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木瓜蛋白酶制备山杏源降糖肽工艺优化研究
王 晟，崔 洁，顾 欣，张乔会，王建中*
( 北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083)
摘 要:通过单因素和响应面方法，确定了木瓜蛋白酶水解山杏仁蛋白制备降血糖粗肽的工艺。结果显示，其较优工
艺条件为: pH7，温度 50℃，料液比 6，加酶量 3%。采用该工艺条件，酶解液对 α－糖苷酶抑制率为 14.22%，冻干粉 IC50
值为 0.08g /mL。以上结果表明，在此工艺条件下制备的山杏源降血糖肽有很好的降血糖活性。
关键词:山杏蛋白，木瓜蛋白酶，降糖，响应面分析
Optimization on preparation of hypoglycemic peptides from
apricot( Armeniaca sibirica) hydrolyzed by papain
WANG Sheng，CUI Jie，GU Xin，ZHANG Qiao－hui，WANG Jian－zhong*
( College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China)
Abstract: The optimum preparation condition of hypoglycemic peptides from apricot ( Armeniaca sibirica )
hydrolyzed by papain was determined by the single factor and the response surface analysis.The results showed
that the optimum hydrolysis conditions were as follows: pH7，temperature 50℃，solvent ratio 6，the enzyme amount
3% ( w/w) .The inhibition ratio to α － glucosidase was 14.22%，and the IC50 value was 0.08g /mL.The peptides
prepared under the achieved condition had a decent hypoglycemic effect.
Key words: apricot protein; papain; hypoglycemic effect; response surface analysis
中图分类号:TS218 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2014)09－0169－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2014． 09． 028
收稿日期:2013－09－12 * 通讯联系人
作者简介:王晟( 1988－ ) ，男，硕士研究生，研究方向:农产品加工与贮
藏工程。
基金项目:林业公益性行业科研专项( 201004081) 。
糖尿病已经成为继肿瘤、心脑血管疾病之后的
第三大人类杀手，其中多为Ⅱ型糖尿病［1］，目前口服
使用的阿卡波糖等降血糖药物存在着价格昂贵和有
恶心呕吐等不良反应的缺陷［2］。具有降血糖功效的
天然产物很好地弥补了这些缺陷，其中多为多糖类，
如苦瓜多糖、桑黄多糖、地参多糖等［3－4］。多肽类降
血糖产物也逐渐成为研究热点，已经有苦瓜肽、人参
多肽、灵芝肽、鲨鱼肝肽等被证明有降血糖活性［5－9］。
山杏仁含 27%的蛋白质，氨基酸种类齐全，平衡合
理，是一种优良的植物源蛋白质［10］，榨油之后的山杏
仁粕更是蛋白含量高达 41.60%［11］，而这些山杏仁粕
却常常被直接丢弃，没能得到充分利用。木瓜蛋白
酶具有耐高温、活性强、稳定性好等特点［12］，在多肽
研究中是一种常用的酶。刘雪峰［13］等的研究表明杏
仁肽具有降血糖活性，但原料和所使用的酶都和本
研究不一样。本研究使用木瓜蛋白酶水解脱脂山杏
仁粕，探究制备具有降血糖活性的肽的工艺条件，为
山杏仁粕的进一步开发利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
脱脂山杏仁粕 河北省平泉县;木瓜蛋白酶(50
万 U /g)、α－葡萄糖苷酶、4－硝基苯－α－D－吡喃葡萄
糖苷(PNPG) Sigma Chem.Co.;其余试剂 均为分
析纯。
