全 文 ：豆链格孢菌对白车轴草生理代谢及活性氧
清除系统酶的影响 3
李　征　刘登义 3 3 　丁佳红　王育鹏
(安徽师范大学生物多样性研究中心 ,重点生物资源保护与利用研究安徽省重点实验室 ,芜湖 241000)
【摘要】　通过盆栽实验 ,研究了接种豆链格孢菌对白车轴草叶组织细胞膜透性、色素含量、丙二醛 (MDA)
含量以及超氧化物歧化酶 (SOD) 、过氧化物酶 ( POD) 和过氧化氢酶 (CA T) 活性的影响. 结果表明 ,豆链格
孢菌使白车轴草叶组织细胞膜透性上升 ,电导率显著升高 ,膜脂过氧化加强 ,MDA 水平上升 ,色素含量下
降. 电导率和 MDA 含量均与感病时间呈显著正相关 ,而色素含量与感病时间呈显著负相关. 豆链格孢菌
刺激其寄主白车轴草叶片膜脂过氧化作用发生 ,积累大量的活性氧 ,使其超出防御酶的清除能力 ,致使活
性氧清除系统遭到破坏 ,保护酶系统失衡 ,其中 SOD 和 CA T 活性显著下降 ,而 POD 活性明显上升. 接种
12 d 后 ,SOD 和 CA T 分别降低了 5512 %和 3718 % ,而 POD 比对照升高约 116 倍.
关键词 　豆链格孢菌 　白车轴草 　生理代谢 　酶活性
文章编号 　1001 - 9332 (2005) 03 - 0529 - 04 　中图分类号 　S432 　文献标识码 　A
Effects of Alterna ria azukiae on physiological metabolism and active oxygen2eliminating enzyme activities of
Trif olium repens . L I Zheng ,L IU Dengyi ,DIN G Jiahong ,WAN G Yupeng ( Provincial Key L aboratory of Con2
servation and Ex ploitation of Biological Resources , Biodiversity Research Center , A nhui Norm al U niversity ,
W uhu 241000 , China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2005 ,16 (3) :529～532.
A pot experiment was installed to study the effects of A lternaria az ukiae inoculation on the cell membrane per2
meability ,pigment and MDA contents ,and activities of SOD , POD and CA T of Trif olium repens . The results
showed that A . az ukiae infection made T . repens leaf tissue increase its cell membrane permeability ,electric
conductivity ,over2oxidation and MDA content , but decrease its pigment content . The electric conductivity and
MDA content were positively related with infection time ,whereas the pigment content was negatively related
with it . Due to the stimulation by A . az ukiae ,the over2oxidation of cell membrane was intensified ,which resulted
in a large amount of active oxygen accumulated and beyond the defense ability ,the active oxygen metabolism sys2
tem was destroyed ,and the balance of protective enzyme system was broken. After 12 days of A . az ukiae inocu2
lation ,the activities of SOD and CA T decreased by 55. 2 % and 37. 8 % ,respectively ,while the POD activity in2
creased by 1. 6 times.
Key words 　A lternaria az ukiae , Trif olium repens , Physiological metabolism , Enzyme activity.3 国家自然科学基金项目 (30470270) 、重要生物资源保护与利用研
究安徽省重点实验室基金项目、安徽省自然科学基金项目
(03043501)和教育部科学技术重点研究基金资助项目.3 3 通讯联系人. E2mail :ldy @mail. ahnu. edu. cn
2004 - 06 - 29 收稿 ,2004 - 10 - 18 接受.
