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收稿日期:2016-05-05; 修订日期:2016-09-02
基金项目:云南省高校优势特色重点学科(生态学)建设项目资助;
昆明学院人才引进项目(YJL11027)
作者简介:李育川(1972-)，男(彝族)，云南永仁人，昆明学院教授，博士学
位，主要从事药用植物资源利用与评价研究工作．
* 通讯作者简介:耿开友(1968-)，男(汉族)，云南澄江人，昆明学院副教
授，硕士学位，主要从事珍稀植物种苗繁育工作．
云南珍稀民族药黑蒴茎芽组织培养快繁体系研究
李育川1，房海灵2，王定康1，王海燕1，尹利方1，莫丽玲1，耿开友1*
(1 ．昆明学院，云南 昆明 650214;2 ．江苏省中国科学院植物研究所，江苏 南京 210014)
摘要:目的 建立黑蒴茎芽愈伤组织诱导、分化及生根组织培养快繁体系。方法 以黑蒴带节嫩茎芽为外植体，以 MS(1 /
2MS)为基本培养基，考察不同质量浓度 6 － BA、NAA 对愈伤组织诱导、分化及茎芽生根的影响。结果 芽茎诱导愈伤的
最佳培养基为 MS + 6 － BA 1． 0 mg /L + NAA 1． 0 mg /L + Bn80g /L + Pt50g /L + 25g /L 蔗糖 + 6g /L 琼脂，愈伤诱导率
71． 2%;愈伤分化不定芽最佳培养基为 1 /2MS + 6 － BA 0． 5 mg /L + NAA 0． 3 mg /L + Bn80g /L + Pt50g /L + 25g /L蔗糖 +
6g /L琼脂，芽诱导率为 84． 2%;茎芽生根培养基为 1 /2MS + NAA 0． 1 ～ 0． 3 mg /L + Bn80g /L + Pt50g /L + 25g /L 蔗糖 +
6g /L琼脂，生根率超过 87． 2%。结论 筛选出茎芽诱导愈伤、分化不定芽、生根的培养基，建立了黑蒴嫩茎芽组织培养快
繁体系。
关键词:黑蒴; 茎芽; 愈伤组织; 不定芽分化; 生根
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2016． 11． 072
中图分类号:Ｒ282． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2016)11-2746-04
Establishment of Tissue Culture and Ｒapid Propagation System for Melasma arvense Stem
buds，an national medicine in Yunnan
LI Yu-chuan1，FANG Hai-ling2，WANG Ding-kang1，WANG Hai-yan1，YIN Li-fang1，MO Li-ling1，GENG Kai-
you1*
(1． Kunming University，Kunming，Yunnan，650214，China;2． Institute of Botany，Chinese Academy of sci-
ences，Nanjing，Jiangsu，210014，China)
Abstract:Objective Object:The study aimed to establish the system of callus induction，differentiation and rooting． Methods
The effect of 6 － BA，NAA on callus induction，differentiation and rooting were investigated using stem bud on the basic medium．
