全 文 ：增强型生物除磷过程中聚磷酸盐积累
微生物的研究进展*
郑金伟 冉 炜* * 钟增涛 何 健
(南京农业大学资源环境学院, 南京 210095)
摘要 从磷污染控制、污水脱磷和磷资源角度论述了生物除磷的作用, 并着重论述了增强型生物除磷过
程中聚磷酸盐微生物( PAO)的研究历史、代谢特征及研究方法. 聚磷酸盐广泛存在于自然界, 但只有少数
PAO 微生物被分离、培养、鉴定出来. 培养基能否分离出 PAO 和 PAO 能否在实验室条件下表现出 polyP
积累特征, 均至关重要.糖原积累微生物( GAO)与 PAO 对碳源存在竞争关系,影响 EBPR 的效率. 原位荧
光分子杂交、激光共聚焦扫描电镜、微量放射自显影术、活体核磁共振光谱等现代科学技术的发展, 使我
们能够观察原位微生物群落组成、空间结构和功能变化. 对 PAO的深入研究, 可改进污水脱磷的效率, 提
高对磷在环境中迁移转化的认识.
关键词 生物除磷 聚磷酸盐 微生物
文章编号 1001- 9332( 2004) 08- 1487- 04 中图分类号 X172 文献标识码 A
Research Advance in polyphosphateaccumulating microorganisms in enhanced biological phosphorus removal
process. ZHENG Jinwei, RAN Wei, ZHONG Zeng tao, HE Jian ( D epar tment of Resour ces and E nv ir onmental
Science, Nanj ing Agr icultural Univer sity , Nanj ing 210095, China) . Chin. J . A ppl . Ecol. , 2004, 15( 8) : 1487
~ 1490.
This paper discussed the funct ion of enhanced biolog ical phosphorus removal ( EBPR) in P pollution contro l, P
containing wastewater treatment and P resources recover y, and summarized the metabolic characteristics, research
pro gress and methodologies of polyphosphateaccumulating o rganisms ( PAOs) . Although polyphosphate has been
found in many org anisms, only few of PAOs w ere isolated, cultured and identified. Culture medium formulation is
the key to isolate PAOs and to study t he micr obial accumulation of polyphosphate, and the competition of glyco
genaccumulating organisms ( GAOs) w ith PAOs for carbon resour ces is one of the reasons of low EBPR efficien
cy. Modern scientific methods such as fluorescent in situ hybr idization, confocal laser scanning microscope, mi
croautoradiogr aphy, and in vivo NMR spectroscopy, provided powerful tools to analyze PAO species composition,
spatial structure and functional properties under field conditions. T he knowledge of PAO is valuable to enhance
the P removal efficiency in water tr eatment plant, and to improve our understanding on P tr ansformation and
transferr ing in environment.
Key words Biolog ical phospho rus r emoval, Polyphosphate, M icr oo rganism.
* 国家自然科学基金资助项目( 40271098) .
* * 通讯联系人.
2003- 08- 15收稿, 2004- 02- 10接受.
1 引 言
当前,国内外对污水生物除磷中的主角 ! ! ! 聚磷微生物
本身的研究远远落后于对生物除磷工艺过程的研究, 而对水
体、土壤和沉积物环境中聚磷微生物的研究更少见. 本文从
环境磷污染控制、含磷污水处理和磷资源回收问题出发, 对
增强型生物除磷过程中聚磷酸盐积累微生物的研究进展进
行了综合论述,旨在为深入研究聚磷微生物的生理、生化和
生态学特征 ,进一步改良生物除磷工艺,深入理解环境中磷
的生物地球化学循环,提供一些相关的研究背景.
2 磷污染控制、含磷废水处理和磷资源回收
21 磷污染控制
磷是所有生物所必需的营养元素,但绝大部分水体的磷
养分常常不足,是生长限制性因子. 因此, 在合适条件下, 即
使磷较平缓地增加, 也会引起一连串的生态问题,包括植物
加速生长、藻类过度繁殖、溶解氧( DO )不断减少、pH 剧列变
化、水生动物死亡等. 这种现象被称为水体富营养化 ( eu
trophication) .各种污染源排放的磷进入河流、湖泊、湿地和
土壤生态系统后, 还会发生复杂的吸附、固定和再释放过程,
使严重污染的水体很难治理. 因此, 控制磷进入环境是控制
水体富营养化的基本策略. 目前迫切需要利用化学和生物学
方法, 去除城市污水、工业污水和农业 (包括农田和养殖场)
排水中的磷.
