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Physiological and biochemical bases of xero-tolerance of fungal biocontrol agents and their application

生防真菌耐旱特性的生理生化基础及其利用



全 文 :生防真菌耐旱特性的生理生化基础及其利用 3
叶素丹 冯明光 3 3
(浙江大学微生物研究所 ,杭州 310029)
【摘要】 丝孢类生防真菌常需满足高湿度条件才能萌发和侵染害虫 ,已成为广泛应用真菌杀虫剂控制害
虫的重要限制因素. 适当的剂型化技术在一定程度上能够降低菌剂对环境湿度的依赖性 ,但生防真菌侵染
体本身的耐旱性对菌剂的环境适应性起决定性作用. 文中回顾和评述了近 20 多年来国际上生防真菌耐旱
性研究与利用的主要进展 ,分析和总结了生防真菌耐旱性的生理生化基础及其水活度调控原理 ,讨论了提
高低分子多元醇及海藻糖等生物学相容溶质在侵染体内积聚而增强菌剂耐旱性的可能途径. 认为认识决
定耐旱性的胞内相容溶质积累的分子生物学基础及其调控机理 ,探索建立从生理生化水平上最大限度地
增强生防菌剂耐旱性的新工艺 ,是今后生防真菌基础与应用研究的重要方向.
关键词  生防真菌  耐旱生理  水活度调控  菌剂改良  微生物防治
文章编号  1001 - 9332 (2004) 12 - 2383 - 05  中图分类号  Q93919  文献标识码  A
Physiological and biochemical bases of xero2tolerance of fungal biocontrol agents and their application. YE Su2
dan ,FEN G Mingguang ( Institute of Microbiology , College of L if e Sciences , Zhejiang U niversity , Hangz hou
310029 , China) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2004 ,15 (12) :2383~2387.
Hyphomycetes fungal biocontrol agents usually infect host insects by conidial germination and penetration into in2
sect integument under high humidity condition which is generally the restrictive factor for the application of my2
coinsecticides in insect control in the field. It is ideal to produce more xero2tolerant inocula (e. g. conidia) of the
agents ,although the current formulation technology has helped to some degree to reduce the dependence of fungal
formulations on the high humidity. This paper reviewed the advance in basic and applied studies on the physiolog2
ical and biochemical bases of fungal xero2tolerance and its water activity regulation in the past two decades. Possi2
ble approaches to make fungal formulations more xero2tolerant were discussed ,with an emphasis on the increased
accumulation of biologically compatible solutes such as low2molecular polyols and trehalose to the inocula produced
for formulation. More efforts are necessitated to understand the mechanisms involved in molecular biology and in
regulating the accumulation of the compatible solutes ,and to explore for new technology to enhance the xero2 tol2
erance of the fungal agents through biochemical regulation in mass production.
Key words  Fungal biocontrol agents , Xero2tolerant physiology , Water activity regulation , Formulation en2
hancement , Microbial control. 3 国家重点基础研究发展规划项目 (2003CB114203) 、国家自然科学
基金项目 (30270897)和教育部长江学者奖励计划资助项目.3 3 通讯联系人. E2mail :mgfeng @zju. edu. cn.
2004 - 06 - 14 收稿 ,2004 - 08 - 30 接受.