Ｒesults The optimal medium on callus induction was MS + 6 － BA 1． 0 mg /L + NAA 1． 0 mg /L + Bn80g /L + Pt50g /L + 25g /L
sugar + 6g /L agar，the callus induction rate was 71． 2% ． The best medium for adventitious bud differentiation was 1 /2MS + 6 －
BA 0． 5 mg /L + NAA 0． 3 mg /L + Bn80g /L + Pt50g /L + 25g /L sugar + 6g /L agar，the bud inducing ratio was 84． 2% ． The
optimal medium for root formation was composed of 1 /2MS + NAA 0． 1 ～ 0． 3 mg /L + Bn80g /L + Pt50g /L + 25g /L sugar + 6g /L
agar，and the root formation rate was 87． 2% ． Conclusion Through lots of experiments，a series of micro propagation medium
were obtained，such as callus induction medium，differentiation medium and rooting medium． In vitro rapid shoot proliferation
culture of M． arvense was established．
Key words:Melasma arvense (Benth．)Hand． － Mazz．; Stem bud; Callus; Adventitions bud differentiation; Ｒoo-
ting
黑蒴 Melasma arvense (Benth．)Hand． － Mazz． 为玄参科黑
蒴属植物的全草，别名化血胆、红根草、小化血草等，为名贵苗药
“嘎扎”［1］。其性凉，微苦，具有祛湿，平肝，清热利湿;散瘀活血
等功效，主要用于治疗早期白血病、心血管病、肿瘤、黄疸型肝炎、
肝肿大、跌打伤瘀肿、痛经等［1 ～ 3］。现代药理研究证明，黑蒴具有
泻下、抗肿瘤作用［4 ～ 6］。黑蒴为云南省极小名贵珍稀物种，具有
可开发为治疗早期白血病、各类肿瘤和化血、溶血(死血、於血、
血栓)特效药的巨大潜力，因野生资源破坏严重，急需对其进行
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资源保护和人工种植研究。目前除笔者本人已申请黑蒴组培、炼
苗及种子引发的专利外，国内外还未见到任何有关人工种植的相
关报道［7 ～ 9］，本研究以黑蒴带芽嫩茎为接种外植体，系统研究黑
蒴茎芽诱导愈伤组织、分化、茎芽生根培养基配方，以期建立黑蒴
茎芽快繁技术体系，为黑蒴优良种苗生产提供科学依据。
1 材料
供试植株及种子于 2011 年采自云南河口县莲花滩，经昆明
学院李育川教授鉴定为黑蒴 Melasma arvense (Benth．)Hand． －
Mazz． 。
1． 1 培养基制备及灭菌 制备的 MS培养基和 1 /2MS培养基分
别添加 Bn80g /L + Pt50g /L + 琼脂 6． 5g /L + 蔗糖 25 g /L，pH
5． 8，经 121 ℃高温灭菌 25min［10］。
1． 2 外植体的消毒处理 将剪取的嫩茎枝用饱和洗衣粉溶液清
洗，流水冲洗 2 h。移至超净工作台，采取用 75%乙醇浸泡 5 ～
8S，无菌水清洗 2 次，再放入 2%次氯酸钠溶液中浸泡 20min，无
菌水冲洗 2 次，吸干水分，剪除叶片，保留完整茎芽，接种后观
