全 文 ：渤海红鳍东方豚体内产毒细菌的微生态分布
及 B3B菌株的生物学特性*
范延辉1, 2 胡江春1* * 马成新1 薛德林1 刘 丽1 李延茂1 王书锦1 张荣庆3
( 1 中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳 110016; 2中国科学院研究生院,北京 100039; 3 清华大学, 北京 100084)
摘要 对我国渤海红鳍东方豚( Fugu rubr ip es )体内产毒细菌的微生态分布进行了考察. 结果表明, 渤海
红鳍东方豚体内的各部位都普遍存在着产毒细菌,从其卵巢、肝脏等组织中分离到了 19 株可产强毒的菌
株, 对其中B3B 菌株进行进一步研究鉴定, 生理生化试验及 16SrDNA序列测定结果表明,该菌属于芽孢杆
菌属( Bacillus ) . 同时,对其发酵产物进行分离精制后,通过小鼠试验、薄层层析试验及质谱分析, 初步认定
发酵产物中含有河豚毒素( T etrodotox in, TTX) .
关键词 红鳍东方豚 微生态 发酵产物 河豚毒素
文章编号 1001- 9332( 2005) 10- 1952- 04 中图分类号 Q938. 2 文献标识码 A
Microecological distribution of toxinproducing bacteria in Fugu rubripes in Bohai Sea and biological charac
teristics of B3B. FAN Yanhui1, 2 , HU Jiangchun1 , MA Chengx in1 , XUE Delin1, L IU L i1 , L I Yanmao1 , WANG
Shujin1, ZHANG Rongqing 3 ( 1I nstitute of App lied Ecology , Chinese A cademy of Sciences , Shenyang 110016,
China ; 2Graduated School of Chinese A cademy of Sciences , Beij ing 100039, China; 3 T singhua Univer sity , Bei
j ing 100084, China) . Chin. J . A pp l . Ecol . , 2005, 16( 10) : 1952~ 1955.
The study show ed that tox inproducing bacteria w er e commonly ex isted in each part of Fugu rubr ip es body . 19
strains of high poisonous bacteria were isolated from its ovary , liver and other tissues, among which, strain B3B
was identified as genus Bacillus based on its physio logical and biochemical characteristics and 16SrDNA se
quence, and could produce tetrodotox in through mouse test, thinner chr omatog raphy, and mass spectrogr aphy.
Key words Fugu rubr ip es , M icroeco logy, Fermentation products, T etrodo to xin.
* 国家! 863∀计划资助项目( 2002AA625020) .
* * 通讯联系人.
2004- 12- 10收稿, 2005- 03- 18接受.
1 引 言
河豚鱼( Sw ellfish) , 又名 、吹肚鱼、气泡鱼及
台巴鱼.在我国主要分布于渤海、东海、黄海及江河
下游,为近海与河川底层肉食性有毒鱼类.河豚鱼肉
味鲜美, 营养丰富, 每百克肉中蛋白质含量高达
187 g,而脂肪含量仅为 026 g[ 15] , 是传统美食中
的精品,爱食者众多.但其体内,尤其是卵巢和肝脏,
含有剧毒物质, 烹饪稍有不慎,便会引起中毒, 使进
食者肢体麻木、瘫痪、甚至死亡. 1909 年 Tahara 从
河豚鱼中分离到了纯度为 2 %的粗毒素, 并将其命
名为河豚毒素( Tet rodotoxin, T TX) [ 2] ,其结构也于
1964年被确定,其分子式为 C11H17N3O8, 相对分子
量为 31927.
河豚毒素是一种剧毒的非蛋白天然毒素, 它能
选择性的与细胞膜表面 Na+ 通道上的蛋白质受体
结合,阻断 Na+ 内流,从而抑制神经冲动的传导[ 10] .
其毒性是氰化钠的 1 250倍[ 15] , 1 g 足以致 500 人
死亡. 河豚毒素虽能致人死亡, 但药用价值异常珍
贵,能降血压、抗心率失常、缓解痉挛,可用于治疗神
经痛,抑制癌症剧痛,还是理想的麻醉药品,其麻醉
强度是普鲁卡因的 3 398倍,尤为神奇的是, 它对戒
毒效果极佳,且没有副作用, 用后不上瘾. 由于它能
特异性阻断钠离子通道,在生理研究上,已成为神经
细胞膜研究必不可少的工具性标准药物, 目前河豚
毒素的国际市场售价每克高达 20万美元.