随着经济发展和城市化进程加快, 我国每年生产的大量
废水亟需处理. 据估计, 2000 年我国年废水排放量达 415 ∀
108 m3 ,其中生活污水 221 ∀ 108 m3 . 大部分城市污水未经
二级处理, 直接排入环境,只有约 15%的生活污水经过了传
应 用 生 态 学 报 2004 年 8 月 第 15 卷 第 8 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Aug . 2004, 15( 8)#1487~ 1490
统活性污泥处理.根据∃国家环境保护% 十五&计划∋ , 2005 年
我国城市污水处理率应达到 45% , 因此, 我国不仅亟需建设
大量的污水处理厂,而且污水除磷工作也刻不容缓, 不然国
家提出的% 到 2005年, 我国环境污染状况要有所减轻, 生态
环境恶化趋势得到初步遏制&的目标就难以实现.
22 含磷废水处理问题
221 传统型活性污泥处理法 以除去水中有机污染物和
氮为目的的传统二级活性污泥处理系统已有 90 多年的历
史,它能够去除废水中约 50% ~ 60%的磷, 但排水中磷仍高
达 4~ 6 mg(L - 1[ 22] , 而欧美国家的最大排污标准 1 mg(
L - 1 ,因此必须寻求其它除磷途径.
222 增强型生物除磷法 一般微生物体内磷含量约为细
胞干物质重的 2% 左右, 但某些微生物能% 奢侈&地吸收、累
积磷, 将水体中磷酸盐以聚磷酸盐( polyphosphate, polyP )颗
粒形式贮存于体内, 其细胞磷含量可达干重的 5% ~ 12% ,
因而被称为聚磷酸盐积累微生物( polyphosphate accumulating
or ganisms, PAO ) . 增强型生物除磷法 ( enhanced biological
phosphorus removal, EBPR)法是先经过一个厌氧过程, 随后
又经过一个好氧过程,选择性地富集 PAO, 从而达到污水除
磷的目的. EBPR 法在欧美国家应用已有约 10 多年历史, 基
本上能够将排水磷降至 1 mg (L - 1以下, 而且运行成本低,
得到世界普遍认可[ 20] . EBPR 运行的最大缺点是除磷效果
不稳定,主要是因为 PAO 和polyP 代谢的研究受技术条件所
限. EBPR 过程对污水处理系统设计者和运转操作者而言,
至今仍然是只% 黑箱&或% 灰箱& [ 16] , 因此亟需加强基础研究,
以充分发挥 PAO 的除磷功能,改善设计与运转参数.
223 化学沉降法 铝( A l3+ )、铁 ( Fe3+ )阳离子与正磷酸根
( PO3-4 )阴离子可形成沉淀,其 pH 作用范围与微生物活动的
适宜pH 范围相容,因此 Al3+ 和Fe3+ 被直接用于二级处理之
前或之后. 化学方法的最大优点是除磷能力强,可使排水中
磷浓度远低于 1 mg(L- 1 ,但其存在两个方面的问题: 一是由
于 Fe和 Al在水中以多种形态存在且存在其它阳离子的竞
争,形成每摩尔 FePO4 或 AlPO4 沉淀物, 需要加入数摩尔的
Fe盐或 Al盐,运行成本较 EBPR 高 5~ 7 倍; 二是污泥产量
比 EBPR高 2 倍多,由于 FePO4 和AlPO4 形态的磷植物不能
吸收,几乎不可能直接作为肥料, 必须经过回收处理, 而且一
般污泥中含有较高的重金属和其它难降解的有机污染物, 即
使污泥农用化,也需要进一步处理, 以便提高质量、确保农产
品不受污染,因此其深度处理成本也较高[ 20] . 但是,为了达
到更严格的排污标准(如 01~ 0 5 mg(L- 1 ) , 欧美日等国家
常将 EBPA过程与化学处理结合使用.
23 磷资源回收
由于高品位的磷矿资源日益减少、全球范围的河流与湖
泊富营养化问题和污水处理厂大量污泥有待处理, 1998 在
英国Warwick 和 2001 年在荷兰 Noordw ijkerhout 先后召开
了第 1次和第 2次磷回收问题国际会议.虽然回收技术和成
本目前仍在试验研究之中,但欧洲磷工业联合研究会第一阶
段(文献综述和专家调查)的工作已于 2001 年得到初步结
论: 1)回收污水处理厂污泥磷在技术上是可行的,生物处理
法污泥磷较易回收, 化学处理法污泥磷较难回收; 2)回收磷
的经济可行性还不能得到最终结论[ 9] .研究高效 polyP累积
微生物无疑会促进磷回收工业的发展.