1  引   言
随着无公害农产品的社会需求日益增长 ,害虫微生物防
治越来越受到重视 [1 ] . 丝孢类生防真菌一般通过昆虫体壁侵
染 ,易于发酵生产和剂型化 [16 ,30 ,46 ] ,是开展害虫微生物防治
的重要资源. 白僵菌 ( Beauveria) 、绿僵菌 ( Metarhiz ium) 、拟
青霉 ( Paecilomyces) 等生防真菌最具代表性 ,已被世界各国
争相开发和用于多种农林害虫的防治 [2 ,15 ,17 ,34 ] . 生防真菌制
剂是严格的活体微生物制剂 ,有效杀虫成份是具有完整细胞
生命结构的侵染体 (如孢子、菌丝) ,其致病杀虫能力除了菌
种本身的遗传属性外还取决于环境条件 ,尤其是环境湿度是
极其重要的限制因素 [1 ,11 ,39 ] ,多数生防真菌孢子常在 95 %
以上的相对湿度下才能在昆虫体表萌发和侵入 [23 ] . 因此 ,生
防真菌抗逆尤其耐旱生物学性状的认识对于生防真菌制剂
的研发和应用具有重要意义. 在研究与应用实践中 ,菌剂环
境适应性的增强既可通过菌种筛选和剂型 优 化 途
径[16 ,30 ,46 ] ,也可通过侵染体生产过程中的生理生化调控途
径[28 ,37 ,45 ] .以耐旱性状为例 ,生防真菌耐旱的生理机制研究
近年在国外进展较快 ,推动了生理生化技术在菌剂改良中的
应用[26 ,27 ,29 ,31 ] . 我国应用生防真菌防治农林害虫的努力已
有近半个世纪的历史 ,并不乏成果 [14 ,16 ] ,但从生理生化途径
提升生防菌剂技术含量的工作则十分有限. 本文通过对近
20 多年来国际上有关生防真菌耐旱性生理生化研究进展的
回顾和评述 ,阐明水活度调节在耐旱生防菌剂研发中的重要
意义及应用前景 ,以推动我国生防菌剂技术不断进步.
2  水活度与生防真菌耐旱特性
任何微生物生长基质总是有一定的含水量 ,但基质中的
含水不可能都是微生物可利用的 ,只有其中游离水 (free wa2
ter)才是微生物可利用的有效水. 基质中被微生物可利用水
应 用 生 态 学 报  2004 年 12 月  第 15 卷  第 12 期                              
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Dec. 2004 ,15 (12)∶2383~2387
分即有效水的含量常用水活度 (water activity) aw 表示 ,定
义为在一定压力和温度下溶液蒸汽压 ( PW) 与纯水蒸汽压
(PW0)之比 ,即 aw = PW/ PW0 [21 ] . 当水中有溶质存在时 ,溶
液中水分子的引力增加 ,蒸汽压下降 ,使 aw 变小. 水活度 aw
与相对湿度 RH ( %) 之间的关系可表为 RH = aw ×100. 可
见 ,某种微生物生长所需的 aw 越高 ,越不耐旱 ,反之亦然.
在生防真菌研究中 ,水活度可用于表示真菌侵染寄主昆虫时
其体表必需的有效水 [23 ] . 生防真菌的耐旱特性是真菌在侵
染寄主时需要的有效水低于其常规需要 ,是生防真菌抗逆生
物学研究的重点. 耐旱性状的获得或增强对生防真菌具有重
要意义. 它直接关系到生防菌剂的环境适应性、稳定性及对
靶标的控制效果.
211  生防真菌耐旱的生理生化基础
一些微生物能够在高渗透压 (低水活度) 条件下生长的
现象早就受到关注 [5 ] . 由于微生物有细胞壁存在 ,只有胞内
水势稍低于胞外水势时才能形成一种有利于生长的膨压 [3 ] .
当面临旱 (即低水活度)胁迫时 ,胞内会出现一种或多种低分
子溶质的积累 ,使胞内水势降低. 任何溶质都可降低水势 ,但
只有被称为相容性溶质的物质在胞内积累才不致于破坏胞
内酶系结构和功能 [5 ,35 ] . 这些物质主要包括离子、氨基酸和
多元醇三大类[40 ] . 其中 ,多元醇是相当重要的累积性相容物
质[8 ] ,而氨基酸不能用于某些真菌的渗透调节 [35 ] . 由于这些
物质的积累降低胞内水势 ,才使微生物在较低水活度下保持
正常代谢活动. 在低水活度胁迫下 ,耐旱和适旱真菌能够在
胞内合成一些相容性的多元醇或特殊的多糖 ,如分子量较低
的丙三醇 (9211)及赤藻糖醇 (12211)与分子量较高的阿拉伯
糖醇 (15211) 及甘露醇 (18212) 等[3 ,7 ,12 ,19 ,24 ,25 ,35 ,36 ,44 ]. 不同
分子量的多元醇在低水活度胁迫下的生物学功能不尽相
同[6 ] .海藻糖对大多生防真菌的耐旱性状具有特殊意义. 它
通过替换脱水磷脂膜中的水分子而防止酵母和丝状真菌脱
水时受损伤[9 ,10 ] . 胞内海藻糖累积水平与球孢白僵菌 ( Beau2
veria beauveria) 、金龟子绿僵菌 ( Metarhiz ium anisopliae) 、粉
拟青霉 ( Paecilomyces f arinosus) 及哈茨木霉 ( Trichoderm a
harz ianum)等生防真菌的孢子贮存寿命有关 [20 ] .
