全 文 ：长白山赤杨丛枝菌根真菌多样性的半巢式
LPPCRSSCP检测分析*
李一叶 何兴元* * 张忠泽 张成刚
(中国科学院沈阳应用生态研究所, 沈阳 110016)
摘要 利用半巢式 LPPCRSSCP技术, 对中国吉林长白山不同海拔生境下 3 种赤杨共生丛枝菌根真菌
的多样性进行检测分析. 结果表明,该地区赤杨属东北赤杨、西伯利亚赤杨及色赤杨共生丛枝菌根真菌在
科乃至种的水平上并未随宿主的变化表现出丰富的多样性; 3 个树种在自身属的水平上与共生的球囊霉
科( G lomaceae)至少 1 种 AMF, 即 G . intraradix ,在种的水平上表现出不相关于宿主海拔高度的某种相互
选择性.
关键词 赤杨 丛枝菌根真菌 半巢式 LP PCRSSCP
文章编号 1001- 9332( 2003) 11- 1837- 05 中图分类号 Q949. 32 文献标识码 A
Seminested LPPCR SSCP identification of arbuscular endomycorrhizal fungi diversity of Alnus at Changbai
Mountain. L I Y iye, HE Xingyuan, ZHANG Zhongze, ZHANG Chenggang ( I nstitute of A pp lied Ecology ,
Chinese A cademy of Sciences , Shenyang 110016) . Chin . J . A pp l. Ecol . , 2003, 14( 11) : 1837~ 1841.
The diversity of arbuscular endomycorrhizal fung i colonized on t hree species of A l nus at Changbai Mountain was
identified based on coupling the sensitivity of seminested LPPCR and the specificity afforded by Single Strand
Conformation Polymorphism analysis. It is suggested that altitudes and species of A lnus were not the impo rtant
factors deciding the distribution of AMF in the gr ade of family, and t here w as at least one species of Glomaceae,
Glomus intraradix , dominated in A lnus at Changbai Mountain.
Key words A lnus, Arbuscular endomycor rhizal fungi, Seminested LPPCRSSCP
* 国家重点基础研究发展规划项目( 001CB1089) 和中国科学院长白
山森林生态系统定位研究站基金资助项目.
* * 通讯联系人.
2003- 04- 23收稿, 2003- 06- 16接受.
1 引 言
丛枝菌根真菌( arbuscular endomycorrhizal fun
g i, AMF)是自然生态系统中广泛分布的一类内生菌
根真菌, 对植物的生存与生长起着重要的促进作
用[ 15, 21] , . AM F 多样性研究除了在农、林、园艺等生
产方面具有重要的经济价值外,在濒危植物保护、植
被恢复、生物多样性保护及生态系统稳定性提高等
方面也具有积极意义[ 2, 4, 6, 12] .丛枝菌根真菌的 18s
rRNA 小亚基( SSU)可变区域经研究被确认具有丰
富的系统进化信息[ 8, 10, 11, 14, 17] , 作为靶位点已设计
出一系列特异性引物[ 1, 7, 13, 18, 19] . 本研究利用特异
性 PCR 结合单链构象多态性分析技术 ( sing le
st randed conformat ion polymorphism, SSCP) ,对长白
山 3种赤杨共生 AMF 在种水平上的多样性进行检
测分析,旨在为该项资源的合理有效利用提供科学
依据.
2 材料与方法
21 供试材料
研究材料为中国吉林长白山不同海拔条件下 3 种赤杨
( A lnus)的丛枝菌根(表 1) , 外形与正常赤杨根系无明显区
别(图 1) .部分样品风干后低温保存. 另取部分新鲜根样保
存于 FAA固定液中[ 20] ,留做镜检用.