河豚毒素不仅存在于河豚鱼体内, 而且在其它
多种海洋脊椎动物、无脊椎动物及海底沉积物中也
广泛存在[ 6] , 因此, 有许多学者认为河豚毒素是由
动物体内的共生细菌所产生[ 1, 6] . 近年来有许多国
外实验小组报道, 他们已分离到了能产河豚毒素的
海洋细菌[ 4, 5, 8, 9, 11, 12] , 初步证实了 TTX 的微生物
起源学说.本文对我国渤海红鳍东方豚体内产毒细
菌的微生态分布[ 7]作了研究,共分离到了 34株产毒
细菌,对其中毒性较强的 B3B菌株进行了生物学特
性研究及其 16SrDNA序列分析,同时对其发酵产物
进行了生物检测、薄层层析试验及其质谱检测, 初步
应 用 生 态 学 报 2005 年 10 月 第 16 卷 第 10 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Oct. 2005, 16( 10)#1952~ 1955
认定其发酵产物中含有 TTX.
2 材料与方法
21 实验材料
211 红鳍东方豚 捕自黄、渤海营口海域; TTX 标准品购
于大连瑞芳生物有限公司;昆明小鼠( 18~ 20 g ) 购于沈阳药
科大学.
212 培养基 培养基有 Zobell 2216E 培养基;改良淀粉培
养基;改良伊莫松培养基[ 14] .
22 实验方法
221 细菌的微生态分布 将采集到的红鳍东方豚样品, 在
实验室中用无菌操作技术迅速处理, 按照一种专利(中国专
利,申请号: 03133530 6)方法分离纯化产 TTX 的微生物, 共
获得 100株, 其中卵巢、肝脏、血腺、胆囊、肠各 20 株. 将分离
纯化后菌株分别挑取 2~ 3 环接种于发酵培养基中( 100 ml/
500 ml) , 28 ∃ 180 rpm, 发酵 48 h. 发酵液加热浓缩 20 倍
后,取 1 ml对小鼠腹腔注射.
222 B3B的形态特征、培养特征及生理生化特性检测 参
照常见细菌的分类鉴定手册[ 3]中的方法进行.
223 海洋细菌 B3B 16SrDNA 分子生物学特征鉴定从细
菌中提取 DNA, 采 用通 用引物 ( Universal primers ) 对
16SrDNA 进行 PCR 扩增 正向 引物序 列为 27f: 5%
GAGAGTT TGATCCTGGCTCAG3%, 反 向 引 物 序 列 为
1495r : 5%CTACGGCTACCT TGTTGTTACGA3%. PCR 产物
经纯化后嵌入 GEMT easy vector 进行测序 , 将纯化后的
16SrDNA输入 Gene Bank 进行序列对比.
224 海洋细菌 B3B 产毒活性物质 ( TTX )的测定 将 10 L
自动式发酵罐发酵的 B3B 菌株的发酵液, 按专利 (中国专
利,申请号: 03137618 5)方法提取制备.
1)生物检测法:将 B3B 发酵提取所得样品用 01%的醋
酸溶解后,取 1 ml对 20 g左右的昆明小鼠腹腔注射,观察其
症状.同时注射 1 ml 0 1%的醋酸水溶液做为对照实验.
2)薄层层析法( TLC) :参照文献[ 13]进行,展开剂为吡啶
乙酸乙酯冰醋酸水( 15#5#3#4) , 展开前, 让展开剂预先平
衡层析缸 5~ 10 min 将 TT X 标准溶液与提取精制的 B3B
发酵产物点到HSB 硅胶板上,于上述展开剂中展开, 展距在
150 mm 左右 把展开后挥去溶剂的薄层析板浸入 3 mol&
L - 1的 KOH 溶液中数秒钟, 取出, 吹干后, 110 ∃ 加热 5~ 10
min, 在 365 nm 激发光下观察荧光, 通过比移值来定性.
3 结果与分析
31 红鳍东方豚体内产毒细菌的微生态分布
从表 1可以看出,渤海红鳍东方豚体内的各部
位普遍存在着产毒细菌, 其中有 34株菌的发酵液粗
提物可使昆明小鼠出现中毒症状, 其中 RG3B、
THB306、3BB、6B、7B、B3B等 19株菌株有较强的毒
性,注射后仅 6 min 小鼠便死亡.而且这些细菌主要
存在于卵巢和肝脏中, 卵巢中最多. 众所周知,河豚
鱼卵巢和肝脏含有剧毒的河豚毒素, 上述产毒细菌
很可能就是河豚毒素( T TX)的微生物源. 为此, 我
们对其中一株产毒较强的 B3B 细菌进行了进一步
分离纯化, 并对其生物学特性及产 TT X 的情况进
行了研究,其它菌株拟在今后另行研究.