察。
1． 3 接种数量及接种后培养条件 实验中每处理接种 10 瓶，每
瓶接种 3 个材料，每处理接种 30 个材料，均重复 3 次。接种后的
材料放置在温度(22 ± 2)℃，光照强度 2000 Lx，光照时间 10 ～ 12
h /d的条件下培养，期间观察记录材料的变化情况，到期取出材
料，洗净培养基，测量统计各类指标。
1． 4 数据统计 实验所得数据用 Excel 和方差分析软件处理。
出愈率 =形成愈伤组织的外植体总数 /接种成活的外植体总数
60d愈伤组织成活率 = 60d 愈伤组织成活总数 /接种后长出愈伤
组织外植体总数
芽分化率 =萌发不定芽的愈伤组织数 /转接愈伤组织块数
平均萌芽数 =接种后的愈伤组织成芽总数 /转接愈伤组织总块数
生根率 =转接后生根植株总数 /转接茎段总数
2 结果和分析
2． 1 茎芽诱导愈伤组织效果研究 以黑蒴带节嫩茎枝为接种材
料，以 MS为基本培养基，选择不同质量浓度 6 － BA和 NAA组合
进行培养，观察记录统计愈伤组织诱导情况。研究发现，将黑蒴
带节嫩茎枝为外植体接种到各培养基配方上，接种 40 天左右伤
口基部首先出现淡黄至红黄色不规则的愈伤组织，愈伤组织不断
膨大，快速增殖，同期部分处理的芽开始萌发，具体结果见表 1。
由表 1 可见，处理 5 诱导效果最好，当选择 1． 0 mg /L 6 － BA
和 1． 0mg /L NAA组合的培养基培养时，外植体接种 39 ± 3 天后
可长出大量愈伤组织，出愈率达 71． 2%，60d 愈伤组织成活率
84． 2%，愈伤组织有效增加量最好，愈伤组织出现较早，增长速度
较快，结构疏松，湿润，呈红黄色，后期成活较好，逐渐分化出大量
的芽;诱导效果较好的是处理 2 和处理 4，外植体接种 36 ～ 47 天
可长出愈伤组织，出愈率和 60d愈伤组织成活率均较高;处理 6、
7、8 接种后均较早出现大量的褐色或淡黄色愈伤组织，同时接种
茎芽萌发与愈伤组织同步增长，但形成的愈伤组织很快褐化，形
成的大量丛生芽生长缓慢，后期芽尖褐化，丛生芽和愈伤组织均
出现迅速褐化坏死现象;处理 9 接种后，茎芽变黄后褐化不能萌
发，极少量形成愈伤组织后快速老化，并褐化坏死。
表 1 不同生长物质对愈伤诱导的影响
处
理
6 － BA
/mg·L －1
NAA
/mg·L －1
愈伤组织诱导情况
出愈时间 /d 出愈率 /% 60d成活率 /% 有效增殖 愈伤状态
1 0． 5 0． 5 46 ± 4 32． 4d 76． 4b + 切口基本不出现淡黄色愈伤组织，接种茎芽 20d后开始直接爆发形成丛生芽，但生长缓慢，后期芽稍大量褐化逐渐坏死
2 1． 0 0． 5 44 ± 3 65． 6b 83． 8a + + 茎芽萌发，切口出现少量淡黄色愈伤组织、膨大不明显、
愈伤组织生长较慢、紧密、个小
3 1． 5 0． 5 43 ± 3 56． 8c 26． 2c + + 切口出现大量褐色或淡黄色愈伤组织、明显膨大、生长快、疏松，茎芽同时萌发，后期褐化坏死
4 0． 5 1． 0 43 ± 3 66． 4ab 80． 1ab + + + 切口出现少量红黄色愈伤组织、湿润、生长较慢、膨大明显、个较较少、后期开始变绿出现萌芽
5 1． 0 1． 0 39 ± 3 71． 2a 84． 2a + + + + 切口出现大量淡黄色或红黄愈伤组织、湿润、生长快、明显膨大、个大、后期少量
6 1． 5 1． 0 39 ± 3 72． 6a 11． 5d + 切口出现大量淡黄色或红黄愈伤组织、湿润、生长快、明显膨大、个大，芽同期萌发，后期褐化坏死
7 0． 5 1． 5 39 ± 2 64． 9b 14． 6d + 伤口膨大出现大量淡黄色或红黄愈伤组织、生长慢、个小、后期愈伤组织褐化坏死
8 1． 0 1． 5 39 ± 3 71． 4a 12． 5d + 伤口出现大量淡黄色或红黄愈伤组织、生长较快、膨大明显、个较大、后期愈伤组织褐化坏死