2 2 根样镜检
碱解离酸性品红染色法[ 3] : 将固定的根样冲洗干净, 于
10% ( w / v) KOH 溶液中 90 ! 恒温解离 2~ 3 h.冷却并冲洗
后, 将根段用解剖刀切成约 5 ∀ 10- 3 m 长的小段, 滴加数滴
表 1 实验样品
Table 1 Sample tested
编号
Number
种名
Species
海拔
Altitude( m)
D1 A lnus mand shu rica 1) 2 023
D2 A . mandshu rica 1 922
D3 A . mandshu rica 1 707
D4 A . mandshu rica 1 274
X1 A . sibiri ca2) 1 262
X2 A . sibiri ca 1 262
X3 A . sibiri ca 1 045
X4 A . sibiri ca 755
S1 A . t inctoria3) 1 707
S2 A . t inctoria 1 038
S3 A . t inctoria 748
1)东北赤杨, 2)西伯利亚赤杨, 3)色赤杨.
应 用 生 态 学 报 2003年 11 月 第 14 卷 第 11 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY , Nov . 2003, 14( 11)#1837~ 1841
图 1 中国长白山赤杨丛枝菌根
Fig. 1 Alnus AM of China Changbai Mountain.
用乳酸甘油配制的 0. 5%的酸性品红, 于酒精灯上加热到发
浓烟.稍冷却后, 用乳酸甘油脱色,直至不见红色液体流下为
止.然后压片观察( Panasonic WVCP460/ G) .
23 DNA 的提取纯化
采用改进的 CTAB 法: 取 10~ 50 mg 冻存样品,清洗并
经 30%过氧化氢表面消毒后,用液氮充分研磨.加入 1000l
CTAB 提取液( 2% CTAB [ w/ v ] , 0. 1 mol∃L - 1 T ris∃Cl [ pH
8. 0] , 0. 02 mol∃L - 1EDTA [ pH 8. 0] , 1. 4 mol∃L - 1 NaCl,
2% PVP[ w/ v ] ) ,置于 65 ! 温育 0. 5 h.用等体积氯仿: 异戊
醇( 24: 1, v/ v )抽提两次, 取水相, 加入 1/ 10 体积的 3 mol∃
L
- 1醋酸钠及 2 倍体积的冰乙醇, 于- 20 ! 静置 30 min.
DNA 沉淀用 70% 冰乙醇洗涤 3 次. 室温自然干燥后, 加入
25l去离子水溶解, 纯化 ( Gel Ex traction M ini K it, Watson
Biotechno logies, Inc )保存.
24 半巢式 LPPCR
利用 AMF 特异性引物 VANS1VANS22( TaKaRa 公司
合成) , 以各样本纯化 DNA 为模板,进行半巢式 PCR 的第一
轮扩增.将引物 VANS1 的 5%末端用 FAM 进行荧光标记后,
分别结合 3 个 AMF 科特异性引物, 即利用引物对 FAM
VANS1VAGLO、FAMVANS1VAACAU 及 FAMVANS1VAGI
GA(上海生工合成)进行第二轮半巢式 LPPCR扩增(表 2) .
扩增体系及循环条件[ 20] : 50 l反应体系中,模板 DNA 1 ∀
10- 8~ 1∀ 10- 7 kg , MgCl2 1. 5 ∀ 10- 3 mol∃L - 1, 4 ∀ dNTP 3
∀ 10- 4 mol∃L- 1 ,引物各 5 ∀ 10- 7 mol∃L - 1, rTaq DNA 聚合
酶( T aKaRa公司) 2U . 95 ! 预变性 2 min 后, 按94 ! 变性 60
s& 50 ! 退火 45 s& 72 ! 延伸 60 s 扩增 35 个循环,最后 72
! 延伸10 min ( DNA T Gradient, Whatman, Co . ) .取 3l扩
增产物,在 2%琼脂糖凝胶中进行电泳检测.
25 对照实验
以相同方法提取各赤杨宿主及其共生 F rankia的 DNA
表 2 引物序列
Table 2 Primer sequences
引物
Primer
分类学特异性
Speci fic ity
序列
Sequence
VANS1 球囊霉目Glomales 5∋ GT CT AG TAT AAT CGT T AT ACA GG 3∋
VANS22 球囊霉目Glomales 5%TAA ACA CT CT AA T TT T TT CAA 3%
VAGLO 球囊霉科Glomaceae 5∋ CAA GGG AAT CGG TT G CCC GAT 3∋
VAACAU 无梗囊霉科 Acaulospo race 5∋ TGA TT CACC AAT GGG AAA CCC C3∋
VAGIGA 巨孢囊霉科 Gigasporaceae 5∋ TCA CCA AGG GAA GCC CGA AGG 3∋
作为模板, 用前述引物进行 PCR扩增.