FD－1 冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限
公司;D － 37520Osterode 型冷冻离心机 Thermo
Scientific;Model 680 Microplate reader 酶标仪 BIO－
ＲAD;HHS4 型恒温水浴锅 上海浦东跃新科学仪器
厂;PHS－25 型 pH计 上海精密科学仪器有限公司;
气引式粉碎机 日本佑崎有限公司;SHZ－D 循环水
式多用真空泵 上海振捷实验设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 脱脂 将脱脂山杏仁粕粉碎后用石油醚浸
泡，每天更换石油醚反复多次直至脱脂彻底。抽滤
除去石油醚后，置于通风橱中静置晾干，过 80 目筛，
于 4℃保存备用。
1.2.2 蛋白质的提取 碱提酸沉法提蛋白［14］，具体
工艺流程如下:脱脂山杏仁粉→碱提( 液料比 14 ∶1，37℃，
60min，pH9.0) →离心( 4000r /min，20min ) →上清液→酸沉
( pH4.1) →离心( 5000r /min，15min) →沉淀→复溶( 调 pH 至
中性) →冷冻干燥→山杏仁蛋白粉
1.2.3 酶解条件
1.2.3.1 单因素实验 在其他条件一定的情况下，分
别对 pH(5、6、7、8、9)、酶解时间(1、2、3、4、5、6、7、
8h)、温度(40、45、50、55、60℃)、加酶量(1%、2%、
3%、4%、5%、6%)、料液比(1、3、5、7、9)进行单因素
170
实验，基本条件为 pH7.0，时间 6h，温度 50℃，加酶量
3%，料液比 5%，每个实验重复 3 次。
1.2.3.2 响应面法实验 在单因素实验的基础上，使
用 Design－Expert 7.1.5 软件，根据 Box－Behnken 中心
组合实验设计原理［15］，设计四因素三水平的响应面
实验，以对 α－葡萄糖苷酶抑制活性为指标，对酶解
条件进行优化。因素水平表见表 1。
表 1 响应面分析因素及水平表
Table 1 Analytical factors and
levels for Box－Behnken
水平
因素
A pH
B温度
(℃)
C加酶量
(w /w，%)
D料液比
(w /v，%)
－ 1 6 45 1 6
0 7 50 2 7
1 8 55 3 8
1.2.4 α－葡萄糖糖苷酶抑制率的测定 采用分光光
度法进行测定，以 PNPG为底物，通过 α－葡萄糖苷酶
酶解反应会释放出硝基苯酚，在 400nm 处有最大吸
光度，可以根据这一特性测定样品对 α－葡萄糖苷酶
的抑制活性［16］。
配制 25mg /mL的 α－葡萄糖苷酶溶液、0.5mol /L
的磷酸盐缓冲液(pH6.7)和 0.9133mg /mL 的 PNPG，
在 96 孔酶标板每个小孔中依次加入缓冲液、样品溶
液、PNPG 和酶溶液，混匀后在 37℃条件下反应 1h，
然后加入 50μL 碳酸钠溶液(0.67mol /L)终止反应，
在 400nm下用酶标仪测定吸光度值。测定反应体系
如表 2 所示。
表 2 α－葡萄糖苷酶抑制率检测反应体系的组成
Table 2 The composition of α－glycosidase enzyme inhibition testing system
组别 缓冲液(μL) PNPG(μL) α－葡萄糖苷酶(μL) 样品溶液(μL)
空白组 120 50 50 20μL去离子水代替
样品组 120 50 50 20
样品对照组 120 50μL缓冲液代替 50μL缓冲液代替 20
抑制率计算公式为:
酶抑制率活性(%)=［A空白 －(A样品 － A样品对照)］/
A空白 × 100
其中，A空白、A样品、A样品对照分别为空白组、样品组和
样品对照组对应的吸光度值。
2 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 酶解时间对产物活性的影响 酶解时间对产
物 α－葡萄糖苷酶的抑制率影响如图 1 所示。从图 1
可以看出，产物对 α－葡萄糖苷酶的抑制活性在 6h
时达到最高点，比 3～5h 的产物抑制率提高了 1.5%
左右(p ＜ 0.01)。6h 后抑制活性呈下滑趋势。这可
能是由于在底物蛋白中包含可溶性蛋白和不溶性蛋
白，可溶性蛋白水解时，最初阶段敏感性肽键快速断
裂，不敏感肽键后来断裂;在不溶性底物蛋白的酶水
解中，酶吸附在不溶性蛋白表面，首先水解稀疏结合
的不溶性蛋白上的聚合肽，然后再慢慢水解中心的
肽键［17］。6h后活性肽被过度酶解，结构遭到破坏所
