全 文 ：生防真菌基因标记技术研究进展*
祝明亮
(云南省烟草科学研究所,玉溪 653100)
摘 要: 生防真菌在环境中的检测是生物防治研究中的一个重要问题 ,基因标记是检测生防真菌的一种新
技术。概述基因标记的概念、基因标记的载体质粒和标记基因、基因标记的方法及其在生防真菌中的应用情况。
关键词: 生防真菌 基因标记 进展
Advances of Gene Tagged in Biocontrol Fungi
Zhu M ingliang
( Yunnan T obacco S ci ence I nsti tute , Yu xi 653100)
Abstract: The monitor ing of biocontr ol fung i in the env ir onment are one impo rtant problem on the study of b-i
o lo gical contro l. A new technolog y, g ene tag ged w as developped fo r the monitor ing of bio cong tro l fung i. I n this ar-
ticle, w e intr oduced the concept o f g ene tagged, and show ed some the vector plasmid and ma rker gene, and dis-
cussed the methods of g eng tag ged and rev iewed the applicat ion and the futur e of g ene tag ged in biocontr ol fungi.
Key words: Biocontro l fungi Gene tagged Advances
在植物有害生物的生物防治中,真菌是重要的
生防资源类群。在研究开发真菌生防制剂过程中,
尽管许多学者对如何检测特定的生防真菌进行了不
懈的努力,针对不同的生防真菌采用了选择性半选
择性培养基、孢子回收技术、最大可能记数技术、酶
联免疫分析和单克隆抗体技术等方法, 在植物寄生
线虫生防真菌的研究中, 还使用线虫被寄生的数量
来评估生防真菌的数量 [ 1] , 但这些方法在对生防真
菌的检测过程中灵敏度和准确性不高, 或者只能局
限于特定的环境条件使用, 仍然不能真正确定它们
在自然环境中的定殖、消长规律。
随着现代分子生物学技术的不断发展, 为人们
对生防真菌的快速灵敏检测提供了理论基础和技术
手段。目前研究较多的分子检测方法有两种, 一是
对生防真菌进行遗传特征的分子标记, 一是利用成
熟的生物转化技术对生防真菌进行基因标记, 这两
种方法已经成为单独或联合其他方法检测生防真菌
及其他生防微生物的重要手段。本文对生防真菌基
因标记技术作一简要概述。
1 基因标记的概念
基因标记是指将具有标记功能的外源 DNA 引
入受体菌株,经表达以后,受体菌株细胞能够在环境
中与其他微生物相区别的一种标记方法[ 2]。在基因
标记中,标记基因可引入到受体菌株的质粒上或插
入到其染色体中, 在菌体中稳定遗传,并且该基因的
表达结果能被检测到, 即具有标记功能。对生防真
菌而言,基因标记就是通过遗传操作使供试菌株带
上自然菌株不具备的遗传标记, 这样就可以根据标
记基因进行生防真菌的检测分析。
2 基因标记的载体质粒和标记基因
在生防真菌的基因标记中, 合适的载体质粒和
标记基因是进行基因标记的两个基本要件。首先,
任何标记基因必须通过合适的载体才能进入受体真
菌细胞内,并稳定遗传表达该基因标记;其次,一个
标记基因不是适合于任何生防真菌, 它必须要与所
标记生防真菌的生物学特性相结合, 如一个抗药性
收稿日期: 2005-10-12
* 基金项目:云南省 十五攻关资助项目( No. 2001 NG08)、云南省烟草公司科技项目( 04A19)
作者简介:祝明亮( 1972- ) ,男,博士,助理研究员,研究方向:主要从事烟草植保及微生物研究
T el : 0877- 2053302; E-mail: mingliangzhu@ hotmail . com
生物技术通报