2 6 荧光 SSCP
荧光标记的 PCR 纯化产物于上 样缓冲液 ( ABI
PRISM TM) 中稀释, 并加入内标 ( GENESCAN500TM ROX,
ABI PRISM TM ) . 95 ! 变性 5 min, 冰浴冷却. 5%非变性聚丙
烯酰胺凝胶, 每孔上样量 1. 5 l.以 1 ∀ TBE 电泳缓冲液, 在
恒压 3000 V、恒温 30 (C 条件下电泳 4 h ( 377 DNA Se
quancer, ABI PRISM TM ) . 所得数据利用片段处理软件
( GeneScan R3. 1, ABI PRISMTM)进行分析, 该软件可保证
各道间的标准迁移.
3 结果与分析
31 根样镜检
每个样品观察 50个以上小根段.只要有一个小
根段的皮层细胞内发现有丛枝或泡囊, 则认为根样
中侵染有AMF;若只观察到菌丝圈或菌丝而无上述
两种结构,则认为根样中可能侵染有 AMF; 既无菌
丝圈或菌丝, 也无丛枝或泡囊, 则认为根样未被
AMF侵染(图2) .结果表明,所有抽检样品均可观
图 2 AMF 在赤杨根组织中的形态
Fig. 2 Morphology of AMF in th e root t issue( ∀ 400, V根内泡囊 Var
buscule) .
察到泡囊和丛枝这两种结构中的至少 1种,说明本
实验 PCR模板中确实含有 AMF 的遗传物质.
32 科特异性扩增
为准确而全面地检测环境样品的实际情况, 采
1838 应 用 生 态 学 报 14卷
集中国吉林长白山的 3 个赤杨优势树种 ( Alnus
mandshur ica、A . sibir ica 及 A . tinctoria)作为宿主
树种[ 5] , 并按其自然生长的海拔梯度分成不同的组
进行研究. 这样既可以保证同种宿主分别具有一定
的海拔梯度,又可以做到异种宿主也包含有近似的
海拔高度,便于从纵横两方面综合比较考察.
经琼脂糖电泳检测,采用rTaq DNA Polymerase
及上述 PCR条件,所有引物都扩增了一些本来预计
不会成为该引物有效模板的片段(图 3a、b) . 利用提
高退火温度来增强特异性的尝试没有成功. 在同样
的温度范围内, VentRR DNA Polymerase则表现出较
强的特异性.在这些条件下,于 3个不同的扩增反应
中结合观察一条单独的扩增片段的存在与缺失, 仍
然可以判断哪个科的特异性引物扩增了目的模板.
依此得到扩增结果(表 3) : 所有样品 PCR产物中唯
一的单独扩增片段均扩增自引物 VAGLO, 即所有
样品中的 AMF 均属于 Glomaceae, 说明长白山 3 种
赤杨对与其共生的 AMF 表现出很强的选择特异
性,即主要与 Glomaceae的 AMF 优势共生; 但宿主
的种属类别及海拔条件对 AMF 在科水平上的分布
并无明显影响.
33 对照实验
以相同方法提取各赤杨宿主及其共生 Frankia
的 DNA 进行平行检测, 结果未得到 PCR产物;而采
用丛枝菌根的环境样品所做的扩增, 则得到了约
190 bp长的片段.这些对照实验的结果有力地证明
图 3 AMF科特异性扩增琼脂糖电泳检测图谱
Fig. 3 Agarose gel elect rophoresis of family specific PCR.
每相邻的 3条泳道依次显示为同一个样品分别经特异性引物 VA
GLO、VAACAU 和 VAGIGA 扩增所得的 3种 PCR 产物 Every th ree
lanes bordered up are products of the same sample amplif ied with
primers VAGLO, VAACAU and VAGIGA in turn.