9 1． 5 1． 5 37 ± 2 15． 3e 0． 8e 接种材料茎芽变黄后褐化，少量形成愈伤组织后快速老化，并褐化坏死
小写字母表示处理间在 0． 05 水平上差异显著;“ +”的多少表示增殖效果的强弱;下同
2． 2 丛生芽分化效果研究 将诱导出的愈伤组织切割成大小均
匀(约 1． 0 cm × 1． 0 cm)的切块，转接到以 1 /2MS为基本培养基，
选择不同 6 － BA 浓度和 NAA 组合培养基进行培养。转接后观
察丛生芽分化情况，培养 60d后取出统计萌芽数并测量主茎长生
长度。研究发现，将黑蒴愈伤组织转接到各种培养基上，接种 25
天左右愈伤组织陆续萌发出芽丛，主芽开始生长，同期开始萌发
侧枝，生长过程中，因细胞分裂素和生长素不同组合，愈伤组织分
化成芽速度、数量有差异，丛生芽生长和分枝也表现出差异性，具
体结果见表 2。
由表 2 可见，处理 5 分化效果最好，愈伤组织转接(31 ± 4)d
后陆续萌发出大量丛生芽，芽诱导率 84． 2%，60 天丛生芽平均萌
芽数达 7． 4 个，60 天主芽长度 72． 5mm，表现出愈伤组织分化成
苗较快，丛芽分化与成芽生长同步进行，丛生芽生长旺盛，株高、
茎粗和分枝同步增加，后期无褐化和枯稍，分化形成的有效果茎
枝高，分化效果表现最好;效果较好的是处理 4、6 和 7，平均每个
愈伤组织能成功诱导出 5 ～ 8 有效茎芽，各处理间芽的分化时间
稍有提前和推后;处理 2 和处理 3，表现为萌芽时间出较早，诱导
率也较高，萌发的主芽生长也较迅速，主芽萌发以后，芽的分化基
本停止，每个愈伤上平均形成的芽数量显著减少，侧芽生长较快，
转接的愈伤组织形成有效茎芽率较低，但侧芽成有效茎芽率较
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 11 时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 11 期
高;处理 8 和处理 9，表现为转接的愈伤组织分化快，呈爆发式萌
发，形成的芽茎数量多，但成芽生长缓慢，愈伤组织迅速老化，分
化成的芽丛茎叶基本不生长，能形成有效茎芽率低，中后期芽丛
逐渐褐化坏死;处理 1 转让接后芽分化最晚，平均成芽数量也最
低，形成的芽生长缓慢，且主芽萌发后，其它芽的分化趋于停止，
茎芽整体生长缓慢且弱小，分化形成有效茎比例低。
2． 3 生根培养 将增殖扩繁的丛芽剪成 2 ～ 3cm 带 2 个节的茎
段，分别转接到添加 NAA 4 种不同质量浓度(0． 1mg /L、0． 3mg /
L、0． 5mg /L、0． 7mg /L)的 1 /2MS + Bn80g /L + Pt50g /L + 25g /L
蔗糖 + 0． 2g /LCN + 8g /L琼脂，pH 值为 5． 8 培养基上，转接后的
材料在置于光照强度 1500 ～ 2000Lx，光照 12h /d，温度 22℃下培
养，观察各处理的发根时间及苗生长情况，60d 时，将苗取出，洗
净培养基，每处理选择有 5 株有代表性的观测比较其发发根数、
根系长度。
通过比较发现，处理 1 和处理 2 生根培养效果最佳，接种后
生根时间分别为 21 ± 3、23 ± 4，生根率分别为 87． 2%、88． 6%，
60d平均生根条数分别为 6． 4、6． 6 条，60d 平均根长 27． 6mm、
25． 3mm，两处理生根率、60d平均根数和平均根长显著高于其它
处理，且两者差异不显著，整体表现为植株生长快，分枝多，叶大，
茎粗，根系壮，呈红色生长较快，分枝多，茎杆较粗呈紫红色，根系
较粗，呈深红色;其次为处理 3，其生根时间较晚，生根率较低，根
系生长势弱，其生根率、60d平均根数和根长显著低于其它处理 1
和处理 2，转接后基部切口膨大，红黄色愈伤组织恢复生长，根系