3 聚磷酸盐积累微生物和聚磷酸盐代谢
3 1 EBPR过程与聚磷酸盐积累微生物( PAO)
1959 年 Srinath 等报道,活性污泥微生物生长在通气条
件下从水中除去的磷比维持正常生长所需要的磷高得多.
1965 年 Lev in 等首次建立了观察生物除磷的装置, 发现活性
污泥只有在不通气且有污水 (底物 )加入时, 才有磷释放现
象,随后在通气条件下才发生除磷现象, 因此指出这是一个
微生物主导的过程, 后来该过程被称之为 EBPR .此后 10 年
间,许多污水处理工程师试图解释生物除磷现象,均未有重
大突破, 这主要是由于当时缺乏环境微生物理论的指导[ 24] .
虽然迄今对 EBPR 过程中的微生物和生物化学过程仍缺乏
了解,但环境工程师们并没有放弃努力, 在整个 20 世纪 80
年代经过大量现场观察试验和改进, 使 EBPR 过程得到认
可, 目前在欧美日等国家得到广泛应用.
1975 年 Fuhs 等建立了一套观察和分离活性污泥中微
生物的体系, 分离出 A cinetobacter 属细菌. 此后的 10 多年
中,其它研究者利用该体系总是能分离出相同的细菌, 因此
过去人们一直认为 PAO主要是该属细菌.但 1990 以来用非
培养的方法如二氨基丙烷生物指示法和荧光原位杂交法
( fluorescent in situ hybr idisation, FISH)对 EBPA 污泥的研究
发现, Acinetobacter 只是 PAO 的一个属, 而且通常不是优势
种, 其它微生物 如 Aeromonas、A r thr obacter、Beyer inkia、
K lebsiella, M icrolunatus、Morax ella、Nocardia、Ozotobacter、
Pseudomonas 和Rhodocy clus 等属的一些种的细胞中也含有
polyP颗粒, 并且可能在 EBPA 过程中起主要作用[ 22] . K ong
等[ 10]用 FISH 技术分析了好氧厌氧循环反应器中微生物群
落组成变化, 发现当 C/ P比率由 1#10 转换到 1#50 时, Pro
teobacteria 类细菌由占细菌总数的 77% 降至 38% , 与
Rhodocyclus 相关的 PAO 细菌比例及生物量磷也随之下降,
并且没有检测到 Acinetobacter 属的存在, 从而对 Acinetobac
ter 属在污水脱磷中的地位也提出了质疑.
此外, 20世纪 90 年代还发现, EBPR 过程可能会由于
% G& 细菌, 即糖原积累微生物( glycogen accumulating org an
ism, GAO) 大量繁殖而达不到除磷效果[ 4, 15 ] . PAO 与 GAO
的区别在于: 在 EBPR过程的厌氧阶段,细胞缺乏电子受体,
但有丰富的碳源(电子给体) , PAO 细胞内 polyP 降解为无机
磷酸盐, 并从细胞中分泌出体外,以增加跨膜质子梯度,通过
质子同向运转泵, 碳被吸收并以聚烃基链烷酸酯 ( po lyhy
droxyalkanoate, PHA )或 聚烃基丁酸酯 ( po lyhydroxybu
tyrate, PHB)的形式贮存在细胞内; GAO不释放磷酸,但会将
大量碳源以糖原( glycogen)聚合物的形式累积在细胞内. 在
随后的好氧阶段, 电子受体 (氧)丰富, 但碳源缺乏, 累积在
PAO 细胞内的 PHA 降解和代谢, 同时大量吸收环境中的
1488 应 用 生 态 学 报 15卷
磷,产生大量的 ATP , ATP 不断合成 polyP, 出现 polyP 累积
和糖原累积,好氧阶段细胞从环境中吸收的无机磷酸盐( Pi)
远大于厌氧阶段细胞分泌而进入环境中的 Pi, 因而 PAO 具
有去除废水磷的功能, 而 GAO 无 ployP 积累作用[ 16] . 与
PAO相比, 目前对 GAO 的了解更少[ 6] .
GAO与 PAO可利用的碳源均为小分子有机碳,如乙酸
和葡萄糖等,因此二者存在激烈的竞争(碳源)关系, 当 GAO
占优势时, EBPR 过程丧失除磷作用.
虽然有许多研究者报道了在 EBPR 过程中 polyP、PHA、
PHB 和糖原等生物聚合体代谢循环的的生物化学模型, 但
是解释这些物质代谢的结论性的实验证据尚不充分[ 14] . 研
究这些生物聚合体的代谢与调控机制, 对于设计更加有效
的、更加可靠的和更加经济的处理原型非常迫切, 预期应用
蛋白质体( pr oteomic)和功能基因组 ( funct ional genomic)技术
可详细了解 EBPR的生物化学机理.
