicus 中国
sd01049 Glycine soja sieb 北京市顺义县 Mesorhizobium loti NZP2213 Lotus corniculatus 新西兰
T：Type strain; CCBAU: Culture Collection of Beijing Agricultural University, China; NZP: Division of Scientific and Indus-
trial Research, Palmerston, New Zealand; USDA: The United States Department of Agriculture, USA; IAM: Institution of Applied
Microbiology, the University of Tokyo, Japan.

2.2 16S rDNA PCR-RFLP
对 60 株待测菌进行了 16S rDNA 的扩增，扩增
产物分别用 4 种限制性内切酶 AluⅠ、Hae Ⅲ、 Hinf
Ⅰ和 MspⅠ酶切，酶切产物用 3%琼脂糖凝胶电泳
276 安 徽 农 业 大 学 学 报 2012 年

分离，得到的不同大小分子量的限制性内切酶片断
总和接近于未消化 PCR 产物的全长(1.5 kb) 。电泳
图谱经 MINTS 软件分析、聚类，得到树状图（图 2）。
从图 2 可以看出，在 69％的相似性水平上所有的供
试菌可以分为 9 个系统发育分支。分支 I、V、VI、
VII、VIII 和 IX 没有参比菌，数值分类中的群 I 的
供试菌基本上都处于这些分支。分支 II 为
Sinorhizobium-Mesorhizobium-Rhizobium，分支 III
为 Agrobacterium 分支，分支 IV 为 Bradyrhizobium
分支。



图 1 供试菌的数值分类树状图
Figure 1 Dendrogram showing the phenotypic similarities among the isolates and strains
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图 2 供试菌的 16S rDNA PCR-RFLP 树状图
Figure 2 Dendrogram showing the preliminary phylogenies of four groups from PCR-RFLP data of 16S rRNA gene

在 74％的相似性水平上，分支 I 可以分为 2 个
亚分支（亚分支 1-2），这 2 个分支的菌株包括了数
值分类中群 1 和群 2 的所有菌株；分支 II 可以分为
2 个 亚 分 支 （ 亚 分 支 3-4 ）， 亚 分 支 3 为
Sinorhizobium-Mesorhizobium 分支，该分支的菌株
包括数值分类群 5 和群 9 的菌株以及 Sinorhizobium
和 Mesorhizobium 属的参比菌株；分支 VIII 包括 2
个亚分支（亚分支 5-6），这 2 个分支包括数值分类
群 4（1 株）、群 7（2 株）和群 9（1 株）的菌株。
分支 III 相当于数值分类的群 8，但增加了群 6 和群
278 安 徽 农 业 大 学 学 报 2012 年