技术与方法 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 1期
标记基因就不适合作为对该药剂具有高度抗性的生
防真菌的标记基因。目前已研究确定适用于生防真
菌基因标记的载体质粒及标记基因,见表 1。
表 1 部分用于生防真菌基因标记的载体质粒和标记基因
质粒载体 标记基因 标记特性 生防真菌 应用实例
pBARGEM 7-2 bar g ene 抗 glufosinate ammonium P. f umosoroseus [ 3]
pGPDH-Bar. 1 bar g ene 抗 glufosinate ammonium P. f umosoroseus [ 3]
pJA4 bar g ene 抗 glufosinate ammonium P. f umosoroseus [ 3]
pBARKS / tel bar g ene 抗 glufosinate ammonium M . ani sop l iae var . acr id um [ 4]
pAN7- 1 H ygB g ene 抗潮霉素 B T . harz ianum [ 5]
T . v ir id e [ 6]
A . p ullulans [ 7]
pAN7- 2 H ygB g ene 抗潮霉素 B T . harz ianum [ 8]
P. f umosoroseus [ 9]
pH 1B H ygB g ene 抗潮霉素 BT . har z ianum; T . v ir id e [ 6]
pUCH 1 H ygB g ene 抗潮霉素 BT . har z ianum ; T . v i rid e [ 6]
pH 2S H ygB g ene 抗潮霉素 BT . har z ianum ; T . v i rid e [ 6]
pDH 25 H ygB g ene 抗潮霉素 BT . har z ianum ; T . v i rid e [ 6]
pH L1 H ygB g ene 抗潮霉素 BT . har z ianum ; T . v i rid e [ 6]
pH AT H ygB g ene 抗潮霉素 BT . har z ianum [ 10]
pNOM102 GUS g ene 裂解 X-Gluc,形成靛蓝色菌落 T . harz ianum [ 5, 8]
pBI121 GUS g ene 裂解 X-Gluc, 形成靛蓝色菌落 T . harz ianum [ 10]
pRESM6 -tu bul in g ene 抗 MDPC V . chlamyd osp orium [ 11]
pT EFEGFP GFP gene 产生绿色荧光菌落 T . harz ianum; [ 8]
V . chlamyd osp orium; [ 11]
A . p ullulans; [ 12, 7]
P. f umosoroseus [ 13]
pDH 33 H ygB g ene 抗潮霉素 B A . p ullulans [ 12]
pEGFP/ gpd/ tel GFP gene 产生绿色荧光菌落 M . ani sop l iae var . acr id um [ 4]
Note: P, Paecilomyces; M , M etarhizium ; T , T richoderma; V, Vert icilliu ; A, Aureobas idium.
3 基因标记的方法
真菌基因标记实质上是通过遗传转化实现的。
目前,生防真菌基因标记的途径是通过将携带标记
基因的质粒 DNA 异源插入真菌基因组,通过对转
化子的筛选而获得带标记基因的目标突变体。近年
来,真菌基因标记的方法取得了较大的进展, 建立了
多种基因标记转化方法, 如以限制酶介导( Rest ric-
t ion Enzyme-M ediated Integ ration, REMI )的插入
突变转化、以根癌农杆菌 T i质粒为载体的转化和以
聚乙二醇( Po lyethy lene Glyco l, PEG)介导的原生
质体转化等。总体来说, 真菌基因标记方法分为两
大类:一是以质粒载体为媒介的基因转移标记;二是
功能基因直接转移标记。
