全 文 ：DOI:10.3781 / j.issn.1000-7431.2010.12.005 BasicResearch·基础研究
木鳖子醇提物抑制小鼠黑素瘤 B16细胞体内外侵袭转移的实验研究
韩丽娜 1 ,赵连梅 1 ,胡彩霞2 ,张小芳 1 ,周欣亮 1 ,孟　君1 ,单保恩 1
(河北医科大学第四医院 1.科研中心;2.皮肤科 , 石家庄　050011)
[摘要 ] 　目的:观察木鳖子醇提物(ethanolextractfromcochinchinamomordicaseed, CMSEE)对小鼠黑素瘤细胞 B16及其荷瘤
小鼠移植瘤侵袭转移的影响 , 初步探讨其作用机制。方法:通过划痕实验和体外迁移实验检测不同质量浓度 CMSEE(20、25、
30 μg/mL)作用 24和 48h后 , B16细胞侵袭和转移能力的改变;分别用 RT-PCR和 Western印迹法检测不同质量浓度 CMSEE
(20、25、 30 μg/mL)作用 24 h以及 25 μg/mLCMSEE作用不同时间(0、6、12、24、36、48 h)对 B16细胞中基质金属蛋白酶(ma-
trixmetalloproteinase, MMP)-2、MMP-9mRNA及其蛋白以及基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissueinhibitorofmetaloproteinase,
TIMP)-1、TIMP-2蛋白表达的影响。以 B16细胞建立小鼠荷瘤模型 , 用 10 mg/kgCMSEE灌胃治疗荷瘤小鼠 , HE染色观察各
组小鼠的肿瘤 、肝 、脾组织的病理变化。结果:CMSEE(20 ～ 30 μg/mL)可明显抑制 B16细胞的侵袭和转移能力 , 可使 B16细
胞划痕的直径明显变宽(P<0.05), 穿过 Transwel小室膜的细胞数显著减少(P<0.05), 并呈浓度依赖性;CMSEE(20 ～ 30
μg/mL)可明显下调 B16细胞中 MMP-2、MMP-9mRNA及蛋白的表达(P<0.05), 并有浓度依赖性;而 CMSEE对 B16细胞中
TIMP-1和 TIMP-2蛋白的表达无明显影响(P>0.05)。 CMSEE可有效抑制小鼠体内黑素瘤的侵袭和转移。结论:CMSEE在
体内外均能明显抑制小鼠 B16细胞的侵袭和转移能力 ,其作用机制可能与其抑制 MMP-2和 MMP-9的表达有关。
[关键词 ] 　黑素瘤 , 实验性;木鳖子;肿瘤侵润;肿瘤转移;基质金属蛋白酶类;金属蛋白酶类组织抑制剂;小鼠 , 近交 C57BL
[中图分类号 ] 　R739.5;R73-37　　[文献标志码 ] 　A　　[文章编号 ] 　1000-7431(2010)12-1015-07
EfectsofethanolextractofcochinchinamomordicaseedoninvasionandmetastasisofmousemelanomaB16cels
invitroandinvivo
HANLi-na1 , ZHAOLian-mei1 , HUCai-xia2 , ZHANGXiao-fang1 , ZHOUXin-liang1 , MENGJun1 , SHANBao-en1 　
(1.ResearchCenter;2.DepartmentofDermatology, FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity, Shijiazhuang050011, China)
[ ABSTRACT] 　Objective:Toinvestigatetheeffectsofethanolextractofcochinchinamomordicaseed(CMSEE)ontheinvasionand
metastasisofmelanomaB16 celsinvitroandinvivo, aswelasitsprobablemechanism.Methods:EfectsofCMSEE(20 , 25 and30