13的 4个菌株，与参比菌A. tumufaciens IAM 13129T
聚在一起。分支 IV 包括数值分类群 13 和群 14 的
菌株，与数值分类的结果部分一致。分支 V 包括数
值分类群 12 和群 13 各 1 个菌株，这 2 株菌在数值
分类中属于慢生菌群。分支 VI 包括的菌株与数值
分类中群 3 基本一致。分支 VII 包括的菌株分散在
数值分类的群 1、群 2 群 3 和群 4。分支 IX 包括的
菌株与数值分类中的群 2 基本一致。
3 讨论
从数值分类和 16S rRNA PCR-RFLP 的结果来
看，分离自大豆和野大豆等宿主根瘤的菌株有很多
是根瘤菌，但这些根瘤菌的分类地位如何，还需要
更多的试验来证实；也有的菌株没有与根瘤菌的参
比菌聚在一起，如数值分类中的群 1 所包括的菌株，
它们的分类地位有待其他实验进一步验证。
3.1 分离自大豆等宿主的根瘤菌具有复杂的共生
特性
长期以来一直认为根瘤菌分类与宿主密切相
关，从某一或某些宿主分离的根瘤菌应属同一个种，
该类宿主也只与该种根瘤菌结瘤固氮，即“宿主专一
性”。但这种传统分类依据的“互接种族”（即一种根
瘤菌只与一种或数种植物共生）关系逐渐被遗传物
质的交换重组、基因横向转移等现象的发现而否定。
根瘤菌与豆科植物共生关系的建立是细菌、植物及
环境三方相互作用的结果[8]。根瘤菌分布的多样性
不只是细菌与植物间的简单交流，更是环境因素与
自身遗传特性相互作用共进化的结果[9]。
本研究中再一次表明了根瘤菌复杂的共生特
性。从数值分类的结果看，从同一宿主分离到的根
瘤菌可以聚到不同的群里，如分离自大豆的根瘤菌，
有 4 株菌聚在慢生菌群，有 1 株与 R.leguminosarum
聚在一起（相似性达到 79%），有 1 株菌与 S.meliloti
的相似性达到 80%，有 3 株菌与 M.loti 聚在同一个
群，相似性达 84%，这个结果与以往的报道是一致
的[10]。从不同宿主分离的根瘤菌也可聚在同一群
里，如群 II 的亚群 9 是由分离自野大豆、长萼鸡眼
草鸡根瘤菌和参比菌 S.meliloti 组成的。
3.2 数值分类的结果与 16S rDNA-RFLP 结果部分
相似
分支 I、V、VI、VII、VIII 和 XI 中没有参比菌，
它们所包括的菌株与数值分类中的群 1 的菌株一
致。分支 III 中，菌株 sd01013 以 92%的相似性与
A.tumefaciens IAM13129T聚在一起，与数值分类结
果一致，因此可以初步确认它是土壤杆菌属的菌种。
分支 VI 和分支 IX 包括的菌株分别与数值分类中的
群 3 和群 2 基本一致。但是，2 种分析方法也有不
一致的地方，如分支 V 包括数值分类群 12 和群 13
各 1 个菌株，这 2 株菌在数值分类中属于慢生菌群。
两种方法结果差异主要有以下原因：首先，每
种分析方法都有其适用范围，各有优点和局限性：
数值分类对众多的表型性状进行统计学分析有优
势，16S rDNA-RFLP 则是直接依据核酸分子携带的
遗传水平信息进行分析；表型数值分类与 16S
rDNA-RFLP 遗传分析的结果若互相验证，则结论的
可靠性增强，可进一步进行 16S rDNA 序列测定分
析系统发育关系或通过 DNA-DNA 杂交定种等。其
次，由于每种分析都含有人为操作的外在因素，如
数值分类，许多性状差异都是人为判定，而某些表
型性状的出现呈过渡状态，时机掌控不好会增加结
果分析时的统计学差异；相比之下，依据基因的遗
传分析相对客观，因此近年来较为流行。但是，目
前发现并确认了遗传基因交换重组和基因横向转移
等现象，如侯卫国等人[11]通过研究结瘤基因的进化
分析，证明慢生根瘤菌的结瘤基因主要是通过直系
遗传的, 同时可能因适应宿主及环境需要进行一定
程度的平行转移。基因横向转移使研究者对遗传基
因分子标记的选择、数量以及结果的评判标准逐渐
出现分歧，又降低了遗传分析的可靠性。
3.3 分离自野大豆的根瘤菌与土壤杆菌同种
近年来，从豆科植物根瘤中分离出的一批“根
瘤菌”，分类的结果是“土壤杆菌”的现象时有发
生。韩素贞[12-13]发现从菜豆、杭子梢和决明根瘤中
分离出的 88 株根瘤菌中有 33 株与悬钩子土壤杆菌
（A.rubi）同种。在本研究中，从大豆根瘤中分离的
1 株菌与根癌土壤杆菌（A.tumeficiens IAM13129T）
聚在一起。Mhamdi 等 [14]研究了从突尼斯菜豆
（Phaseolus vulgaris）中分离到的 160 株根瘤菌，
其中有 16%属于 Agrobacterium，从它们的 DNA 中
扩增不出 nif H 和 nod C 基因片段，共生基因探针实
验得不到杂交信号，结瘤试验表明它们不能和菜豆
结 瘤 固 氮 。 对 于 这 些 现 象 ， 有 观 点 认 为
Agrobacterium 是作为伴生菌进入根瘤[15]，也有研究
报道具有 Sym 质粒的 A.rhizogenes 菌株可与
Phaseolus vulgaris 形成根瘤和瘤组织[16]。
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