全 文 ：组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
表 2　两组患者治疗前后 T、RR、HR
和WBC变化(n=20 , x ± s)
指标 治疗前 治疗后3d 治疗后 7d
T(℃)　
　　对照组 38.65±0.52 38.59±0.68 37.61±0.56＊
治疗组 38.60±0.64 37.73±0.51＊■ 36.90±0.66＊＊
HR(次/min)
对照组 105.54±11.91 101.84±12.52＊ 96.41±12.28＊＊
治疗组 104.63±12.55 98.43±11.56＊＊■90.90±12.17＊＊■
RR(次/min)
对照组 22.88±5.21 21.67±3.02 20.01±2.56＊
治疗组 23.10±4.98 19.05±2.61＊＊■ 17.30±3.12＊＊■
WBC(×109/L)
对照组 13.77±4.17 13.26±3.68 12.01±2.29＊
治疗组 13.80±3.89 13.02±3.10 10.82±2.61＊＊■
　与本组治疗前比较＊P<0.05 , ＊＊P<0.01;与对照组相应时间点比较
■P<0.05
2.2　临床疗效　治疗组治疗后 SIRS 炎性症状 3d 内明显
改善比例较对照组多 ,MODS 发生率也较对照组少 , 死亡人
数较对照组少 ,差异均有统计学意义(P <0.05),见表 3。
表 3　两组患者治疗效果及 MODS发生率
比较(n=20 ,例)
组别 SIRS持续<3d(%)
SIRS持续
>3d(%)
发生MODS
数(%)
死亡数
(%)
对照组 7(35.0) 12(65.0) 11(55.0) 6(30.0)
治疗组 15(75.0) 5(25.0) 5(25.0) 2(10.0)
P 值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05
3　讨论
目前普遍认为:当机体受到各种严重感染 、创伤(包括
手术)、烧伤 、休克 、胰腺炎以及再灌注损伤等感染与非感染
因素刺激时引起损伤或打击过大 , 机体的炎症反应容易失
控 ,从而形成 SIRS。 这种连锁性的反应一旦触发 , 即使原
发因素消除或减弱 ,反应仍可继续 , 最终可发展为低血压或
MODS。后者是导致死亡的主要原因 , 故 SIRS 与 MODS 存
在密切的联系 ,及时控制 SIRS 是治疗成败的关键[ 4] , 并成
为近年来普遍关注的焦点。乌司他丁是从健康成年男性新
鲜尿液中分离纯化出来的一种糖蛋白 ,是一种胰蛋白酶抑
制剂 , 最早被应用于临床治疗急性胰腺炎。近年来研究显
示 , 乌司他丁不仅可抑制多种蛋白酶 、糖和脂类的多种水解
酶的活性 , 还具可抑制心肌抑制因子(MDF)的产生 ,改善休
克时的微循环状态 , 稳定溶酶体膜 , 抑制溶酶体酶的释放 ,
抑制炎症介质的过度释放以及清除氧自由基等多种特殊的
药理作用[ 4] 。
本实验中观察到治疗组的 20例 SIRS 患者炎性症状 3d
内明显改善比例较对照组明显增多;脏器功能障碍的发生
率和病死率明显下降 ,提示乌司他丁可较早控制 SIRS 的发
展 , 阻断 SIRS 向MODS 发展 , 在降低MODS 的发生率中发挥
重要作用。
参考文献:
[ 1] 　American College of Chest Physicians/ Society of Critical
Care Medicine Consens-us Conference.Definitions for
sepsis and organ failure and guide-Lines for the use of in-
novative therapies in sepsis[ J] .Crit Care Med , 1992 , 20:
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(责任编辑:路锦绣)
文章编号:1005-8486(2006)06-0551-03
·技术与方法·
鹅绒藤全植株中巯基蛋白酶的提取 、纯化及部分性质研究
杨　怡 , 　张淑雅 , 　芦晓红 , 　裴秀英
(宁夏医学院生物化学与分子生物学教研室 , 银川　750004)
摘要:为了从鹅绒藤(Cynanchum chinese R.Br.)全植株中提取 、纯化巯基蛋白酶并进行部分性质研究 , 采集全
植株 ,粉碎后用盐析 、凝胶层析 、离子交换层析方法纯化蛋白酶。结果 ,得到两种活性蛋白 ,其中一种经 SDS-
PAGE鉴定为均一条带 , 分子质量 15.8KD;作用最适 pH 7.0 , 最适温度 50℃。对 Hb A -β 链水解的 Km 值为
1.23×10-6 mol/ L。巯基酶抑制剂 、保护剂实验提示该酶为巯基蛋白酶。结论 , 实验流程简洁可行 , 提纯得到
的蛋白酶纯度较高 、得率中等。
关键词:蛋白酶;鹅绒藤;分离提纯
中图分类号:Q55　　　文献标识码:B
收稿日期:2006-05-18
作者简介:杨怡(1973-),女(回族),甘肃人 ,讲师 , 硕士 ,从事生物
化学教学工作。 E-mail:yangyi73422@163.com.