表 3 科特异性扩增结果
Table 3 Resul ts of familyspeci fic PCR ampli fication
编号
No.
VAGLOVAACAUVAGIGA 编号
No.
VAGLOVAACAUVAGIGA
D1 + - - X3 + - -
D2 + - - X4 + - -
D3 + - - S1 + - -
D4 + - - S2 + - -
X1 + - S3 + - -
X2 + - -
+ ( - )表示此引物有(无)该科特异性PCR产物 Express t his primer had ( no t)
the useful fam ilyspecific PCR amplification productions.
了该系列引物的确具有可靠的 AMF 特异性.
34 种间差异的 SSCP 分析
大量来自AMF SSU 核基因编码序列的研究证
明[ 1, 7, 10, 11, 13, 17] , VANS1 下游约 190 bp 的小区段
具有显著的科间多态性, 科内各种间仅有几个碱基
的替换而无种内差异. 因此, 该区域大小相似、组成
不同的各 PCR产物经 SSCP 所表现出的迁移差异
就反映了AMF 在种水平上的差异.
本文中该技术用于分析扩增自 Glomaceae特异
性引物 VAGLO的片段(图 4a、b) .在半巢式 PCR第
二轮反应中使用一个荧光标记引物, 使产物的一条
图 4 SSCP 电泳图谱
Fig. 4 SSCP analysis w ith VANS1VAGLO.
183911 期 李一叶等: 长白山赤杨丛枝菌根真菌多样性的半巢式 LPPCRSSCP检测分析
单链在扩增过程中得到标记. 经琼脂糖电泳检测, 全
部 11个样品均得到重复性及特异性均较好的 PCR
产物,没有过强的拖尾,符合进行进一步 SSCP 分析
的要求.
扩增片段变性处理成单链后,在一台可即时观
察荧光分子的自动序列仪上进行非变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳.每个样品中均加入荧光标记标准品,以精
确比较 11条胶道中任意两条目的片段的迁移.经软
件处理,将各样品的迁移标准化,以消除非构象因素
带来的影响(图 4a、b,表 4) .
图谱显示, 除 D2与 S2 为单峰外,其余 PCR 产
物均出现双峰, 说明大多数样品中含有AMF球囊
霉科两个不同种的菌体. 各样品内两峰峰高大体相
近,提示两种真菌的含量相差不大,没有明显优势差
异.但 D2与 S2的单峰也表现出其中一种 AMF 侵
染的优势,以及另一种AMF 侵染的相对不确定性.
数据处理显示, 各样品间,前后两峰迁移的变化
跨度相同( 2485- 2478= 2496- 2489= 7) ; 而各样
品内,前后两峰的标准化迁移距离之差也相同( 2489
- 2478= 2494- 2483= ))= 11) . 初步提示, 标准
化迁移距离之差不小于 7 的任意两峰分属 AMF 的
不同种.可是,仅凭对表 4 分析还无法确定 AMF 种
间划分的检测限度. 而限度不同,结论也完全不同.
鉴于各样品峰标准化迁移距离差异的非显著性
及丛枝菌根真菌种间划分检测限度的未知性与重要
表 4 样品标准化迁移
Table 4 Sandardization of sample peak movement
编号
N o.
迁移距离
Distance
编号
N o.
迁移距离
Distance
编号
No .
迁移距离
Dist ance
D1 2478/ 2489 X1 2481/ 2492 S1 2480/ 2491
D2 2493 X2 2480/ 2491 S2 2492
D3 2483/ 2494 X3 2482/ 2493 S3 2483/ 2494
D4 2484/ 2495 X4 2485/ 2496
迁移距离分别指图 3b 中各样品的前后两峰 T he distances indicate respectively
the former and aft er peak displayed in Fig 3b.