1 　引 　　言
白车轴草 ( T rif oli um repens) 是豆科 (Legumi2
nosae)车轴草属的一种常见多年生草本植物 ,在世
界上分布很广 ,涉及整个亚热带、温带及亚寒带、年
降水量超过 600 mm 的地区[6 ] . 它是世界上最重要
的牧草之一. 豆链格孢菌 ( A lternaria az ukiae) 是白
车轴草上一种常见的病原真菌. 野外调查发现 ,自然
种群中真菌豆链格孢菌与其寄主白车轴草之间有着
稳定的相互作用. 环境条件适宜时 ,该菌病在白车轴
草自然种群中会普遍流行 ,对白车轴草的生长发育
造成极大的危害. 植物病原菌侵入植物体后可引起
寄主植物体内发生复杂的生理生化变化. 一般情况
下 ,病原菌的侵染常使寄主植物的光合速率下降 ,呼
吸速率上升 ,膜脂过氧化加强 ,防御酶体系发生相应
变化 ,其防御功能减弱 ,许多植物病理学家由此开始
探讨病原菌的致病机制和寄主植物的抗病机
制[7 ,9 ,11 ,14 ] . 其中许多与植物抗病性有关的酶 ,如超
氧化物歧化酶 ( SOD) 、过氧化物酶 ( POD) 和过氧化
氢酶 (CA T) 等成为研究热点[4 ,10 ,12 ,20 ] . 豆链格孢菌
侵染白车轴草叶片中有关酶系的变化规律及其与病
程的相关性 ,国内尚未见报道. 本文定期测定了白车
轴草的感病品种接种豆链格孢菌后叶片中的各种生
理指标 ,以揭示其感染豆链格孢菌后的生理生化变
化 ,为研究白车轴草对豆链格孢菌的抗病机制 ,及抗
病遗传育种提供参考.
应 用 生 态 学 报 　2005 年 3 月 　第 16 卷 　第 3 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Mar. 2005 ,16 (3)∶529～532
2 　材料与方法
211 　供试材料
供试植物白车轴草采于安徽省芜湖市神山 . 在同一繁殖
系内选取植株高度、生物量大致相同的白车轴草幼苗. 于实
验前剪取 3 cm 长的匍匐茎 (每茎保留 3 片腋芽) . 盆栽培养 1
个月后用于接种. 供试菌种为豆链格孢菌 ,从白车轴草叶片
病斑上分离纯化而得.
212 　实验设计
将豆链格孢菌的分生孢子悬浮液用叶片针刺法接种到
白车轴草 (3 叶期) 叶片上 ,以接种无菌水作为对照. 接种后
在隔离条件下培养 ,分别在接种后 3、6、9 和 12 d 取样 ,测定
不同指标变化情况 1 各处理重复 3 次.
213 　测试方法
21311 叶片细胞膜透性测定 　称取白车轴草叶片 012 g ,剪
成碎片 ,加入装有 20 ml 双蒸水的三角瓶中 ,于振荡机上以
400 r·min - 1的速度振荡 1 h. 用 DDS212 型电导仪测定电导
率 (μs·cm - 1) .
21312 叶片色素含量测定 　分别取鲜叶 012 g 加入 80 %的
丙酮研磨提取后 ,采用 752A 型分光光度计 ,分别测定 663、
645 和 440 nm 的光密度 ,计算叶绿素 a、叶绿素 b、叶绿素 (a
+ b)和类胡萝卜素含量 (mg·g - 1 FW) [2 ] .
21313 MDA 水平测定 　按陈建勋的硫代巴比妥酸 ( TBA)
法[2 ]测定 (μmol·g - 1 FW) .
21314 SOD 活性测定 　采用氮蓝四唑 (NB T) 光还原法 [22 ] ,
利用光照对 NB T 的分解抑制作用 ,酶液在 12 000 r·min - 1
冷冻离心机离心 20 min 后于 25 ℃、4 000 lx 的光照进行反
应 ,20 min 后测定 560 nm 处的光密度 ,再计算 SOD 活性 (u·
g - 1 FW·min - 1) .
21315 POD、CA T 活性测定 　采用 Proinoke 方法[16 ] (u·g - 1
FW·min - 1) .