32 海洋细菌 B3B 的形态特征、培养特征及生理
生化特性
海洋细菌 B3B 菌株在培养基上生长的幼培养
菌落为透明状, 直径 2~ 4 mm ,表面湿润光滑,边缘
不规则;老培养菌落变为肉色或略棕色,不透明, 菌
落不扩散.菌体细胞为较长的杆状, 周生鞭毛,有芽
孢,芽孢中生,不膨大. B3B 的生理生化特性结果如
表 2所示.
表 1 红鳍东方豚体内产毒细菌的微生态分布
Table 1 Distribution of toxinproducting bacteria in different body
parts of Rugu rubr ipes
样品部位
Samples
分离株数
No isolates 不同毒性株数St rains number
无毒
None
弱毒
Weak
强毒
High
卵巢 Ovary 20 2 6 12
肝脏 Liver 20 9 5 6
血腺H emogland 20 17 2 1
胆囊 Gallbladder 20 19 1 0
肠 Intestine 20 19 1 0
表 2 海洋细菌 B3B的生理生化特性
Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain B3B
项目 Item 结果Result
硝酸盐还原 Nit rate revivif icat ion +
淀粉水解 Amylolysis -
明胶液化 Glut in liquefacient -
柠檬酸盐利用 Cit rate using -
生长试验 Growth test 3% NaCl +
5% NaCl +
7% NaCl -
01%酚 01% phenol -
001% NaN3 -
pH 3 -
pH 4 -
pH 5 +
pH 6 +
pH 7 +
pH 8 +
pH 9 +
碳原利用 Carbon use 半乳糖 Galactose +
果糖 Fructose +葡萄糖 Glucose +
蔗糖 Sucrose +
甘露糖 Mannose -
鼠李糖 Rhamnose -
棉子糖 Raff inose -乳糖 Lactose -
阿拉伯糖 Arabinose -
木糖 Xylose -
肌醇 Inositol +
甘露醇 Mannitol +
乙酸钠 Sodium acetateo +丙二酸钠 Sodium malonic +
琥珀酸钠 Sodium disuccinate -
苹果酸钠 Sodium malate +
土温 80 Tw een 80 +
+ 生长 Growth; - 不生长 No grow th.
195310 期 范延辉等: 渤海红鳍东方豚体内产毒细菌的微生态分布及 B3B 菌株的生物学特性
GAGAGTT TGATCCTGGCT CA GGACGAACGCT GGCGGCGT G
CCT AATACATGCAAGTCGAG CGAACAGAAAAGGAGCTTGC
T CCTTT GACGTT AGCGGCGG ACGGGTGAGT AACACGTGGG
CAACCTACCCTATAGTTT GG GATAACTCCGGGAAACCGGG
GCTAATACCGAATAAT CTCT T TTGCTTCATGGTGAAAGAC
T GAAAGACGGTTT CGGCTGT CGCTATAGGATGGGCCCGCG
GCGCATTAGCT AGTTGGT GA GGTAACGGCTCACCAAGGCG
ACGATGCGTAGCCGACCTGA GAGGGTGAT CGGCCACACT G
GGACTGAGACACGGCCCAGA CTCCTACGGGAGGCAGCAGT
AGGGAAT CTTCCACAAT GGG CGAAAGCCT GATGGAGCAAC
GCCGCGTGAGTGAAGAAGGT TT TCGGATCGT AAAACT CTG
T TGTAAGGGAAGAACAAGTA CAGTAGTAACTGGCT GT ACC
T TGACGGTACCTTATTAGAA AGCCACGGCTAACTACGTGC
CAGCAGCCGCGGTAATACGT AGGTGGCAAGCGTT GT CCGG
AAT TAT TGGGCGTAAAGCGC GCGCAGGCGGTCCT TTAAGT
CT GATGTGAAAGCCCACGGC T CAACCGTGGAGGGT CATT G
GAAACT GGGGGACTTAAGTG CAGAAGAGGAAAGTGGAAT T
CCAAGTGTAGCGGTGAAATG CGT AGAGATT TGGAGGAACA
CCAGT GGCGAAGGCGACTT T CTGGT CTGT AACTGACGCT G
AGGCGCGAAAGCGT GGGGAG CAAACAGGATTAGATACCCT
GGT AGTCCACGCCGT AAACG ATGAGTGCT AAGT GTT AGGG
GGT TTCCGCCCCTTAGT GCT GCAGCTAACGCATTAAGCAC
T CCGCCTGGGGAGT ACGGT C GCAAGACTGAAACCCAAAGG
AAT TGACGGGGGCCCGCACA AGCGGTGGAGCAT GT GGTTT
AAT TCGAAGCAACGCGAAGA ACCTTACCAGGT CT TGACAT
CCCGTTGACCACTGTAGAGA TATAGT TTCCCCTT CGGGGG
CAACGGT GACAGGTGGT GCA TGGTT GTCGTCAGCT CGTGT
CGTGAGATGTT GGGT TAAGT CCCGCAACGAGCGCAACCCT
T GATCTT AGTTGCCATCATT T AGTTGGGCACT CTAAGGTG
ACTGCCGGTGACAAACCGGA GGAAGGT GGGGAT GACGTCA
AAT CATCATGCCCCT TAT GA CCTGGGCT ACACACGTGCT A
CAAT GGACGATACAAACGGT T GCCAACTCGCGAGAGGGAG
CT AATCCGATAAAGTCGTTC T CAGTTCGGATTGTAGGCTC
CAACT CGCCTACATGAAGCC GGAATCGCTAGTAAT CGCGG
ATCAGCAT GCCGCGGTGAAT ACGTTCCCGGGCCTTGTACA
CACCGCCCGTCACACCAGGA GAGTT TGT AACACCCGAAGT
CGGT GAGGTAACCTT TTGGA GCCAGCCGCCGAAGGTGGGA
T AGATGAT TGGGGT GAAGTC
图 1 B3B细菌菌株 16SrDNA 全序列
Fig. 1 16S rDNA sequence of marine bacteria B3B.