3. 1 以质粒载体为媒介的基因转移标记
目前,以质粒载体为媒介的基因转移标记方法
主要包括 PEG、限制酶、根癌农杆菌介导等 3 种方
法。
3. 1. 1 以 PEG 介导的基因转移标记方法 PEG
介导的基因转移标记是使用较早较普遍的基因标记
方法[ 3, 5, 6, 8, 12]。它是通过在培养物中加入聚乙二醇
等多聚物协助基因转移, 以促使原生质体融合实现
外源基因标记的方法。与 PEG 类似的多聚物还有
多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等,尤以 PEG应用最广,这
些多聚物和二价阳离子(如 Mg2+ 、Ca2+ 、Mn2+ )及
DNA 常在原生质体表面形成沉淀颗粒,通过原生质
体的内吸作用而被吸收。利用 PEG诱导原生质体
融合时要求原生质体具有较高的活力。
3. 1. 2 以限制酶介导的基因转移标记方法 限制
酶介导的基因转移标记是在限制酶介导下用质粒
DNA 转化真菌,通过质粒 DNA 的异源准随机插入
而使外源基因整合到受体菌染色体 DNA 上, 从而
直接获得基因标记菌株的新方法 [ 3, 14]。该技术是
Schiest l & Petes [ 14 ] 在研究酵母菌 Sacchar omyces
cerevi siae 时首先建立起来的, 利用 REMI 转化效
率可提高 7 倍, 并通过对 REM I 转化子的遗传和
Southern杂交分析证明外源 DNA 插入染色体基因
组单一不同位点。REM I插入突变机理尚不完全清
楚,可能是限制酶进入到细胞中, 真菌染色体 DNA
552006年第 1期 祝明亮:生防真菌基因标记技术研究进展
的相应限制酶位点被切开, 尽管大多数切点没有整
合外源 DNA 而重新连接,但也有可能外源 DNA 片
段的粘性末端与染色体 DNA 的粘性末端连接而插
入,切口( nick)由 DNA 连接酶封闭后形成转化子,
外源 DNA可造成插入位点的基因失活,通过对转
化子的表型筛选即可获得基因标记的突变体。该方
法操作简单,转化效率高, 单拷贝插入概率大, 转移
标记程序与其他转移标记方法相似,对大多数已实
现转移标记的真菌均实用。
3. 1. 3 以根癌农杆菌介导的基因转移标记方法
根癌农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌, 它能
够在植物的受伤部位侵染植物细胞, 将 T-DNA 转
入植物细胞并整合进植物的基因组,最终导致肿瘤
的发生。Heinemann 等[ 15] 发现大肠杆菌与酵母菌
能够通过接合的方式将前者的质粒转移到后者,
Bundock[ 16]等在这一发现和根癌农杆菌转化植物的
启发下, 1995年首次成功进行了根癌农杆菌介导酵
母菌的遗传转化。随后, 研究者利用这项技术进行
了其他丝状真菌的基因转移标记 [ 17~ 22]。由于该方
法具有操作简便, 转化子稳定,转化效率高等特点,
是一种很有前途的真菌基因转移标记方法。
3. 2 功能基因直接转移标记
功能基因直接转移标记是指利用真菌细胞的生
物学特性,通过物理化学方法将外源功能基因直接
转入真菌受体细胞的标记方法。这种直接转移标记
方法主要通过基因枪、电激、显微注射和激光微束穿
孔等方法实现, 其中以基因枪法在生防真菌基因标
记中应用最多[ 4, 9, 10] ,该方法是利用被放电或机械加
速的金属颗粒穿透目标真菌细胞壁,先将外源 DNA
(功能基因)溶液与钨、金等金属微粒共同保温, 使
DNA 吸附于金属颗粒表面, 然后放电加速金属颗
粒,使之直接射入受体真菌细胞,外源遗传物质随金
属颗粒进入真菌细胞内部, 从而实现功能基因直接
转移标记的目的。该方法的优点是转化真菌受体时
操作迅速、简单, 但转化真菌受体细胞的再生比较
困难。
4 基因标记在生防真菌上的应用
具备合适的载体质粒和标记基因后,通过高效
的基因转移标记方法, 就可对生防真菌进行基因标
记,并进一步实现检测生防真菌的目的。目前,生防
真菌基因标记主要集中于昆虫病原真菌和植物病害
生防真菌。
4. 1 昆虫病原真菌的基因标记
在昆虫病原真菌玫烟色拟青霉( Paeci lomyces
f umosorosens)的基因标记研究中, Barreto 等 [ 9] 以