3 　结果与讨论
311 　接种豆链格孢菌对白车轴草叶片电导率影响
由图 1 可以看出 ,白车轴草叶片外渗液电导率
随着接种豆链格孢菌时间的延长而增大 ,且两者间
　
图 1 　豆链格孢菌对白车轴草叶片电导率的影响
Fig. 1 Effect of A . az ukiae on electric conductivity of T . repens leaves.
Ⅰ1 对照 Control ; Ⅱ1 接种 Inoculation. 下同 The same below.
呈现显著的正相关性. 表明豆链格孢菌对白车轴草
叶片电导率影响明显 ,随着接种时间的延长 ,细胞膜
透性提高 ,接种 3 d、6 d、9 d 和 12 d 后 ,叶片电导率
分别是其对照的 112、115、117 和 118 倍 ,而对照组
(水)则变化不大. 可见豆链格孢菌致使白车轴草叶
片细胞膜结构改变 ,膜系统遭受损坏 ,透性增大 ,细
胞内一些可溶性物质外渗 ,以致电导率增大[4 ] .
312 　接种豆链格孢菌对白车轴草叶片色素含量的
影响
由图 2 可以看出 ,豆链格孢菌侵染使白车轴草
叶片的色素含量降低 ,光合速率减弱 ,光合效率下
降 ,不同程度地影响了能量固定及物质合成 ,改变了
其生理生态特征. 白车轴草接种豆链格孢菌后 ,叶片
叶绿素 a、叶绿素 b、叶绿素 (a + b) 和类胡萝卜含量
均呈下降趋势 ,并随接种时间的延长而递减 ,两者间
呈现显著的负相关性. 表明豆链格孢菌破坏了白车
轴草叶片中叶绿体结构和叶绿素的生物合成 ,其叶
片表现出明显的失绿变黄现象 ,且随着感病时间的
延长 ,伤害程度加重.
图 2 　豆链格孢菌对白车轴草叶片色素含量的影响
Fig. 2 Effect of A . az ukiae on leaf pigment content of T . repens .
a :叶绿素 a Chla ;b :叶绿素 b Chlb ;c :叶绿素 (a + b) Chl (a + b) ;d :类
胡萝卜素 Chlt .
313 　接种豆链格孢菌对白车轴草叶片膜脂过氧化
(MDA)含量的影响
MDA 是膜脂过氧化的主要产物 ,其浓度表示膜
035 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷
脂过氧化强度和膜系统受伤害程度 ,可作为膜脂过
氧化程度的一种指标[19 ] . MDA 含量升高的幅度反
映其寄主膜系统受到破坏的程度和膜脂过氧化水平
的高低. 由图 3 可以看出 ,接种豆链格孢菌后 ,白车
轴草的 MDA 含量呈上升趋势 ,且随着感病时间的
延长而不断增加 ,呈现极显著正相关性. 表明豆链格
孢菌对白车轴草的侵染 ,使植物体内的 MDA 大量
积累 ,膜脂过氧化水平升高. 且随着侵染时间的延
长 ,严重地破坏了白车轴草叶片细胞膜的结构和生
理完整性 ,膜的透性增加 ,膜结构受损伤程度加大 ,
细胞内物质的外渗日益加重 , 使作物抗逆性减
弱[8 ] .
314 　接种豆链格孢菌对白车轴草叶片 SOD、POD
和 CA T 活性影响
病原菌的侵入 ,使其寄主植物体内产生超氧阴
离子自由基 (O -·2 ) ,并由此产生其它活性氧化合物 ,
如 H2O2 ,OH - 等. 这些活性氧化合物对植物产生很
大的伤害作用[23 ] . 植物可以通过活性氧清除系统清
除活性氧 ,以防御活性氧化合物的毒害作用[1 ,5 ,21 ] .
SOD、POD 和 CA T 共同组成了植物体内一个有效
的活性氧清除系统. 三者共同作用 ,能有效地清除植
物体内的自由基和过氧化物 [3 ] . 在一定范围内 ,
图 3 　豆链格孢菌对白车轴草 MDA 含量及 SOD、POD 和 CAT 酶活
性的影响
Fig. 3 Effect of A . az ukiae on the MDA content and the activity of
SOD ,POD ,CAT in T . repens .