32 polyP功能及其代谢酶
polyP 是由 3 至数百个正磷酸根残基通过高能磷酸酐键
连成的线性聚合体[ ( PnO 3 n+ 1 ) - n - 2] . polyP 广泛存在于自
然界,已经在细菌、真菌、原生动物、植物和哺乳动物中检测
到其存在[ 13] . 虽然polyP 分子在地球上出现的时间很可能比
核酸、蛋白质和多糖等更早, 但对 polyP 的研究却长期被忽
视,这主要是由于缺乏灵敏的、准确的和易操做的分析方法
来测定 polyP在生物体内的浓度. 20 世纪 80 年代中期, 提出
了几种定量化细胞内 polyP 的方法, 如高效液相色谱[ 2] , 核
磁共振波谱[ 19]和酶分析法[ 22]等. 近 10 年来随着现代分子
生物学方法的发展, 越来越多的学者对 polyP 的研究有兴
趣.研究表明, 根据物种、细胞定位和生理条件的差异, polyP
在生命系统中有许多种作用,其主要功能有: 贮存磷和能量,
螯合和贮存阳离子,构成膜通道和泵, 参与磷运转,参与细胞
包膜形成与活动,控制基因活性, 调控酶活性,调控胁迫响应
等[ 11, 12] .在原核生物中, polyP 最重要的功能是贮存能量和
磷;在真核生物中主要起各种调控作用.除在生物中具重要
功能外, polyP也是一种安全的食品添加剂、潜在的抗菌剂、
环保上应用的重金属螯合剂及海洋交通上应用的防锈剂, 目
前 polyP应用研究正受到广泛的重视.
polyP 是由 polyP 激酶 ( polyP kinase, PPK)合成的. PPK
催化 ATP 的末端磷酸盐可逆地转移到长链聚磷酸盐
( polyP)上,形成长度可达 1 000甚至更长的正磷酸盐的线性
聚合体. 在有过量 ADP存在时, 它可反向作用形成 ATP. 它
也可利用 GTP 代替 ATP 形成 polyP, 但 GT P 的效率仅为
ATP 效率的 5% . 催化活度: ATP + { polyP }N = ADP +
{ polyP} N + 1. 已经从 Escher ichia coli 中得到纯的 PPK, 编码
PPK 的基因( ppk)也已被克隆出来, 并得到表达[ 1] . 从许多
其它生物中获得的类似基因也被克隆出来了[ 24] .
无机磷酸盐( Pi)通过 polyP 水解酶作用可从 polyP 中释
放出来. 一种能催化除去 polyP 末端磷酸盐反应的 po lyP 水
解酶( exopolyPase, PPX ) , 也被从 E coli 中纯化出来, 它与
PPK 具有同源性,编码 PPX 的基因位于与 ppk 相同的操纵
子上. PPX催化长度约 500 个残基的 polyP 不断释放出 P i ,
但对长度约 15 个残基的短链 polyP 的催化效率不高. 催化
活度: { polyP} N+ H2O= { polyP} N - 1+ P i.
polyP的聚合与解聚, 即 PPK 和 PPX 酶活性, 强烈受细
胞生长的碳源和磷酸盐水平变化调控.研究表明,在碳源丰
富的条件下生长时, polyP 积累, 相反, 在碳源缺乏的条件下
生长, polyP 降解; PPK 酶活性只是在有过量磷酸盐加入时
才有提高, PPX酶活性在磷饥饿条件下迅速增加.
3 3 EBPR过程微生物群落结构特征的研究方法
过去 10年在环境基质检测微生物的方法取得很大进
展,这些方法正在用于研究微生物生态学. 16S rRNA 基因
( rDNA)克隆和序列分析使我们能够了解自然和生物工程系
统中微生物群落结构的特征知识[ 5] . 荧光分子探针、F ISH、
激光共聚焦扫描电镜、微量放射自显影术、活体核磁共振光
谱( in v ivo NMR spectroscopy)等技术的发展使我们能够观察
原位微生物群落模式和环境因子变化下种群的动态变
化[ 25] .生物标记物、细胞脂肪酸和呼吸作用苯醌被用于细菌
分类中, 以界定不同细菌属、种和株的分化特征.