致。因此，木瓜蛋白酶最佳酶解时间应控制在 6h
左右。
图 1 时间对产物活性的影响
Fig.1 Effect of time on the inhibition ratio
2.1.2 pH对产物活性的影响 pH对产物 α－葡萄糖
苷酶的抑制率影响如图 2 所示。从图 2 可以看出，
pH为 7 时酶解产物对 α－葡萄糖苷酶的抑制活性达
到最高点。pH小于 7 或大于 7 时，酸碱条件会影响
酶的活性和底物的构象［18］。因此，木瓜蛋白酶酶解
工艺的最佳 pH应在 7 左右。
图 2 pH对产物活性的影响
Fig.2 Effect of pH on the inhibition ratio
2.1.3 温度对产物活性的影响 温度对产物α－葡萄
糖苷酶的抑制率影响如图 3 所示。由图 3 可知，温度
为 50℃时，酶解产物的抑制活性达到最高，温度继续
升高，酶的活性受到抑制，即有活性的酶减少，影响
酶解速度。因此，在本实验条件下，酶解温度选择
50℃左右。
2.1.4 加酶量对产物活性的影响 加酶量对产物
α－葡萄糖苷酶的抑制率影响如图 4 所示。由图 4 可
知，加酶量为 2%时，酶解产物的抑制活性达到最高
点，高于 2%时，酶含量较高，但因为底物相对较少，
产物抑制活性不会再增加。在本实验条件下，最佳
加酶量选择 2%。
2.1.5 料液比对产物活性的影响 料液比对产物
α－葡萄糖苷酶的抑制率影响如图 5 所示。由图 5 可
171
图 3 温度对产物活性的影响
Fig.3 Effect of temperature on the inhibition ratio
图 4 加酶量对产物活性的影响
Fig.4 Effect of enzyme amount on inhibition ratio
知，料液比在 7%时，产物的抑制活性达到最高点，大
于 7%后，抑制率反而呈下降趋势。这可能是因为植
物蛋白中含有植物蛋白酶抑制剂，能与蛋白酶作用
与底物共享蛋白酶的结合基团，表现出竞争性抑制
作用［18］。因此，最佳料液比选择 7%。
图 5 料液比对产物活性的影响
Fig.5 Effect of sample to solution ratio on inhibition ratio
2.2 响应面法对酶解工艺的优化
2.2.1 响应面分析结果 依据设计结果进行响应面
实验，结果见表 3。
采用 Design－Expert 7.1.5 软件程序对实验数据
进行二次多元回归拟合，分析结果得出木瓜蛋白酶
酶解山杏蛋白的回归方程为:
Y = － 99.43583 + 12.32533A + 2.82300B +
1.00367C－0.053D + 0.0135AB－0.0225AC + 0.015AD－
0.03BC +0.01BD－0.05CD－0.95A2－0.029B2 －0.025C2 －
3.833E－003D2
对上述回归模型进行方差分析，分析结果见表
4。结果表明模型是极显著的(p ＜ 0.0001)，回归方程
的决定系数是 0.9889，说明该模型能够解释 98.89%
的变化，因此可以用此模型对该实验进行分析和预
测。一次项中，A、B、C影响极显著，平方项 A2、B2 影
响极显著，而交互项的影响相对较小。各因素对酶
解所得山杏肽活性影响的大小顺序为:pH ＞温度 ＞
加酶量 ＞料液比。
表 3 响应面实验结果
Table 3 Ｒesults of Box－Behnken
实验号 A B C D 抑制率(%)
1 － 1 0 1 0 12.63
2 0 0 0 0 12.31
3 1 － 1 0 0 12.21
4 0 0 0 0 12.16
5 1 0 1 0 13.75
6 0 0 0 0 14.17
7 0 0 － 1 1 13.89
8 0 1 － 1 0 14.11
9 － 1 － 1 0 0 13.34
10 － 1 1 0 0 12.81
11 0 0 0 0 13.26
12 1 0 0 1 12.79
13 0 1 0 1 13.19
14 0 0 0 0 13.13
15 0 1 1 0 13.41
16 1 1 0 0 13.23
17 0 － 1 0 － 1 13.19
18 0 1 0 － 1 12.79
19 0 0 1 1 13.33
20 － 1 0 0 1 12.84
21 1 0 0 － 1 13.39
22 0 － 1 0 1 13.15
23 － 1 0 － 1 0 13.37
24 1 0 － 1 0 13.17
25 0 0 1 － 1 13.97
26 0 － 1 1 0 14.00
27 － 1 0 0 － 1 14.05
28 0 0 － 1 － 1 13.99
29 0 － 1 － 1 0 14.02