μg/mL)ontheinvasionandmetastasisofB16 cellsweredetectedbyscratchassayandTranswelassay.Thetranscriptionallevelsof
matrixmetaloproteinases(MMP)-9 andMMP-2 inB16 celstreatedwithdifferentdosesofCMSEE(20, 25 and30 μg/mL)forvarious
times(0, 6 , 12, 24, 36 and48 h)weredetectedbyRT-PCR.ExpressionsofMMP-2 , MMP-9, tissueinhibitorofmetalloproteinase
(TIMP)-1 andTIMP-2 proteinsinB16 cellstreatedwithCMSEEwereanalyzedbyWesternbloting.TheB16-implantedmousemodel
wasestablished, andthemetastasisandinvasionofB16-implantedtumorswereobservedaftertreatmentwithCMSEE.Results:After
treatmentby20-30 μg/mLCMSEE, thediametersofscratchbecamebroaderthanthecontrolgroup(P<0.05), andB16 celsthrough
theTranswelchambersweredecreasedsignificantlyinadose-dependentmanner(P<0.05).CMSEEcoulddown-regulatetheexpres-
sionlevelsofMMP-9 andMMP-2 mRNAsandproteinsinadose-dependentmanner.ExpressionsofTIMP-1 andTIMP-2 proteinsinB16
celstreatedwithCMSEEdidnotchanged.CMSEEeffectivelyinhibitedthemetastasisandinvasionofB16-implantedtumorsinthe
mice.Conclusion:CMSEEcouldinhibittheinvasionandmetastasisofmelanomaB16 cellsinvitroandinvivo, andthemechanismmay
berelatedwithdown-regulatingtheexpressionsofMMP-2 andMMP-9 mRNAsandproteins.
[ KEYWORDS] 　Melanoma, experimental;Momordicacochinchinensis;Neoplasminvasiveness;Neoplasmmetastasis;Matrixmetal-
loproteinases;Tissueinhibitorofmetalloproteinases;Mice, inbredC57BL
[ Tumor, 2010, 30(12):1015-1021]
Correspondenceto:SHANBao-en(单保恩)
　　　　　　E-mail:baoenshan@yahoo.com.cn
　　恶性黑素瘤是常见的皮肤恶性肿瘤之一 ,每年
约有 20% ～ 25%的黑素瘤患者死于转移性疾病 [ 1] 。
目前 ,尚无有效的药物和方法可抑制恶性肿瘤的侵
袭和转移。因此 ,寻找新的抑制肿瘤侵袭和转移的
药物并探讨其作用机制已成为广大学者研究的热点
之一。木鳖子为葫芦科苦瓜属植物木鳖 [ Momordica
cochinchinensis(Lour.)Spreng.]的干燥成熟种子 ,
主要产地为中国广西 、四川和湖北省 [ 2] 。木鳖子的
功效主要为消肿散结 、解毒和追风止痛 ,用于治疗痈
肿 、疔疮 、无名肿毒及乳腺炎等[ 3] 。研究发现 ,木鳖
子入药对多种恶性肿瘤具有一定的治疗效果[ 4] ,但
能否有效抑制恶性肿瘤的侵袭和转移 ,迄今国内外
尚未见相关报道。本课题组在前期研究中发现 ,木