生长慢，地上部生长势较弱，分枝少，叶色淡，叶小、茎较细，壮苗
比例较低;处理 4 生根效果最差，其生根率、60d平均根数和根长
显著低于其它处理，转接后基部切口快速度形成大量愈伤组织，
根和芽萌发慢，芽色淡，芽和叶萎缩卷曲，生长停止，茎芽分枝少，
根系基本不萌发，材料黄化逐渐枯死。
表 2 不同生长物质对愈伤组织分化的影响
处
理
6 － BA
/mg·L －1
NAA
/mg·L －1
不生芽诱导情况
萌芽时间
/d
芽诱导率
/%
60d平均
萌芽数 /个
60d主茎长
/mm
有效增殖 芽状态
1 0． 2 0． 1 36 ± 3 56． 2C 1． 2d 38． 8c + 分化慢，萌芽晚且少，极少形成的茎芽，叶色淡黄、苗细、长势弱小
2 0． 5 0． 1 33 ± 4 77． 4b 2． 8c 70． 2a + + + 萌发较早，成芽茎量少，主茎芽生长后，愈伤组织分化基本停止，主茎和侧芽生长较快
3 0． 8 0． 1 32 ± 3 76． 1b 3． 1c 69． 4a + + + 萌发较早，成芽量少，主茎开始生长后，愈伤组织分化基本停止，主茎和侧枝快速生长，芽稍褐化
4 0． 2 0． 3 34 ± 4 81． 6a 5． 8b 56． 8b + + + 萌发较慢、茎芽生长较慢，主茎生长较粗壮、叶较大、长势强、但分枝和萌芽较少，分化形成的有效茎芽较低
5 0． 5 0． 3 31 ± 4 84． 2 a 7． 4a 72． 5a + + + + 萌发快、芽生长较快、茎粗、叶较大、主茎和侧芽长势强、小萌芽成有效茎芽比例高
6 0． 8 0． 3 30 ± 3 85． 5a 7． 4a 43． 1b + + + 萌发快、小芽多、茎细、叶小、前期萌发快、小芽数量多、生长慢、主茎生长不明显
7 0． 2 0． 5 34 ± 4 81． 8ab 5． 6b 41． 6b + + 萌发较慢、伴随着愈伤组织生长、小芽多、茎细、叶小、后期小萌芽逐渐枯死
8 0． 5 0． 5 29 ± 2 78． 8b 7． 6a 34． 4d + 前期萌发快、小芽量多、茎细嫰、叶小、生长慢、后期小萌芽逐渐老化
9 0． 8 0． 5 25 ± 4 77． 4b 8． 0a 23． 5e 芽爆发、不定芽数量多、茎细、叶小、生长慢、后期小萌芽快速褐化枯死
表 3 不同生长物质对生根的影响
处
理
浓度
/mg·L －1
生根时间
/d
生根率
/%
60d
根条数
60d
平均根长 /mm
苗生长状况
1 0． 1 21 ± 3 87． 2a 6． 4 a 27． 6 a 植株生长较快，分枝多，叶大，茎粗，根系壮，
2 0． 3 23 ± 4 88． 6a 6． 6 a 25． 3 a 呈红色，壮苗率高
3 0． 5 30 ± 4 44． 2b 3． 4 b 8． 8 b
基部切口膨大，红黄色愈伤组织恢复生长，根系生长慢，
地上部生长势较弱，分枝少，叶色淡，叶小、茎较细，壮苗率较低
4 0． 7 33 ± 4 18． 6c 1． 6 c 0． 2 c 基部形成大量愈伤组织，芽萌发慢，芽和叶萎缩卷曲，生长停止，分枝少，黄化逐渐枯死、根系不萌发，
3 结论和讨论
以黑蒴带节嫩茎枝为外植体，将其剪成 2 ～ 3cm带节嫩茎枝，
经饱和洗衣粉溶液清洗 3 次，流水冲洗 2 h，移至超净工作台，采
取用 75%乙醇浸泡 5 ～ 8s，快速取出后用无菌水清洗 2 次，再放
入 2%次氯酸钠溶液(含数滴聚山梨酯 － 80)中浸泡 20min，无菌
水冲洗 4 ～ 5 次，用无菌纸吸干水分后，接种到 MS + 6 － BA 1． 0
mg /L + NAA 1． 0 mg /L + Bn80g /L + Pt50g /L + 25g /L蔗糖 + 6g /
L琼脂，pH值 5． 8 的培养基上，接种后放置在光照强度 1500 ～
2000Lx，光照 10h /d，温度 22℃下培养，接种(39 ± 3)天后可长出