性,作者抽取 D1、X4和 S2的扩增产物进行克隆测
序.结果显示, D1及 X4样品 SSCP 电泳图谱中的第
二样品峰与S2图谱中的单峰序列完全相同. 通过与
AMF 球囊霉科已知各种近 190个碱基序列的比较,
最终确定该序列属于根内球囊霉 ( Glomus in
traradix ) (图 5) .而 D1 及 X4 样品 SSCP 电泳图谱
中的第一样品峰则未得到测序结果.这一结果表明,
所有样本 SSCP 图谱中的第二峰及单峰均代表 G .
intraradix ,而第一峰则可能代表 Glomaceae的另一
菌种.至此,在前述科特异性 PCR 结果分析的基础
上,本研究选取的 3个优势赤杨树种对与其共生的
AMF 表现了进一步的选择特异性,即全部与 G . in
t rar adix 优势共生.同时,宿主树种类别以及海拔条
件仍没有对这种选择特异性表现出显著的影响.
依此可以认为, 在本研究范围内, 利用半巢式
LPPCRSSCP技术分析发现, 中国吉林长白山赤杨
属东北赤杨、西伯利亚赤杨和色赤杨共生丛枝菌根
真菌在科乃至种的水平上并未随宿主的变化表现出
丰富的多样性; 3 个树种在自身属的水平上与共生
的球囊霉科( Glomaceae)至少一种 AMF, 即 G . in
t rar adix , 在种的水平上表现出不相关于宿主海拔
高度的某种相互选择性.
VANS15∋ & 3∋
1 AGCCATGCAT GTCT AGTAT A AT CGT TAT AC AGGT
GAAACT GCGAAT GGCT
2 GTCT AGTAT A ATCGT TATAC AGGT
GAAACT GCGAATGGCT
1 CAT TAAAT CA GT TAT AATTT ATTT GATAGT ACCT
T ACTAC TT GGATAACC
2 CAT TAAAT CA GT TAT AATTT ATTT GATAGT ACCT
T ACTAC TT GGATAACC
1 GTGGTAAT TC TAGAGCTAAT ACATGCT AAA ACCTCC
GACT TCTGGAAGGG
2 GTGGTAAT TC TAGAGCTAAT ACATGCT AAA ACCTCC
GACT TCTGGAAGGG
1 GGTGTAT TTA TTAGATAAAA AACCAATATC
GGGCAACCGA TT CCCTTGGT
2 GGTGTAT TTA TTAGATAAAA AACCAATATC
GGGCAACCGA TT CCCTTGG
VAGLO 3∋ & 5∋
图 5 测序结果
Fig. 5 Alignment of the sequenced DNA.
1. 根内球囊霉部分 SSU 基因序列 G lomus intr arad ix partial SSU
DNA sequence; 2. D1/S 2/ X4 SSCP 图谱第一峰测序结果 Alignment
of the sequenced DNA of the former peaks in the S SCP elect rophore
togram of sample D1/ S2/ X4.
4 讨 论
利用 PCRSSCP 研究丛枝菌根真菌 18SrDNA
始于 Simon等[ 19] .该技术以 AMF SSU 基因同源序
列在各种之间的细微差别为 SSCP 的基础, 结合半
巢式 LPPCR 的突出优点, 能够对 AMF 种水平上
的多样性进行迅速有效的检测. 由于用于设计引物
的 18s序列数目有限,一些 AMF 可能难以使用上述
引物进行扩增.根据本研究 SSCP 图谱所示双峰,可
基本认定大部分样本含有 Glomaceae两种 AMF,但
测序却仅得到 G . intr aradix 的相关序列. 尽管本研
究样本基本涵盖了长白山 750~ 2000 m 共6个海拔
梯度 3个宿主的各种情况, 仍不足以全面反映 3种
赤杨在整个地区生态系统中的实际情况. 因而, 我们
不能断言 3种赤杨的实际优势共生真菌伙伴仅限于
1840 应 用 生 态 学 报 14卷
G . intr aradix 这一个种, 但可以确定其中必有 G .
intraradix ,同时很可能还包含 Glomaceae 的另一个
菌种.