最近几年来, 变性梯度凝胶电泳技术( DGGE)越来越多
地用于解析 PCR 扩增后的 16S rRNA 基因片段. 在 DGGE
的丙烯酰胺凝胶上, 变性剂以线性递度增加, 当 16S rRNA
基因片段通过电泳时发生解析. 根据解析出来的片段的数量
和影像强度可估计出优势种的多样性,片段经切割、纯化后
测序. DNA序列分析结果使我们能够深入不同种群在种系
发生上的亲缘关系[ 19] .将生物标记法和基于 16S rRNA 基因
的技术结合起来可以大大提高对不同系统微生物群落特征
的认识.
3 4 PAO的分离、培养、鉴定及 polyP的积累特征
虽然用分子生物学技术了解到 PAO 的生物多样性, 并
且可以监测 PAO 种群的变化, 但是直到 1995 年, 还没有其
它 PAO被分离和鉴定出来, 使深入研究 EBPR过程中微生
物学和生物化学机制受到限制. 究竟该怎样筛选 PAO? 如
何在厌氧- 好氧条件下分离和培养 PAO? 这些问题目前还
没有公认的答案. Muyima 等[ 17]认为, 缺乏合适的培养基是
PAO 难以分离培养的主要原因. Nakamura等[ 18]从活性污泥
中分离出属于一种新属的 PAO新种 ( Micr olunatus phospho
vorus ) , 它的细胞磷含量可达细胞干重的 13% . 1999 年 Sidat
等[ 23]从活性污泥混合液体中分离出了 17 种细菌, 其中
Acinetobacter spp、Pseudomonas spp、Aeromonas spp、
Morax ella spp、Enter obacter spp 和 Bacillus cereus 能够大量
吸收磷, 属于 PAO. Maszenan 等[ 15]从活性污泥中分离出了
属于一种新属 ( Tetrasphaera ) 的两个新 PAO 种 ( T etr as
phaera japonica 和 Tetrasphaera austr aliensis ) . 最近 Hanada
等[ 7]也从活性污泥中分离到了 Tetrasphaera 属的一个新种
( T etr asphaera elongata) .
3 5 自然环境中是否也存在 PAO?
近 10 多年来 16S rRNA 基因序列分析表明, 活性污泥
中仅有不到 10% ~ 15%的微生物被人们所认识, 这些微生
14898 期 郑金伟等:增强型生物除磷过程中聚磷酸盐积累微生物的研究进展
物仅相当于其它自然环境中微生物种数的 1% . 1995 年
Hupfer 等[ 8]用31P核磁共振波谱技术, 分析了富营养湖泊底
泥中非活性磷的类型, 发现 31% ~ 35% 的非活性磷为
polyP .最近 Khoshmanesh 等[ 10]的研究表明 ,湿地沉积物中存
在% 奢侈& 地吸收磷的微生物, 并且用透射电子显微镜
( TEM )观察到了 polyP 在 76% ~ 80%的培养细胞中存在,
polyP 主要以大颗粒方式而不是以分散的小颗粒方式存在于
细胞中, 同时用 31P核磁共振波谱方法检测到大量 po lyP 的
存在.这两项研究肯定了细菌在湖泊底泥磷的固定与释放中
起重要作用和自然界 PAO 的存在,但均未对 PAO细菌进行
分离鉴定.
虽然用传统培养方法能从 EBPR 过程中分离出 Acine
tobacter 属细菌, 但在纯培养条件下 Acinetobacter 并不能在
厌氧过程中积累 PHA 或 PHB, 不表现出大量吸收磷的特
征[ 24] . 这种现象目前仍然是一个谜. Balestr a等[ 3]认为, 找到
合适的培养基是关键.因此, 培养基不应只用一种,而应观察
同一种菌在一系列培养基上的生长状况. 2002 年 Reddy
等[ 21]用 3 种培养基研究了 EBPR 过程中混合活性污泥液体
中的 PAO, 指出培养基对能否分离出 PAO和 PAO能否在实
验室条件下表现出 polyP积累特征均至关重要.
4 展 望
从活性污泥和环境中分离出可培养的 PAO仍是一项具
有挑战性的工作.通过生长条件和培养基的改良, 传统微生
物学方法可在 PAO 分离、培养、鉴定中挥重要作用. 应用
PCR、DGGE 和 F ISH 等现代生物技术,研究增强型生物除磷
过程中微生物的群落结构和原位观察 PAO 种群的动态变
化,对改良污水处理工艺参数、提高污水脱磷效率具有重要
意义.研究环境(如稻田、湿地)中 PAO , 将会提高我们对磷
的生物地球化学循环的认识.
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作者简介 郑金伟, 男, 1973 年生,讲师,主要从事重金属污
染和水体富营养化研究. Email: zhb@ njau. edu. cn
1490 应 用 生 态 学 报 15卷