212  旱胁迫的水活度调控
生长基质水活度调控是研究生防真菌耐旱生物学特性
的基本途径 ,已有较完备的检测方法 [22 ] . 在培养基中加入调
节物质造成低水活度胁迫环境 ,通过诱导真菌胞内多元醇和
海藻糖的积累 ,使胞内水活度下降但并不阻碍细胞正常代谢
活动[7 ] . 目前常用的水活度调节方法 ,一是调节培养基的渗
透压 (osmotic pressure) ,即加入不同量的离子化 KCl、NaCl 或
非离子化的丙三醇、葡萄糖、果糖等而使培养基呈现不同梯
度的水活度 ;二是调节培养基的基质压 (matrix pressure) ,即
加入不同质量及分子量的聚乙二醇 (polyethylene glycol ,
PEG) ,如 PEG8000、PEG600 及 PEG200 等 ,获得水活度呈梯
度变化的培养基 [3 ,12 ,19 ,23 ,38 ,41 ] . 以常用于丝孢类杀虫真菌培
养的萨氏培养基 ( Sabouraud dextrose agar) 为例 ,其 aw 为
01998 ,加入 KCl 11418 g·L - 1后降为 01930 ;用丙三醇 14114
g·L - 1代替其中的葡萄糖 , aw 为 01952[20 ] .
渗透压调节与基质压调节具有不同效果 [39 ] ,而同一种
调节方法采用不同物质也产生不同的调节效果 ,表现为胞内
多元醇或海藻糖的累积水平不同 [18 ,20 ,23 ] . 有些真菌需要少
量无机盐维持生长 [23 ] . 用 KCl 调节时 , KCl 在菌丝中积累可
降低胞内水活度 ,并与培养基的低水活度胁迫协同作用. 但
胞外的这些渗透剂可能只起到短暂的临时调节作用 ,胞内相
容溶质的积累才起主导作用 [3 ] . 若采用丙三醇作为调节物 ,
不仅能降低水活度 ,还能增强所产孢子的萌发能力 [20 ] .