自然生态环境中 AMF 的多样性是各生态因子
综合作用的结果.对宿主植物及环境条件的选择性
和适应能力的不同或进化过程中的历史原因, 造成
了AMF 属和种分布的明显不均衡性;土壤状况及
海拔高度等生态因子对其多样性具有显著影响. 有
调查表明, 我国北方土壤中的 AMF 大都为球囊霉
属( Glomus ) ,其种次占总种次数的 87%; 主要分布
在pH 7. 5~ 9. 0的土壤中,比例随碱性增强而增加,
但也存在个别喜酸菌种; 在海拔3000 m 以下分布差
异不大; 其中以喜碱的摩西球囊霉( G . mosseae )分
布最为普遍[ 22] . 如果 SSCP 图谱第一峰确实代表
Glomaceae另一菌种,它很可能也属于 Glomus; 由于
长白山土壤偏酸( pH 5. 0~ 6. 5) , G . mosseae的优势
并不明显. 而 G . int rar adix 属于∗ 窄谱生态型+内
生菌根真菌,对环境适应性较差,对生态条件及宿主
选择要求较高, 于不适环境中不易繁殖生长, 即使通
过某些传媒扩散了孢子也难以存活,或因与其它种
竞争失败而得不到发展, 因而经常局限于一定地域
或生态条件之下[ 22] . 它在本研究中所表现出的绝对
共生优势提示, 长白山地区东北赤杨、西伯利亚赤杨
和色赤杨属于 G . int rar adix 仅有的少数几个共生
伙伴, 可以作为 G . int rar adix 的理想研究对象;
G . int rar adix 对宿主表现出的专一性基本不受海
拔或温度等生态因子的影响, 宿主树种本身是 G .
intraradix 共生的决定因素, 但土壤 pH 值可能对
其分布具有较显著的影响; 而 3 种赤杨对 G . in
traradix 表现出的明显选择特异性体现了宿主对其
的依赖程度[ 16] .
一般认为, 在一定条件下,宿主和共生体之间的
专一性越强,共生体就越适应特定环境,对资源的利
用率也越高,对于共生物而言,种间的竞争也就更缓
和[ 9] .从共生物的生存价值看, 专一性虽然不是最
有效的生存方式,但对环境资源的利用却是最有效
的.与植物形成 AM 菌根共生体的真菌全是专性共
生营养的,在其生活史中,只有无性繁殖过程.因此,
这类真菌的遗传多样性不高, 也不能分化形成与宿
主植物物种多样性相近、专一性很强的种或型. G .
intraradix 与 3种赤杨的优势共生即为一个实例.
Glomus intr aradix 与东北赤杨、西伯利亚赤杨及色
赤杨的相互选择性可能未全面代表长白山乃至整个
东北地区赤杨属植物的一般共生规律, 但确实在本
研究样本范围及技术条件限制下反映出某种真实的
客观规律. 半巢式 LPPCRSSCP 技术作为一种有
效的检测方法为 AMF 今后的深入研究提供了有力
工具.
参考文献
1 Amann R, Springer N, Ludw ig W, et al . 1991. Identif icat ion in
situ and phylogeny of uncultured bacterial en dosymbionts. Nature ,
351( 11) : 161~ 164
2 Amaranthus MP, Trappe JM . 1993. Effect s of erosion on ecto
and VAmycorrhizal inoculum potent ial of soil f ollow ing forest fire
in southw est Oregon. Plant and Soi l , 150( 10) : 41~ 49
3 Berch SM, Fortin JA. 1982. Endogone pesiformis: Axenic culture
and associations w ith Sphagnum , Pinus syl vest ris , A ll ium cepa
and A ll ium p orr um . Can J Bot , 61: 899~ 905
4 Cedergren R, Gray MW, Abel Y, et al . 1988. The evolut ionary relat ion
ships among known life f roms. J Mol Evol , 28( 3) : 98~ 112
5 Chen ZD(陈之端 ) . 1999. Origin and dist ribut ion of birch family
plants. Iu: LM ( 路安民) . ed Spermatophyte Genus Geography.
Beijing: S cience Press. 236~ 258( in Chinese)
6 Cuenea G, Lovera M . 1992. Vesiculararbuscular mycorrhizae in
disturbed and revegetated sites from La Gran Sabana, Venzuela.