33 分子生物学鉴定
16SrDNA是属种鉴定的分子基础, 是细菌系统
分类研究中常用分子指标. 海洋细菌 B3B 的
16SrDNA 测序后 ( 图 1) , 将所得序列输入 Gene
Bank 以 BLAST 程序进行比较分析, 发现它同
Bacillus f usif ormis 的同源性高达 9861% ,但进一
步研究发现它们的 DNA杂交百分率仅为 6412%,
差异显著.因此, B3B 暂定为芽孢杆菌,是否为新种
有待进一步研究确定.
34 海洋细菌 B3B产毒活性物质( T TX)
小鼠生物试验表明,腹腔注射发酵精制物后,小
鼠均呈现中毒症状:刚开始时小鼠变得平静,稍后便
兴奋不安,伴有步态失常,后肢无力, 呼吸困难, 最后
惊厥蹬腿而死, 与文献报道中的症状很吻合[ 12] . 而
小鼠对 01%的醋酸则无明显症状, 结果如表 3所
示.
表 3 生物检测法结果
Table 3 Resul t of mouse test
项目
I tem
个体数
Individual
平均重量
Average
weight( g)
死亡率
Mortality
( % )
平均死亡时间
Mean lethal
t ime( min)
T TX 10 201 ∋ 0 5 100 146 ∋ 0 5*
B3B 10 203 ∋ 0 6 80 178 ∋ 0 7*
01%醋酸 10 199 ∋ 0 4 0 -
01% acet ic acid
* P< 005.
在薄层层析试验中河豚毒素的标准品在比移值
为 072处有明亮的荧光斑点,提取精制后的海洋细
菌 B3B的发酵产物在相同比移值处也可以看到荧
光斑点, 由此推测 B3B菌株发酵产物中含有河豚毒
素.
从生物检测和薄层层析结果来看, 海洋细菌 B3B
的发酵产物中很可能含有 TTX,为了进一步验证,我
们又对样品进行了质谱检测,结果如图2所示.从图 2
可知, B3B的发酵产物中含有加H 后核质比( m/ z)为
3201的物质,它与 TTX的分子量相同.
图 2 样品的质谱图
Fig. 2 Mass spect rography of sample.
1954 应 用 生 态 学 报 16 卷
4 结 论
41 对渤海红鳍东方豚体内产毒细菌的微生态分
布进行考察,结果表明,其各部位普遍存在着产毒细
菌,其中卵巢内的产强毒的菌数最多, 占强产毒菌数
的 632%.
42 对海洋细菌 B3B 进行了形态特征、培养基特
征及 16SrDNA 测序分析表明, 海洋细菌 B3B属于芽
孢杆菌属, 但由于在其它方面的特异性,可能是一新
种,需进一步研究确认.
43 通过小鼠生物试验、薄层层析及质谱检测, 初
步推断海洋细菌 B3B 发酵产物中存在河豚毒素
( TTX) ,为河豚毒素的微生物起源学说及其今后微
生物源 TTX的研发提供了科学依据.
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作者简介 范延辉, 男, 1980 年生, 硕士研究生. 主要从事微
生物研究工作. Email: y anhuifan@163. com
195510 期 范延辉等: 渤海红鳍东方豚体内产毒细菌的微生态分布及 B3B 菌株的生物学特性