3  生防真菌耐旱性状改良及应用
311  水活度调节促增孢子内相容溶质积累
通过生理生化途径在一定程度上能提高生防真菌孢子
内相容溶质的合成与积累 . 在对球孢白僵菌、金龟子绿僵菌
和粉拟青霉等杀虫真菌孢子内多元醇和海藻糖含量变化与
培养基水活度研究 [19 ]中 ,用不同浓度 KCl (010~15010 g·
L - 1)调节培养基的水活度 ≤01938~01998) ,所获分生孢子
中的多元醇和海藻糖的含量随水活度及菌种菌株而大不相
同. 球孢白僵菌和粉拟青霉在 aw = 01938 下孢子多元醇的
含量分别是 aw 值 01988~01998 的 2 倍 ,而金龟子绿僵菌孢
子内多元醇的含量受水活度影响不大. 当不考虑水活度因素
时 ,甘露醇是 3 种真菌孢子中最主要的多元醇. 随培养基水
活度下降 ,3 种真菌孢子中只有低分子量的多元醇得以累
积.当水活度从 01988 下降到 01970 时 ,金龟子绿僵菌孢子
中的甘露醇含量从 4815 mg·g - 1下降到 31 mg·g - 1 ,而阿拉
伯糖醇从 412 mg·g - 1上升到 3410 mg·g - 1 ;当水活度再从
01970 下降到 01938 时 ,甘露醇和阿拉伯糖醇含量都趋于下
降 ,只有低分子量的丙三醇和赤藻糖醇的含量上升. 这是因
为在有限的水活度下 ,低分子量的丙三醇与赤藻糖醇对渗透
压的调节比较高分子量的甘露糖更为有效 [6 ,18~20 ] . 饱和丙
三醇或赤藻糖醇的水活度 ( aw ≤01914) 低于相同条件下甘
露醇的水活度 (01978) ,说明低分子多元醇调节水活度更有
效[19 ] ,而短碳链多元醇与胞内酶系也更相容. 在低水活度下
低分子多元醇的胞内积累现象也见于其他丝状真菌 [3 ] . 在用
聚乙二醇调节水活度的培养基上 ,哈茨木霉孢子内的海藻糖
含量显著增加 ,使其在干燥条件下更易存活 [31 ] .
用不同浓度的丙三醇、葡萄糖、海藻糖或淀粉作为碳源
(01925 ≤aw ≤01995) 培养生防真菌 ,碳源种类和浓度能显
著影响孢子中多元醇和海藻糖的含量 [18 ] ,干孢子粉中多元
醇的最高含量在不同菌种间的变化范围达 11214~15819
mg·g - 1 ,高于在 KCl 调节水活度的培养基上所获孢子的多
元醇最高含量. 在丙三醇培养基上 ,分生孢子中累积的丙三
醇和赤藻糖醇多于其它碳源培养基上. 在淀粉培养基上 ,孢
子中累积的相容性溶质主要是甘露醇 ,而赤藻糖醇和丙三醇
含量很低. 这些实验说明孢内低分子多元醇的累积是水活度
胁迫的结果而不是碳源的结果. 葡萄糖是丝孢类真菌培养中
最常用的碳源 ,当增加其含量时 ,孢子中海藻糖的含量呈下
降趋势 ,恰与 KCl 调节效果一致. 这也说明孢子内相容溶质
4832 应  用  生  态  学  报                   15 卷
含量的变化主要受控于水活度而不是碳源及其浓度变化. 在
高浓度海藻糖的培养基上 ,孢子中海藻糖的积累逾 200 mg·
g - 1 ,而海藻糖含量被认为与孢子耐贮存能力直接相关 [31 ] .
上述内源相容溶质在虫尸体表直接产生的孢子中可检测的
水平很低. 直接源于虫尸的孢子对寄主的毒力一般优于人工
基质上培养的孢子 ,如直接产于虫尸的金龟子绿僵菌孢子中
分别主要含赤藻糖醇、甘露醇和葡萄糖 ,海藻糖含量很低 ,而
人工培养基上的孢子内源溶质主要是甘露醇、葡萄糖和赤藻
糖醇[37 ] . 与虫尸上的孢子相比 ,人工生产的分生孢子含有更
多的海藻糖[18 ] . 这说明培养基质的水活度调控可显著影响
孢子的耐旱特性 ,也是提高生防真菌制剂质量的重要途径.
312  水活度调节增强孢子萌发和侵染力
生防真菌对昆虫的侵入始于孢子在昆虫体壁上的附着 ,
在适宜的温、湿条件下萌发 ,并以芽管穿透寄主体壁而进入
血腔 ,借血淋巴为营养而大量繁殖 ,导致寄主死亡僵化. 在此
入侵过程中 ,孢子萌发条件至关重要 ,一般认为取决于高湿
度条件 ,而昆虫体壁外层的自由水及其某些表皮结构化合物
可促进孢子萌发 [16 ] . 相对于常规方法生产的孢子 ,在一定低
水活度胁迫下生产的孢子的萌发对环境湿度的依赖性降低 ,
有利于侵染.