鳖子 醇 提 物 (ethanolextractfrom cochinchina
·1015·肿瘤 2010年 12月第 30卷第 12期　TumorVol.30, No.12, December, 2010
momordicaseed, CMSEE)对黑素瘤细胞具有生长抑
制作用 [ 4] ;高质量浓度(100 μg/mL)的 CMSEE具有
显著诱导 B16细胞凋亡的作用 ,而较低质量浓度
(10 ～ 40 μg/mL)的 CMSEE能促进恶性黑素瘤细胞
向正常上皮细胞分化 [ 5] 。为探讨低质量浓度的
CMSEE是否能抑制肿瘤细胞的侵袭和转移 ,本实验
拟通过观察低质量浓度的 CMSEE对小鼠黑素瘤 B16
细胞中基质金属蛋白酶(matrixmetaloproteinases,
MMPs)和肿瘤转移抑制因子 [如金属蛋白酶组织抑
制 因 子 (tisue inhibitorofmetaloproteinases,
TIMPs)]表达的影响 ,探讨 CMSEE对 B16细胞侵袭
和转移的作用效果及其机制。
1　材料与方法
1.1　实验试剂　中药木鳖子购自北京同仁堂药店 ,
经河北医科大学药学院天然药物教研室鉴定为合格
药材;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限
公司;RPMI1640和胰蛋白酶购自美国 Gibco公司;
TRIzol试剂购自美国 Invitrogen公司;总蛋白提取试
剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;二喹林甲酸
(bicinchoninicacid, BCA)总蛋白定量试剂盒购自上
海炎彬化工科技有限公司;RT-PCR二步法试剂盒购
自美国 Promega公司;PCR引物购自上海捷瑞生物工
程有限公司;Tris购自河北博海生物工程开发有限公
司;十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate, SDS)、四
甲基二乙胺(tetramethylethylenediamine, TEMED和 β-
巯基乙醇购自美国 Sigma公司;兔抗鼠 MMP-2、MMP-
9、TIMP-1和 TIMP-2抗体均购自 SantaCruz公司;
Tween-20购自美国 Amresco公司;Transwel侵袭小室
购自美国 Coster公司。
1.2　CMSEE的制备 　依照文献 [ 3]方法制备
CMSEE。取一定量的木鳖子原药材 , 粉碎后称取
10 g,加入 10倍体积的 95%乙醇溶液 ,室温密闭浸
泡 7d,用纱布滤去渣滓 ,加入 2%活性炭 , 80 ℃蒸煮
脱色 ,然后用旋转冷冻蒸发器减压蒸发成粉状物 ,所
得干粉即为 CMSEE纯品。 CMSEE经乙醇溶液溶
解 ,用无血清 RPMI1640培养液稀释后备用 ,其中乙
醇终浓度 <0.1%。
1.3　细胞株及其培养　小鼠黑素瘤细胞株 B16购
自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心 ,
用含 50 mL/L胎牛血清的 RPMI1640培养液(同时
含青霉素 100u/mL和链霉素 100 μg/mL)于 37℃、
CO2体积分数为 5%的培养箱中培养 ,以 0.25%胰
蛋白酶消化细胞并传代 ,取处于对数生长期的细胞
用于后续实验 。
1.4　细胞划痕实验　取处于对数生长期的 B16细
胞 ,调整细胞密度为 2×105个 /mL,接种于 6孔板
内 ,每孔 1.8 mL。待细胞贴壁完全后 ,用移液器枪
头在每个孔内划一道痕 ,然后用 PBS轻轻洗涤 ,除
掉脱落细胞。实验组各孔加入不同质量浓度的
CMSEE各 200 μL, CMSEE终质量浓度分别为 20、25
和 30 μg/mL;阴性对照孔加入同体积的完全培养
液。每组均设 2个复孔 ,置于饱和湿度 、37 ℃、CO2
体积分数为 5%的培养箱中培养 ,分别在培养 24 h
和 48 h后观察细胞划痕情况 ,并拍照 。
1.5　细胞迁移能力测定　取处于对数生长期的
B16细胞 ,常规用 0.25%胰酶消化 ,用不含胎牛血
清的 RPMI1640培养液洗细胞 3次 ,配制细胞悬液 ,