大量愈伤组织，出愈率达 71． 2%，60d愈伤组织成活率 84． 2%;将
愈伤组织转接到 1 /2MS + 6 － BA 0． 5 mg /L + NAA 0． 3 mg /L +
Bn80g /L + Pt50g /L + 25g /L蔗糖 + 6g /L 琼脂的分化培养基上，
在相同条件下培养，转接(31 ± 4)天后陆续萌发出大量不定芽，芽
诱导率 84． 2%，60 天丛生芽平均萌芽数达 7． 4 个，60 天主芽长度
72． 5mm;将分化成的嫰茎枝剪成 2 ～ 3cm，转接到 1 /2MS + NAA
0． 1 － 0． 3 mg /L + Bn80g /L + Pt50g /L + 25g /L 蔗糖 + 6g /L 琼脂
的生根培养基上，在相同条件下培养，接种 18d后开始生根，生根
率达 87． 2%，60d 平均生根条数为 6． 4 条，60d 平均根长可达
27． 6mm。
以黑蒴嫩茎枝、愈伤组织接种到 MS(或 1 /2MS)为基本培养
基，选择不同浓度的细胞分裂素类物质(6 － BA)和生长素类物质
(NAA)进行愈伤组织诱导、分化和生根培养，发现当 6 － BA 和
NAA的质量浓度微小变化时，其愈伤组织诱导、分化和生根的效
果差别非常显著，培养物的生长对植物生长调节剂的响应很敏
感，这说明黑蒴对细胞分裂素类物质和生长素类物质均可能比较
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繁感，因此在黑蒴嫩茎枝组培过程中对植物生长调节剂的适用浓
度范围可能也较窄，这与朱丽芳等开展的老鸦瓣芽茎诱导愈伤组
织有相似之处［10］，利用黑蒴其它器官培养时对植物生长调节剂
的种类和使用浓度还有待进一步研究。
图 1 黑蒴茎芽愈伤组织诱导、分化及生根
研究发现，将黑蒴带节嫩茎枝为外植体接种到 6 － BA 和
NAA混合的培养基上，接种 40 天左右伤口基部首先出现淡黄至
红黄色不规则的愈伤组织，愈伤组织不断膨大，快速增殖，同期定
芽(顶芽和侧芽)也开始萌发生长。在实验中发现不同的配比，
其愈伤组织和芽的诱导增殖效果完全不同，当 NAA浓度较高时，
接种茎芽以愈伤组织分化为主，芽萌发基本停止，愈伤组织生长
呈爆发式增加，中后期愈伤组织容易老化变褐坏死;当 6 － BA 和
NAA都是较低时，愈伤组织和定芽的生长都很难诱导成功;当配
方中 6 － BA和 NAA浓度均中等时，则可有效诱导出愈伤组织，同
时也能促进定芽有效增殖;当配方中 6 － BA 浓度较高时，接种茎
芽以定芽萌发生长为主，接种茎枝爆发形成大量定芽，而愈伤组
织生长量则较少，但形成的定芽生长缓慢，后期芽稍褐化坏死，很
难形可转接的有效枝芽，培养中这与现象的出现与绞股蓝［12］、桂
黔吊石苣苔茎段诱导丛芽［13］的报道出现相相似的现象。可利用
茎芽直接诱发定芽实现增殖这一现象，通过调节 6 － BA 浓度，建
立茎枝黑蒴直接诱发定芽、增殖和生根培养的另一组培快繁体系
值得深入研究。
实验发现，以黑蒴带节嫩茎转接到只添加有较低 NAA(0． 1
～ 0． 3mg /L)的 1 /2MS 基本培养基上，置于光照强度 1500 ～
2000Lx，光照 12h /d，温度 22℃下培养，很容易实现生根，说明较
低的无机盐及离子浓度和较低的生长素有利用黑蒴生根，相反则
不利用于生根，这一结果与李林轩等报道的五指毛桃生根根培养
出现相以的现象［14］。在生根培养实验中还发现，以黑蒴带节嫩
茎为材料，进行生根培养较容易生根，根据这一现象，今后利用黑
蒴带节嫩茎开展扦插技术研究，实现其扦插快繁具有巨大应用前
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 11 时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 11 期