2.2.2 响应面分析 根据回归方程，作出响应面图，
见图 6～图 11。
图 6 pH与温度的交互作用影响的响应曲面
Fig.6 Ｒesponsive surfaces of pH and temperature
考察响应曲面，可以进一步得出结论，四个因素
中对酶解液降糖活性影响最大的是 pH，温度次之，
172
表 4 响应面回归模型方差分析
Table 4 ANOVA for response surface quadratic model
方差来源 自由度 平方和 SS 均方 MS F值 Pr ＞ F 显著性
模型 14 9.37 0.67 88.85 ＜ 0.0001 ＊＊
A 1 0.43 0.43 56.51 ＜ 0.0001 ＊＊
B 1 0.13 0.13 17.29 0.0010 ＊＊
C 1 0.11 0.11 14.63 0.0019 ＊＊
D 1 3.33E－005 3.333E－005 4.426E－003 0.9479
AB 1 0.018 0.018 2.42 0.1421
AC 1 2.025E－003 2.025E－003 0.27 0.6122
AD 1 9.000E－004 9.000E－004 0.12 0.7347
BC 1 3.600E－003 3.600E－003 0.48 0.5006
BD 1 4.000E－004 4.000E－004 0.053 0.8211
CD 1 1.000E－002 1.000E－002 1.33 0.2685
A2 1 5.81 5.81 771.26 ＜ 0.0001 ＊＊
B2 1 3.50 3.50 465.36 ＜ 0.0001 ＊＊
C2 1 4.081E－003 4.081E－003 0.54 0.4738
D2 1 9.532E－005 9.532E－005 0.013 0.9120
残差 14 0.11 7.532E－003
失拟差 10 0.10 0.01 10.94 0.0170 *
纯误差 4 3.720E－003 9.300E－004
总和 28 9.47
注:* :p ＜ 0.05，表示差异显著;＊＊:p ＜ 0.01，表示差异极显著。
图 7 pH与加酶量的交互作用影响的响应曲面
Fig.7 Ｒesponsive surfaces of pH and enzyme amount
图 8 pH与料液比的交互作用影响的响应曲面
Fig.8 Ｒesponsive surfaces of pH
and sample to solution ratio
加酶量和料液比的影响较小，四个因素之间的交互
影响较小。
2.2.3 最佳酶解工艺条件的确定 为了确定最佳工
艺条件，利用软件对工艺条件进行优化，得到的山杏
肽最佳酶解条件为:pH6.88，温度 49.49℃，加酶量
3%，料液比 6，在此条件下，产物抑制活性的预测值
图 9 温度与加酶量的交互作用影响的响应曲面
Fig.9 Ｒesponsive surfaces of
temperature and enzyme amount
图 10 温度与料液比的交互作用影响的响应曲面
Fig.10 Ｒesponsive surfaces of temperature
and sample to solution ratio
为 14.15%。为了实际操作方便，将酶解工艺条件修
正为:pH7，温度 50℃，加酶量 3%，料液比 6。在此条
件下进行三次平行实验，求平均值得到酶解产物对
α－葡萄糖苷酶的抑制活性为 14.22%，高于预测值
0.07%。将此条件下得到的酶解液冻干，测定其 IC50
173
图 11 加酶量与料液比的交互作用影响的响应曲面
Fig.11 Ｒesponsive surfaces of enzyme amount
and sample to solution ratio
值，结果为 0.08g /mL。证明响应面法对木瓜蛋白酶
酶解山杏仁蛋白制备 α－葡萄糖苷酶抑制肽条件的
优化结果准确可靠，有实用价值。
3 结论
在单因素实验的基础上，利用响应面法优化木
瓜蛋白酶酶解山杏仁蛋白制备 α－葡萄糖苷酶抑制
肽的工艺参数，获得的最佳工艺条件为:pH7，温度
50℃，加酶量 3%，料液比 6，在此条件下产物的抑制
率为 14.22%。
植物蛋白的天然成分对疾病有着独特的功效却
没有人工合成药物的副作用［19］，本实验还可以进行
进一步的深入研究:对酶解产物进行分离纯化、结构
鉴定，以得到已知结构的纯品;还可以对产物进行产
品开发，如功能性饮料等。
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