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宁夏医学院学报
Journal of Ningxia Medical College
　　蛋白酶制剂目前在食品工业 、日用化工 、制革 、医药等
诸多方面有着广泛应用 , 而植物来源蛋白酶由于其原料丰
富 、安全 、成本低 、分离提纯简便等特点 , 已成为蛋白酶的重
要来源 ,其中以木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的研究 、应用最具
有代表性。宁夏地区广泛分布的植物“鹅绒藤”(Cynanchum
chinese R.Br.),俗称羊奶角角 、牛皮消 , 系萝摩科鹅绒藤属
(Cynanchum)植物[ 1] 。本文改良了传统的材料提取方法 , 简
化试验流程 ,并对提取得到的蛋白酶的性质 、功能作一深入
研究。
1　材料与方法
1.1　材料
试验用“鹅绒藤”植株为 6～ 7 月份采自宁夏银川市市
郊;Sephadex G-25 为 Pharmacia产品;DEAE-纤维素 DE-
32 为Whatman 产品;酪蛋白为 Serva产品;N , N , -亚甲基双
丙烯酰胺为上海生物化学试剂公司进口分装产品;其它试
剂均为国产AR级 , 所有试剂均用去离子水配制。
1.2　方法
1.2.1　蛋白质浓度测定:按改良 Lowry 氏法进行[ 4] 。
1.2.2　蛋白酶活性测定:酶活性单位规定 pH 8.0、37℃、
30min ,催化酪蛋白产生 1μmol酪氨酸所需的酶量为鹅绒藤
蛋白酶的一个活性单位。
1.2.3　蛋白酶活性测定方法:
表 1　蛋白酶活性测定操作步骤
试剂(mL) 管　　号测定管 空白管 标准管 调零管
1%酪蛋白 1.0 1.0 1.0 1.0
PBS(pH 8.0) 1.8 1.8 1.7 2.0
不同浓度蛋白酶液 0.2 0 0 0
酪氨酸标准液(2μmol/mL) 0 0 0.1 0
15%三氯醋酸 1.0 0.2 0.2 1.0
　　静置 ,过滤 , 分别取滤液1.0 mL, 分别加入 Folin-酚试
剂甲 5.0 mL、Folin-酚试剂乙 0.5 mL, 室温放置 30min ,
650nm 下比色 , 按以下公式计算活性单位:
活性单位=A测定管×A空白管
A标准管×A空白管 ×0.2×
1
0.2
1.2.4　鹅绒藤植株中蛋白酶的提取 、纯化:
1)全植株粉碎　取于清晨新鲜采集的干燥鹅绒藤植株
150g用 pH 8.0 PBS 缓冲液冲洗后加入 pH 8.0 PBS 缓冲液
120 mL混合 , 置于组织捣碎机中离心(10000 r/min), 捣碎
5min后滤过 , 获得滤液 335 mL。
2)硫酸铵沉淀　取滤液置于 500mL烧杯中 , 置磁力搅
拌器上缓慢搅拌 , 于 10min 内加入固体硫酸铵至饱和度
10%,继续搅拌 30min , 将混合物 3000r/ min , 离心 15min , 移
出上清 ,记录体积 , 沉淀用 50 mL pH 8.0 PBS 缓冲液溶解后
收集置于 4℃冰箱保存。移出的上清继续加硫酸铵至饱和
度分别为 20%、30%、40%、50%、60%、70%, 对每一饱和度
计算沉淀蛋白的含量 、活性和比活 ,分析比较上述结果 , 确
定硫酸铵沉淀的应用条件。依上述方法制备 100 mL滤液 ,
进行硫酸铵沉淀。
3)Sephadex G-25 凝胶过滤　用 PBS(pH 7.15 , 0.005
mol/ L)溶解沉淀至约 35 mL , 4℃对 PBS(pH 7.15 , 0.005 mol/
L)透析 , 浓缩至体积约为 15 mL, 冰冻干燥。干燥后的样品
用 PBS(pH 7.15 , 0.005 mol/L)溶解上 Sephadex G-25 柱