SOD、CA T 共同作用能把 O -·2 和 H2O2 转化为 H2O
和 O2 ,并能减少具高活性和毒性的·OH 的形成 ,
POD 和 CA T 则可催化 H2O2 形成 H2O ,从而有效地
阻止 O -·2 和 H2O2 的积累 ,限制这些自由基对膜脂
过氧化的启动[13 ,15 ,17 ,18 ] ,以及启动后的加强作用.
　　由图 3 可见 ,接种豆链格孢菌后 ,白车轴草体内
活性氧清除系统遭到破坏. 对照组的 SOD 活性相对
稳定 ,接种豆链格孢菌后的白车轴草叶片 SOD 活性
都较对照有所下降 ,呈现极显著的负相关性. 白车轴
草叶片中的 POD 活性上升 ,随着感病时间的延长 ,
开始时加速增加 ,后趋于稳定 ,两者呈正相关性. 接
种 12 d 后 ,POD 活性约是对照的 116 倍 ,而对照组
无明显变化. 而白车轴草叶片中 CA T 活性开始时较
对照降低 ,并随感病时间的延长 ,CA T 活性迅速下
降 ,呈现显著的负相关性. 接种豆链格孢菌 12 d 后 ,
CA T 活性比对照降低了 3718 %. 表明接种豆链格孢
菌后 ,白车轴草叶片的 SOD、CA T 活性下降 , POD
活性上升 ,且随着感病时间的延长 ,白车轴草体内活
性氧清除系统中 SOD、CA T 和 POD 与过氧化物产
生之间的平衡遭到严重破坏 ,不能有效地阻止 O -·2
和 H2O2 的积累 ,从而影响植物体的正常生长代谢 ,
细胞受到伤害 ,最终表现出肉眼可见的受害症状.
4 　结 　　论
411 　豆链格孢菌侵染使白车轴草体内活性氧清除
系统遭到破坏 ,造成 MDA 高度积累 ,细胞膜透性增
大 ,大量电解质外渗 ,且随处理时间的延长而更加突
出 ,致使白车轴草叶片细胞内酶及原代谢作用区域
受到破坏 ,加速组织、细胞的衰老 ,引起白车轴草叶
片褪绿 ,色素含量下降 ,降低其光合作用水平.
412 　寄主植物与病原真菌相互作用过程中 ,寄主可
以产生许多种类的活性氧 ,在正常状态下 ,由于植物
体内防御酶 (如 SOD、POD、CA T 等) 活性氧清除系
统的存在 ,使活性氧代谢处于低水平动态平衡中. 但
病原菌侵染后 ,被侵染组织活性氧 (如 O -·2 、H2O2 、
·OH)猝发. 如果活性氧的积累速率大于清除速率 ,
会导致寄主植物出现伤害. 因为它可诱导寄主植物
植保素的合成 ,导致膜脂过氧化和过敏性细胞死亡
( HR) 反应. SOD、POD 和 CA T 是寄主植物体内清
除活性氧的主要酶类 ,其活性可以间接地反映植物
体内的活性氧代谢水平及其变化. 在白车轴草接种
豆链格孢菌后 ,病原物刺激膜脂过氧化作用发生 ,产
生大量的活性氧. 而积累的活性氧已经超出防御酶
1353 期 　　　　　　　　　李 　征等 :豆链格孢菌对白车轴草生理代谢及活性氧清除系统酶的影响 　　　　　　　　　　　
的清除能力 ,对细胞组成的有机大分子造成伤害 ,扰
乱了白车轴草体内的代谢平衡 ,使寄主酶防御体系
失去了作用 ,不能有效地清除体内产生的活性氧 ,导
致细胞死亡 ,从而表现出典型症状.
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作者简介 　李 　征 ,女 ,1979 年生 ,硕士生. 主要从事种群生
态学研究. E2mail :jean0626 @163. com
235 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