在不同水活度的萨氏培养基上 ,如添加 KCl 11418 g·
L - 1 ( aw = 01930) ,或将其中的葡萄糖代之以丙三醇 14114 g
·L - 1 ( aw = 01952) 、海藻糖 378 g·L - 1 ( aw = 01972)或海藻糖
378 g/ L + KCl 54 g·L - 1 ( aw = 01955) ,所获生防真菌孢子粉
的丙三醇和赤藻糖醇含量均有提高 ,耐旱特性增强 [20 ] . 在含
不同浓度的 PEG600 或 PEG200 + PEG600 的孢子萌发培养
基 (01887 ≤aw ≤01989) 上 ,当孢内丙三醇和赤藻糖醇含量
达到 16416 mg·g - 1以上时 ,绿僵菌孢子可在 aw = 01887 即
8817 % RH 下萌发 ,拟青霉孢子可在 aw = 01923 即 9213 %
RH 下萌发 ,白僵菌孢子可在 aw = 01935 即 9315 % RH 下萌
发 ,而未经处理的对照孢子在 aw < 01951 (白僵菌和拟青霉)
或 01935 (绿僵菌) 条件下就不能萌发. 显然 ,水活度调控法
生产的孢子 ,其萌发对环境湿度的要求下降了几个百分点 ,
变得更加耐旱. 此外 ,孢子萌发后的芽管伸长也显著优于其
他处理. 类似研究结果在植物病害的生防菌剂中也有报
道[42 ] .
在培养过程中 ,水分蒸发将使培养基的水活度自然降
低 ,到达一个足以使真菌停止生长的阈值[27 ] . 基于此 ,用
PEG调节的低水活度培养基筛选经紫外辐射诱变的金龟子
绿僵菌和粉拟青霉 ,所获突变株在低水活度下生长状况明显
优于出发菌株 ,并显著提高对稻叶蝉 ( Nephotettix vi rescens)
在较低湿度下的侵染力 [38 ] .
313  水活度调节提高生防菌剂效果
害虫生防真菌制剂在实验室条件下一般比田间表现出
更好的杀虫效果 [17 ] ,其影响因素固然复杂 ,但最关键的因素
是田间环境湿度对孢子萌发和侵染的限制作用 ,因为满足孢
子萌发和侵染所需的高湿度条件在田间时有时无 [16 ] . 经丙
三醇低水活度胁迫培养基筛选的球孢白僵菌、金龟子绿僵菌
和粉拟青霉对蜡螟 ( Galleria mellonella)的生物防治效果 ,即
使在相对湿度较低的条件下也十分显著. 在 7812 %RH 下 ,
金龟子绿僵菌对蜡螟幼虫的有效致死率达 70 % ,粉拟青霉
更高达 83 % ,而未经低水活度胁迫处理的对照孢子在该湿
度下不引起任何死亡. 低水活度胁迫条件下生产的球孢白僵
菌孢子可提高杀蚜效果 [37 ] . 在一些植物病害的生防真菌中 ,
有助于孢子内有益物质合成和积累的措施能提高生防菌剂
的控病效果[42 ,43 ] . 显然 ,通过水活度调控操作从生理生化水
平上增强生防菌剂的耐旱特性 ,能够提高生防菌剂的生态适
应性和田间应用效果.
4  影响生防真菌耐旱性的其它因素
在丝孢类生防真菌的液体培养中 ,培养基成分不同可影
响芽生孢子或菌丝体内的碳水化合物含量 [4 ,32 ] . 虽然菌丝中
的多元醇含量随碳源的种类及含量而不同 ,但这些多元醇在
液培条件下的渗透调节作用并未得到充分认识. 限氮培养基
比限碳培养基更有利于胞内碳水化合物积累 ,其产物的贮存
时间也更长些 ,限氮培养的芽生孢子比限碳培养的芽生孢子
对稻叶蝉的毒力更强[32 ,33 ] . 调节培养液的碳氮比可提高玫
烟色拟青霉 ( Paecilomyces f umosoroseus) 的耐旱力[29 ] . 然而 ,
深层发酵培养的芽生孢子及分生孢子不如固体基质上产生
的分生孢子更耐贮存 ,环境稳定性也较差 [32 ] . 因此 ,生防真
菌的抗逆生物学研究主要针对固体培养的分生孢子.