(ф2.6cm×80cm), 以含 NaCl 0.15mol/L的 PBS 洗脱 ,流速 40
mL /h。
4)Sephadex G-75 凝胶过滤　收集 Sephadex G-25 凝
胶过滤后高活性峰 1 , 透析 、浓缩后上 Sephadex G -75 柱
(ф2.6cm× 80cm), 以含 NaCl 0.15mol/L 的 PBS 洗脱 , 流速
35 mL /h。
5)离子交换层析　收集 Sephadex G-75 凝胶过滤后活
性峰 1-1 ,透析 、浓缩后上预先用 pH 8.6 、0.005 mol/ L PBS
平衡的 DEAE 纤维素 DE-32 柱(ф1.2cm×34cm)。平衡液
洗脱 2 个柱体积后进行 0 ～ 0.6 mol/ L NaCl梯度洗脱 , 得 2
个活性峰。分别收集高活性峰 ,透析 、浓缩 、冻干保存。
1.2.5　分子量测定:对 DEAE 纤维素 DE-32 离子交换层
析获得的高活性峰 1-1-1 进行分子量测定 , 方法采用常
规 PAGE和 SDS-PAGE[ 5] 。
1.2.6　酶动力学测定:对 DEAE 纤维素 DE-32 离子交换
层析获得的高活性峰 1-1-1 采用常规方法测定最适温
度 、最适 pH、激动剂 、抑制剂 、Km[ 6] 。
2　结果
2.1　饱和硫酸铵沉淀范围的确定　干燥鹅绒藤植株 150g
粉碎后获得全植株粉碎液335 mL ,其蛋白质浓度为 910.2μg/
mL ,总活性3068 U , 总蛋白含量 305.0 mg ,比活 10.06 U/mg。
将硫酸铵分段盐析后蛋白质活性测定结果见表 2。
表 2　硫酸铵分段盐析后蛋白质活性测定
馏分
(%)
总体积
(mL)
蛋白质浓度
(μg/ mL)
总活性
(U)
总蛋白含量
(mg)
比活
(U/mg)
0～ 50 27.35 5.914 1.368 4.323
10～ 11 30.95 3.527 0.340 10.37
20～ 20 106.9 23.82 2.318 10.28
30～ 14 142.7 85.44 1.998 42.76
40～ 7 132.9 19.04 0.930 20.47
50～ 10 146.1 96.56 1.461 66.09
60～ 25 128.1 19.21 3.203 6.002
70～ 80 20 91.05 69.20 1.821 38.00
80%沉淀
后上清液 340 19.25 314.2 6.545 48.01
　　表 1 结果表明 , 全植株粉碎液经硫酸铵分段盐析时在
30%～ 90%范围内 ,蛋白酶的比活最高 , 此范围确定为分离
纯化时的有效范围。依照上述有效范围 , 制备 100mL全植
株粉碎液 , 采用硫酸铵 30%～ 90%分段盐析 , 沉淀 、透析 、
浓缩保存。
2.2　鹅绒藤植株蛋白酶的提取 、纯化流程　结果见表 3 ,
总产率 21.07%;总纯化倍数 41.67。
2.3　Sephadex G-25 凝胶过滤　获得具有蛋白酶活性的活
性峰 7 个 ,收集高活性峰 1 ,透析 、浓缩 、低温保存 。
2.4　Sephadex G-75 凝胶过滤　将 Sephadex G-25 凝胶过
滤得到的峰 1 进行 Sephadex G-75 凝胶过滤层析 , 获得两
个活性峰 , 收集活性较高的峰①, 透析 、浓缩 、低温保存。
2.5　DEAE 纤维素 DE-32离子交换层析　Sephadex G-75
凝胶过滤获得的活性较高的峰①上 DE-32 离子交换层
析 , 洗脱得到两个结合蛋白峰 , 分别收集 、透析 、浓缩 、低温
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保存 ,并命名为蛋白酶Ⅰ 、蛋白酶Ⅱ 。