调整细胞密度为 2 ×105个 /mL。于 Transwel小室
的上室中加入 200μL的细胞悬液:实验组各孔加入
不同质量浓度的 CMSEE, CMSEE终质量浓度分别
为 20、25和 30μg/mL;阴性对照孔加入同体积的完
全培养液 ,每组设 3个复孔。下室加入 600μL无胎
牛血清的 RPMI1640培养液 ,于 37 ℃、CO2体积分
数为 5%的培养箱中孵育 24和 48h。取出Transwel
小室 ,用 PBS洗 2次 ,棉拭子擦去膜上面未迁移的
细胞 ,然后用 4%多聚甲醛溶液固定 10 min, HE染
色。取下带有细胞的聚碳酸酯膜 , 反面朝上 , 以
Olympus相差显微镜观察迁移细胞数量并拍照。每
个样孔随机取 4个视野计数 ,计算平均值。每组重
复 5次。按下列公式计算细胞迁移抑制率。迁移抑
制率(%)=(1 -实验组迁移细胞数)/对照组迁移
细胞数 ×100%。
1.6　RT-PCR法检测细胞侵袭和转移相关基因的
表达水平　取处于对数生长期的 B16细胞 , 加入
CMSEE(质量浓度分别为 20、 25和 30 μg/mL),阴
性对照组加入 RPMI1640培养液 ,于 37 ℃、CO2体
积分数为 5%的培养箱中培养 。收集阴性对照组和
经 CMSEE处理 24h后的 B16细胞 ,用 TRIzol试剂
提取细胞总 RNA。取 2.0μL总 RNA于 70 ℃预变
性 10 min,然后按照反转录试剂盒的要求加入其他
成分 [包括 5×Bufer2.0 μL、dNTP(10 mmol/L)
2.0 μL、Oligo(dT)15 1.0 μL、AMV酶 1.5 μL和
DEPC水 12.5 μL] ,以下列条件反转录成 cDNA:
25 ℃ 1min, 42℃ 60min, 98 ℃ 5min, 4 ℃ 10 min。
以合成的 cDNA为模板 ,进行目的基因扩增。目的
基因 MMP-2、MMP-9和内参基因 β-actin的引物序
列见表 1。PCR反应体系如下:cDNA3.0 μL,上下
·1016· 肿瘤　2010年 12月 ,第 30卷
游引物各 2.5 μL, DEPC水 4.5 μL, GoTaq酶 12.5
μL。 PCR反应条件:首先 , 94℃预变性 5min;然后 ,
94 ℃ 45 s,各退火温度 45 s, 72 ℃ 45 s,共循环 32
次;最后 , 72 ℃延伸 7 min。 RT-PCR扩增产物经
1.5%凝胶电泳分离 ,应用 Gel-pro凝胶分析软件对
电泳谱带mRNA进行基因表达差异分析 ,以目的基
因条带灰度值 /内参 β -actin条带灰度值的比值表示
目的基因的 mRNA表达水平 。实验重复 3次。
表 1　RT-PCR检测所用的引物序列
Table1　PrimersequencesforRT-PCR
Gene Primersequence t/℃# Productsize/bp
MMP-2 5 -GATTGACGCTGTGTATGAG-3 54.8 190
5 -GATGTATGTCTTCTTGTTCTTAC-3
MMP-9 5 -ACTATGCTCACCTAACCCC-3 55.6 201
5 -CCGTGCTTCATAATCTGCC-3
β-actin 5 -TGAGACCTTCAACACCCCAG-3 55.0 312
5 -GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3
MMP:Matrixmetaloproteinase.#Temperatureofrenaturation
1.7　Western印迹法检测细胞侵袭和转移相关蛋白
的表达水平　取处于对数生长期的 B16细胞 ,加入
CMSEE(质量浓度分别为 20、25和 30 μg/mL),阴
性对照组加入 RPMI1640培养液 ,于 37 ℃、CO2体
积分数为 5%的培养箱中培养。培养 24 h后 ,用预
冷的 PBS洗 3次 ,刮下细胞 ,用蛋白提取试剂盒提
取总蛋白 , BCA法进行蛋白定量 。取一定量的蛋白
样品加入 4×上样缓冲液 ,沸水浴中煮沸 5 min,用
10% SDS-PAGE分离蛋白 ,分离后的蛋白经电转移