Can J Bot , 70( 1) : 73~ 79
7 Delong EF, W ickham GS, Pace NR. 1989. Phylogen etic stains:
ribosomal RNAbased probes for the ident ification of signle cells.
Science , 243( 8) : 1360~ 1363
8 Fox GE. 1980. Th e phylogeny of prokaryotes. S cience , 209( 7 ) :
457~ 463
9 Fox LR, M orrow PA. 1981. Specializat ion species property or lo
cal phenomenon. Science , 211( 12) : 887~ 892
10 Gray MW, Sankof f D, Cedergren RF. 1984. On the evolut ionary
descent of organisms and organelles: a global phylogeny based on a
highly conserved structural core in small subunit ribosomal RNA.
N ucleic Acids Res, 12( 4) : 5837~ 5852
11 Hamby RK, Zimmer EA. 1988. Ribosomal RNA sequences for in
ferring phylogeny w ithin th e grass family ( Poceae) . Plant Syst
Ecol , 160(11) : 29~ 37
12 Harley JL, Smith SE. 1983. Mycorrhizal Symbiosis. London: A
cademic Press. 281~ 298
13 Borneman J, Jack HR. 2000. PCR primers that amplify fungal
Rrna genes from environmental samples. A ppl E nv iron Microbiol ,
66( 10) : 4350~ 4360
14 Jiang JD(蒋家淡) , Lin YS(林延生) , Zhan ZY(詹正宜 ) , et al .
2001. The present application situat ion and research progress of the
biological technology of mycorrh iza. Acta A gric Univ Jiang xiensis
(江西农业大学学报) , 23( 2) : 216~ 219( in Chines e)
15 Liu RJ(刘润进) , Li XL (李晓林) . 2000. Arbuscular Endomhc
orrhizal Research and Applicat ion. Bejing: China Social S cience
Publishing House. 138~ 139 ( in Chin ese)
16 Monzon A, Azcon R. 1996. Relevance of mycorrh izal fungal origin
and host plant genotype to inducing grow th and nut rient uptake in
Medicago species. Agri c Ecosyst E nv iron ,60( 1) : 9~ 15
17 Olsen GJ, Giovannoni SJ , Pace NR. 1986. M icrobial ecology and
evolut ion: a ribosomal RNA approach. A nnu Rev Microbiol , 40
( 9) : 337~ 365
18 Orita M , Suzuki Y, S ekiya T, et al . 1989. A rapid and sensit ive
detect ion of point mutat ions and genetic polymorphism using poly
merase chain react ion. Genomics, 5( 3) : 874~ 879
19 Simon L, Lalonde M, BrunsTD. 1992. Specific amplificat ion of 18s fun
gal ribosoma genes from vesiculararbuscular endomycorrbizal fungicoloniz
ing roots. App l Envi ron Microbiol , 58(6) : 291~ 295
20 Simon L, Levesque RC, Lalonde M . 1993. Ident ificat ion of en
domycorrhizal fungi colon izing roots by fluorescent singlestrand
conformat ion polymorphismpolymerase chain reaction. A ppl Env i
ron Microbiol , 59( 12) : 4211~ 4215
21 Trappe JM . 1987. Phylogenet ic and ecologic aspects of mycotrophy
in the angiosperms f rom an evolut ionary standpoint . In: S af ir GR
ed. Ecophysiology of VA Mycorrhizal Plants. Florida: CRC Press. 5
~ 26
22 Zhang MQ(张美庆) , Wang YS(王幼珊) , Zhang C (张 弛 ) , et
al . 1994. Th e ecological dist ribut ion characterist ics of some genera
and species of VAM fungi in northern China. A cta Mycol Sin (真菌
学报) , 13( 3) : 166~ 172 ( in Chin ese)
作者简介 李一叶, 女, 1977 年生,硕士,主要从事分子生物
学及微生物学相关研究. Email: li1ye@ 163. com
184111 期 李一叶等: 长白山赤杨丛枝菌根真菌多样性的半巢式 LPPCRSSCP检测分析