2.6　分子质量测定　取低温保存的DE-32离子交换层析获
得的活性蛋白酶Ⅰ进行分子量测定 ,结果见图1。
表 3　鹅绒藤蛋白酶的提取 、纯化流程
流　程 总体积(mL)
蛋白质浓度
(mg/mL)
活性
(U/mL)
比活
(U/mg·pro)
总活性
(U)
产率
(%)
纯化倍数
(倍)
全植株粉碎液饱和硫酸铵 100 0.910 9.158 10.06 915.8
30%～ 90%范围沉淀 70 0.721 7.879 10.93 551.5 60.22 1.086凝胶层析 Sephadex G-25中的活性峰 1 50 0.058 5.050 87.07 252.5 27.57 8.655
峰 I 上凝胶层 Sephadex G-75获得活性峰 1-1 60 0.014 3.698 264.1 221.9 24.20 26.25
DE-32离子交换层析获得的高活性峰 1-1-1 50 0.008 3.591 448.9 179.6 19.61 44.62
图 1　SDS-PAGE测定活性蛋白酶Ⅰ分子量
根据 SDS-PAGE 所示结果作标准曲线 , 由电泳图测得
蛋白酶的迁移率为 0.680 , 代入标准曲线计算蛋白酶的分子
量为 15.8kD。
2.7　酶动力学测定
2.7.1　温度对鹅绒藤蛋白酶活性的影响:结果如图 2 所
示 ,该酶的最适温度为 50℃。
图 2　温度对蛋白酶Ⅰ活性的影响
2.7.2　pH 对鹅绒藤蛋白酶活性的影响:结果如图 3 所示 ,
酶的最适 pH为 7.0。
图 3　pH对蛋白酶Ⅰ活性的影响
2.7.3　酶的Km 值的测定:该酶的Km 值为 1.23×10-6mol/L。
2.7.4　蛋白酶抑制剂和保护剂的影响:蛋白酶抑制剂为 1
×10-3mol/L , 巯基酶抑制剂碘代乙酸对该酶活性的抑制率
为 85%,丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟对该酶的抑制
率为 27%, 巯基酶保护剂二硫苏糖醇(dithiothreitol , DTT)对
该酶活性的保护率为 99%,提示该酶为巯基蛋白酶。
3　讨论
据文献记载 ,鹅绒藤根能祛风解毒 、健胃止痛;主治小儿
食积;茎乳汁外敷可治疣赘[ 5] 。在前期试验中我们已经证实
鹅绒藤乳汁中含有巯基蛋白酶[ 6] ,根据其结构特点可归于菠
萝蛋白酶家族 ,对于鹅绒藤植株内蛋白酶的研究将在药用、
轻工业方面有潜在研究价值 , 但是前期工作中的采样方式过
于繁杂 ,不利于大规模工业提取 ,我们本实验采用全植株粉
碎 、盐析 、Sephadex G-25 凝胶层析 、Sephadex G-75 凝胶层
析 、DE-32 离子交换层析提取获得了两种蛋白酶, 其中一种
已纯化至SDS-PAGE 均一, 但是经等电聚焦实验显示为两
条条带 ,提示该种蛋白酶内含有两个分子量接近 、等电点不
同的酶组分。酶活性的激活和抑制实验表明该酶组分为巯
基蛋白酶 ,这与目前的已知大部分植物蛋白酶属巯基蛋白酶
的规律相符。比较本次实验所得的蛋白酶最适温度范围、最
适 pH 条件 、km 值等指标发现本方法得到的蛋白酶与通过采
集鹅绒藤乳汁进行纯化得到的蛋白酶的理化性质非常接近,
两种酶的活性及相关性质的差异可能是由于提取手段、操作
流程的不同造成。作为轻工业使用本实验纯化流程已达到
实验目的。根据菠萝蛋白酶家族内其它物质的提纯经
验[ 7-8] , 如将鹅绒藤植株内提取的蛋白酶应用于医药领域,
仍需在酶的精制方面做出进一步的改进与研究。
参考文献:
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(责任编辑:路锦绣)
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