至聚偏氟乙烯(polyvinylidenefluoride, PVDF)膜 ,用
脱脂牛奶室温封闭 1h,加入 MMP-2、MMP-9、TIMP-1
和 TIMP-2一抗(稀释比例为 1︰ 200),于 4℃孵育
过夜 , PBS-T洗膜 20min×3次 ,加入红外线标记的
相应二抗(稀释比例为 1︰ 20 000), 37℃反应 2h,
PBS-T洗膜 20min×3次 ,用双色红外荧光扫描系统
(IRDye800-LI-COR, Odysey)检测各目的蛋白的表
达情况。实验重复 3次 。
1.8　荷瘤小鼠模型的建立及病理检测　6 ～ 8周龄
雌性 C57/BL小鼠 12只 ,体质量为 18 ～ 20 g,购自
中国医学科学院实验动物研究所 ,动物生产许可证
号为 SCXK(冀)2008-1-003,在无特异病原菌(spe-
cificpathogen-free, SPF)级条件下饲养。小鼠右肩胛
皮下注射处于对数生长期的 B16细胞 2×105个 /
200 μL,约 10 d后肿瘤最长径约为 0.5 cm,体积约
为0.01cm3 ,此日即为小鼠肿瘤模型建立的 0 d。将
荷瘤小鼠随机分成 2组(每组 6只):(1)0.9%氯化
钠溶液对照组 ,从模型建立 0d起隔天给予 0.9%氯
化钠溶液 0.2 mL灌胃;(2)口服CMSEE组 ,从模型
建立 0 d开始隔天给予 CMSEE(10mg/kg)0.2 mL
灌胃 。观察各组小鼠的肿瘤生长情况 ,用药 2周后
处死各组小鼠 ,取肿瘤 、肝 、脾组织 ,以 4%多聚甲醛
溶液固定 ,石蜡包埋 ,切片 ,苏木精-伊红染色 ,光学
显微镜下观察各组织形态。
1.9　统计学方法　采用 SPSS13.0统计学软件对
实验结果进行统计处理。计量资料用 x±s表示 ,多
组间比较采用单因素方差分析 ,两组间比较采用
LSD检验 。以 P<0.05为差异有统计学意义。
2　结　果
2.1　CMSEE对 B16细胞侵袭和转移能力的影响
2.1.1　划痕实验结果　用不同质量浓度的 CMSEE
(20、25、30 μg/mL)处理 B16细胞 24和 48 h后 ,与
阴性对照组相比 ,细胞划痕缩窄的幅度均明显减小 ,
即 CMSEE作用后细胞划痕宽度明显大于阴性对照
组(P<0.01),说明 CMSEE可明显抑制 B16细胞的
侵袭和转移能力。随着药物浓度的增加 ,该抑制作
用逐渐增强 , 但是未见 CMSEE作用不同时间之间
的该抑制作用存在差异 ,说明 CMSEE作用 B16细
胞 24 h时的抑制细胞转移能力已达到最大限度
(表 2、图 1)。
表 2　木鳖子醇提物作用黑素瘤 B16细胞后细胞划痕宽度和迁移细胞数的变化
Table2　ThechangesofscratchwidthandmigratorynumberofB16 celstreatedwithCMSEE
( x+s)
CMSEEcB/(μg·mL-1)
Scratchwidthd/mm
24h 48h
Migratorycelnumber
24h 48h
0 0.02±0.01　 0.08±0.21　 7.25±1.71　 36.50±6.35　
20 0.30±0.02＊＊ 0.21±0.02＊＊ 1.75±1.71＊＊ 26.75±3.30＊
25 0.59±0.03＊＊ 0.49±0.15＊＊ 0.50±0.58＊＊ 10.50±3.87＊＊
30 0.87±0.03＊＊ 0.83±0.44＊＊ 0＊＊ 2.25±2.22＊＊
CMSEE:Ethanolextractfromcochinchinamonordicaseed.＊P<0.05, ＊＊P<0.01, vsthecontrol(0μg/mL)group
·1017·第 12期.韩丽娜 ,等.木鳖子醇提物抑制小鼠黑素瘤 B16细胞体内外侵袭转移的实验研究
A:Scratchassay;B:Transwellassay
图 1　木鳖子醇提物作用黑素瘤 B16细胞后细胞划痕宽度和迁移细胞数的变化(×200)
Fig.1　ThechangesofscratchwidthandmigratorynumberofmelanomaB16 celstreatedwithCMSEEatdifferent