潮霉素作为选择标记, 分别利用 PEG介导转化法和
基因枪法( Biolist ic)转化了该菌的原生质体和未分
化的分生孢子, 前者的转化率为每微克质粒 DNA
1. 9~ 2. 5个转化子, 后者则为每微克质粒 DNA 33
~ 153 个转化子。Cantone 等 [ 3, 13] 以除草剂 ( glu-
fosinate ammonium)为选择标记, 利用 REM I 介导
法转化了该菌,在供试的 3个质粒中, pBARGEM7-
2、pGPDH-Bar. 1和 pJA4 的转化率分别是每微克
DNA 15、10和 3个转化子, 在优化条件下, 前 2个
质粒的转化率分别达到每微克 DNA 69和 46个转
化子,其中 pBARGEM7-2 的最高转化率为每微克
DNA 110个转化子。Inglis等 [ 4]以除草剂( g lufos-i
nate ammonium)和绿色荧光蛋白( GFP)为选择标
记,用基因枪法转化了蝗虫生防真菌 Metarhizium
anisopliae var . acridum CG423, 2 个质粒的转化率
分别为每微克 DNA 4 和 88个转化子, 而它们的共
转化率为每微克 DNA 5个转化子。
4. 2 植物病害生防真菌的基因标记
木霉属( T richoderma)真菌由于被广泛用于许
多植物病害的生物防治, 为了准确检测其在不同环
境中的定殖、扩散及标记其致病基因等,该属真菌的
基因标记研究受到了研究者的重视。Siv an 等[ 6] 以
潮霉素 B作为选择标记, 用 PEG 介导法进行了 T.
viride T105-227 Nic-、T . harzianum T95-1 Lys- 和
T . harzianum T 12-2 H is-等 3 株木霉菌的基因标
记,在 6个载体中,质粒 pH1B和 pAN7-1的转化率
最高,分别为每微克 DNA 4. 2和 3. 8个转化子,而
质粒 pH1B 对供试的 3个菌株的转化率分别为每微
克 DNA 0. 12、5和 4. 2 个转化子。T hr ane 等[ 5] 以
-葡糖醛酸酶和潮霉素 B作为选择标记,用 PEG介
导法进行了 T . harzianum 分离株 T3的转化,其转
化率为每微克质粒 DNA 30个转化子。Lo 等 [ 11]以
-葡糖醛酸酶和潮霉素 B作为选择标记, 用基因枪
法进行了 T. har zianum 菌株 1295-22的遗传转化,
并以带标记基因的转化子研究了该菌在匍匐苇草
56 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 1期
( Creeping bentgrass)根际和叶面的定殖和分布情
况。Bae & Knudsen [ 8]以 -葡糖醛酸酶( GUS)和绿
色荧光蛋白( GFP)为选择标记, 用 PEG介导法进行
了 T. harzianum isolate ThzID1 的遗传转化, 并用
筛选出的带标记基因的稳定转化子检测了该生防菌
在土壤中的定殖、生长情况。Atkins等[ 11]以 MDPC
和绿色荧光蛋白作为选择标记, 转化了根结线虫生
防真菌 V. chlamydosporium,但未获得稳定的基因
标记转化子。
5 展望
在生物防治过程中, 准确掌握生防微生物在植
物根际和土壤中的消长规律, 是确定生防菌株开发
应用潜力的重要依据 [ 23] ,而且由于对一些作为生防
菌的遗传工程微生物( Genet ically Engineered M-i
croo rganisms, GEM)的基因进行了修饰改造, 插入
或切除了某个基因, 使其生防作用得到了加强,但它
们会不会在环境中任意转移扩散,是否对人类和其
他非目标生物造成不良的影响, 这些都是生物防治
研究中必须解决的问题, 而要解决这些问题, 首先必
须建立一套准确灵敏的检测方法,这就极大地促进
了生防真菌分子检测技术的发展。随着真菌基因标
记技术的不断发展完善, 必将为生防真菌的田间检
测和生态学研究提供有力手段, 进一步推动真菌在
植物病虫害生物防治中应用。
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