除水活度外 ,培养基中的碳源及其浓度、培养时间、温度
乃至 p H 都会对生防真菌培养产物的耐旱性状产生影响 ,而
这些影响往往是协同互作的. 在不同温度 (5~35 ℃) 和 p H
(219~1111)条件下对球孢白僵菌、金龟子绿僵菌和粉拟青
霉进行长达 120 d 的培养研究中 ,孢子内多元醇及海藻糖含
量的变化很好地揭示了培养条件对生防真菌耐旱性状的重
要性[21 ] . 在培养 30 d 后 ,球孢白僵菌和粉拟青霉分生孢子
内多元醇及海藻糖的含量达到最高水平 ,随后其含量呈明显
下降趋势. 温度的影响尤其明显 ,如在 25 ℃以上的温度下 ,
球孢白僵菌和粉拟青霉孢内多元醇及海藻糖的积累量下降 ,
而在低于 14 ℃的温度下孢内多元醇及海藻糖积累量也会下
降.这些孢子中积累的多元醇主要由甘露醇组成 ,虽然其积
累量在 15 ℃时最高 ,但海藻糖与其他多元醇却在 20~25 ℃
间的积累最丰. 孢内多元醇及海藻糖的积累在 p H 5~10 间
受影响不大 ,但低于 p H 415 就明显下降. 在 p H 219 下 ,粉拟
青霉孢内能积累丙三醇和赤藻糖醇 ,而另两种真菌孢内不能
积累这些低分子多元醇. 因此 ,酸性介质培养可促进低分子
多元醇在有些真菌孢子中的积累.
5  结   语
综上所述 ,增强生防真菌及其制剂的耐旱性是提升害虫
微生物防治技术水平而开展研究工作的重要目标之一. 为了
突破生防真菌高湿度要求的环境条件限制而增强生防菌剂
的实用性 ,近 10 多年来 ,国内外在菌种筛选和剂型优化方面
的努力已大见成效 , 推动了一系列生防菌剂走向应
583212 期             叶素丹等 :生防真菌耐旱特性的生理生化基础及其利用            
用[2 ,13 ,15~17 ,30 ,34 ,46 ] . 耐旱生防真菌概念的提出始于 20 世纪
70 年代末 ,虽然多年的基础研究已基本探明了生防真菌耐
旱性的生理生化机理 [7~10 ,12 ,20~25 ,36 ,40 ,44 ] ,但成功应用的实
例并不多. 根据耐旱性的生理生化基础及其水活度调控原
理 ,现有成功的菌剂生产工艺中事实上或多或少地采用了影
响水活度而增强菌剂耐旱性的技术 ,因为液体、固体培养基
配方和发酵条件也可改变水活度 [4 ,21 ,32 ,33 ] . 如何自觉地应用
水活度调控原理 ,通过建立新的工艺从生理生化水平上最大
限度地增强生防菌剂的耐旱性 ,是今后相关基础与应用研究
努力的重要方向.
国际上生防真菌耐旱性的研究基本上还处于生理生化
指标的识别和验证阶段 ,很少涉及胞内相容溶质积累的分子
生物学基础及其调控机制. 我国相关研究工作虽起步晚 ,但
并不太迟. 借鉴国内外日新月异的环境微生物学和生物信息
学的研究方法 ,生防真菌耐旱性的研究与利用有可能获得高
位嫁接、高起点发展的机遇 ,并籍此推动害虫微生物防治服
务于无公害农业.
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《应用生态学报》(1990 年创刊)是经国家科委批准、科学出版社出版的国内外发行的综合性学术刊物.
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783212 期             叶素丹等 :生防真菌耐旱特性的生理生化基础及其利用