concentrationsfordifferenttime(×200)
2.1.2　Transwel小室迁移实验结果　用不同质量
浓度的 CMSEE(20、25和 30 μg/mL)处理 B16细胞
后 ,与阴性对照组相比 , 穿膜细胞数均明显减少
(P<0.05),并呈浓度依赖性;相同浓度的药物处理
细胞 48 h后 ,穿膜细胞数明显多于 24 h处理组 ,差
异均有统计学意义(P<0.01),见表 2和图 1B。
2.2　CMSEE对 B16细胞侵袭和转移相关基因表达
的影响
2.2.1　MMP-2和 MMP-9 mRNA的表达　RT-PCR
检测结果显示 ,经不同质量浓度的 CMSEE(20、 25
和 30μg/mL)处理 24 h后 , B16细胞中 MMP-2和
MMP-9mRNA的表达水平均明显下降(P<0.05),
并且呈浓度依赖性(图 2A);经 25μg/mLCMSEE作
用不同时间(0、6、12、24、36和 48h)后 , B16细胞中
MMP-2和 MMP-9 mRNA的表达水平均下降 ,但组间
差异没有统计学意义(图 2B)。
2.2.2　MMP-2、MMP-9、TIMP-1和 TIMP-2蛋白的表
达　Western印迹法检测结果显示 ,经不同质量浓度
的 CMSEE(20、25和 30μg/mL)处理后 , B16细胞中
MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平明显下降 (P<
0.05),而 TIMP-1、TIMP-2蛋白的表达水平无明显
变化(P>0.05)。经 25μg/mLCMSEE作用不同时
间(0、6、12、24、36和 48 h)后 , B16细胞中 MMP-9、
MMP-2蛋白的表达均有所下降 ,但是与阴性对照组
相比差异无统计学意义;TIMP-1和 TIMP-2蛋白的
表达水平也无明显变化 ,见图 2C～ D。
2.3　CMSEE对荷瘤小鼠肿瘤侵袭和转移的抑制作
用　将 B16细胞接种于小鼠体内 10 d后 ,可在接种
部位(右肩胛)皮下见到成形的瘤块 ,移植成功率为
100%。HE染色后光学显微镜下观察结果显示 ,
CMSEE(10 mg/kg)处理组及 0.9%氯化钠溶液对照
组小鼠肿瘤组织均可见肿瘤细胞呈弥漫分布 ,少部
·1018· 肿瘤　2010年 12月 ,第 30卷
分肿瘤细胞排列成腺管状;但与对照组相比 ,
CMSEE处理组肿瘤组织的肿瘤细胞密度较稀 ,间质
较多 ,可见大量炎性细胞浸润以及呈均匀红染 、无结
构的坏死区;另外 ,在 CMSEE处理组小鼠体内均未
发现肝 、脾转移 ,而对照组的肝组织中发现少量转移
灶(图 3)。
AandB:mRNAexpressionsdetectedbyRT-PCR;CandD:ProteinexpressionsdetectedbyWesternbloting;AandC:Treatmentwithdiferentconcen-
trationsofCMSEEfor24h;BandD:Treatmentwith25μg/mLCMSEEfordiferenttime.Statisticalgraphsaregeneratedfromthreeexperimentalre-
sults.＊P<0.05, ＊＊P<0.01, vsthecontrol(0μg/mLor0h)group
图 2　木鳖子醇提物作用对黑素瘤 B16细胞中 MMP-9、MMP-2、TIMP-1和 TIMP-2表达的影响
Fig.2　ExpressionsofMMP(matrixmetaloproteinase)-9, MMP-2, TIMP(tissueinhibitorofmetaloproteinase)-1 and
TIMP-2 inmelanomaB16 celstreatedwithCMSEEatdifferentconcentrationsfordifferenttime
·1019·第 12期.韩丽娜 ,等.木鳖子醇提物抑制小鼠黑素瘤 B16细胞体内外侵袭转移的实验研究
图 3　木鳖子醇提物治疗后黑素瘤 B16荷瘤小鼠的肝 、脾及肿瘤组织病理形态学观察(HE染色)
Fig.3　Histopathologicalfeaturesoftumor, liverandspleentissuesfromtumor-bearingmiceafter
implantationwithmelanomaB16 celsandtreatmentwithCMSEE(HEstaining)
3　讨　论
侵袭和转移是恶性肿瘤的主要特征。肿瘤细胞
本身的侵袭力在肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作
用 ,因此抑制肿瘤细胞运动将抑制肿瘤细胞的浸润
和转移 [ 6] 。本实验应用 Transwel法检测发现 ,
CMSEE能使穿过聚碳酸酯膜的黑素瘤细胞数量减
少;细胞划痕实验发现 , CMSEE使细胞迁移能力显
著下降 。两种方法均证明 , CMSEE能显著降低黑素
瘤 B16细胞的侵袭和运动能力 ,推测其对黑素瘤的
侵袭和转移能力具有明显的抑制作用 。
细胞外基质(extracelularmatrix, ECM)在机体
内的代谢失调与肿瘤的浸润 、转移密切相关。在
ECM代谢平衡的调节过程中 , MMPs及其抑制因子
TIMPs起着引人注目的作用 [ 7, 8] 。其中相对分子质
量为 7.2×104的 MMP-2与肿瘤密切相关 ,它能特异
性地降解基膜中的主要成分Ⅳ型胶原 ,使基膜丧失
完整性;另一方面 ,通过毛细血管内生 、新生血管生
成等促进肿瘤生长和扩散 [ 9] 。 TIMP-2则可下调
MMP-2的降解活性 ,阻止肿瘤的局部生长和远处转
移 [ 10] 。有研究发现 ,外源性地活化及重组 TIMP-2
均能明显抑制肿瘤细胞的侵袭和转移 , TIMP-2低表
达与肿瘤的不良预后有关 [ 11] 。 Leinonen等[ 12]研究
发现 , MMP-2的蛋白表达量与肺癌细胞的分化程度
和 TNM分期有关。本实验结果显示 , CMSEE能从
基因和蛋白表达水平显著降低 B16细胞中 MMP-2
的表达水平 ,但不能有效增强 TIMP-2的表达水平 ,
说明CMSEE可能不是通过增加 TIMP-2表达水平以
及使其与 MMP-2形成复合物来达到抑制 B16细胞
侵袭和转移的目的 。
TIMP-1是 MMP-9的特异性抑制剂 [ 13] 。研究发
现 , MMP-9和 TIMP-1在食管鳞癌的浸润和转移过
程中起重要作用 ,而 TIMP-1的表达与 MMP-9呈负
相关 [ 14, 15] 。本研究结果显示 , CMSEE能显著降低
MMP-2和 MMP-9在基因和蛋白水平的表达 , 并呈
浓度依赖性 ,证明 CMSEE能有效抑制 B16细胞的
侵袭和转移;然而 , CMSEE不能显著降低 TIMP-1和
TIMP-2的蛋白表达水平 ,表明 CMSEE抑制 B16细
胞侵袭和转移的机制可能不是通过促进 TIMP-1和
TIMP-2的表达而是通过抑制 MMP-2和 MMP-9的活
性 ,进而抑制黑素瘤的侵袭和转移 。
本研究的动物体内实验结果显示 , CMSEE处理
组及对照组小鼠肿瘤组织均可见肿瘤细胞呈弥漫分
布 ,少部分肿瘤细胞排列成腺管状;但与对照组相
·1020· 肿瘤　2010年 12月 ,第 30卷
比 , CMSEE处理组肿瘤组织的肿瘤细胞密度较稀 ,
间质较多 ,并可见较多炎性细胞浸润以及呈均匀红
染和无结构的坏死区;另外 ,在 CMSEE处理组未发
现肿瘤的肝转移 ,而对照组肝组织中发现少量转移
灶 。因此 ,体内实验结果表明 , CMSEE能够在体内
有效地抑制黑素瘤的侵袭和转移。
　　总之 ,本研究发现 CMSEE在体内和体外均能
够抑制恶性黑素瘤的侵袭和转移 。由此提示 ,
CMSEE可作为潜在的预防和治疗药物应用于恶性
黑素瘤 ,但有关其抑制肿瘤侵袭和转移的机制 ,尚需
进一步深入探讨 。
[参考 文 献 ]
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[收稿日期 ] 　 2010-07-22 [修回日期 ] 　 2010-09-10
[本文编辑 ] 　张俊彦
·1021·第 12期.韩丽娜 ,等.木鳖子醇提物抑制小鼠黑素瘤 B16细胞体内外侵袭转移的实验研究