全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2013)03 － 1164 － 05
收稿日期:2013 － 01 － 12
基金项目:贵州省优秀青年科技人才培养对象专项资金“野生
葡萄种质资源的离体保存与遗传变异”［黔科合人字(2009)02］
作者简介:甘 专(1986 －) ，男，在读硕士，研究方向:果树种质
资源与遗传育种，E-mail:15971398379happy@ 163． com，* 为通
讯作者。
毛葡萄茎尖的离体培养与植株再生
甘 专1，2，刘 伟1，2，马孟增1，2，潘学军1，2*
(1．贵州省果树工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025;2．贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025)
摘 要:为了建立毛葡萄茎尖离体培养及植株再生体系，给野生毛葡萄种质资源的超低温保存和无毒苗木培育提供参考，以花溪-4
和农院-11 毛葡萄组培苗的茎尖为材料，研究植物生长调节剂及浓度配比对毛葡萄茎尖离体培养与植株再生的影响。结果表明:
毛葡萄茎尖离体培养与增殖培养的适宜培养基为 MS + BA 1． 5 mg /L + IBA 0． 02 mg /L，离体培养成活率达 93． 8 %以上，增殖率和
增殖系数分别为 88． 6 %和 5． 8;茎尖生根培养的适宜培养基为 1 /2MS + IBA 0． 05 ～ 0． 15 mg /L + IAA 0． 2 mg /L，生根成苗率为 100
%，建立了毛葡萄茎尖组织培养和植株再生的技术体系。
关键词:毛葡萄;茎尖;离体培养;植株再生
中图分类号:S663． 1 文献标识码:A
In Vitro Shoot-tip Culture and Ｒegeneration of Vitis heyneana
GAN Zhuan1，2，LIU Wei1，2，MA Meng-zeng1，2，PAN Xue-jun1，2*
(1． Guizhou Engineering Ｒesearch Center for Fruit Crops，Guizhou Guiyang 550025，China;2． Agriculture College，`Guizhou University，
Guizhou Guiyang 550025，China)
Abstract:Effects of proportion and concentration of plant growth regulators on shoot-tip culture and regeneration in vitro was studied using
two individuals(Vitis heyneana Huaxi-4 and Nongyuan-11 as materials to construct the in vitro shoot-tip culture and regeneration system of V．
heyneana． The results showed that MS + 6-BA 1． 5 mg /L + IBA 0． 02 mg /L was an appropriate medium for shoot-tip culture and regeneration
of V． heyneana． The survival rate and reproducibility rate were more than 93． 8 % and 88． 6 %，respectively． Multiplication coefficient was
more than 5． 8． 1 /2MS + IBA 0． 05 ～ 0． 15 mg /L + IAA 0． 2 mg /L was an optimal medium for rooting culture，the rooting rate was 100 % ．
The system for in vitro shoot-tip culture and regeneration of V． heyneana was successfully established．
Key words:Vitis heyneana;Shoot-tip;In vitro culture;Plant regeneration
毛葡萄是我国特有的野生葡萄种质资源，分布
于全国 10 多个省(市、区) ，抗病性和抗逆性
强［1 － 4］，是葡萄抗性育种的优良亲本材料，其搜集和
保存利用研究工作深受葡萄育种家的重视［5］。利
用大田种植保存葡萄种质资源需耗费大量人力、物
力和财力，且易受到病虫侵害和恶劣环境威胁;组织
培养保存需多次继代，容易引起部分遗传性状改变，
只能进行中短期保存，而超低温保存可使细胞的代
谢活动和生长停止，不仅遗传稳定性好，而且可以脱
除病毒［6］，是植物种质资源长期保存的理想途径。
茎尖离体培养及再生是超低温保存的一个关键步
骤，也是超低温保存成功的前提［7］。目前，葡萄属
植物茎尖培养的研究主要集中在栽培品种上［8 ～ 9］，
李霞等［10］和刘伟等［11］曾对野生毛葡萄单芽茎段的
离体快繁进行了研究，而对野生毛葡萄茎尖进行离
体增殖培养和植株再生的研究尚未见报道。为此，
笔者以花溪-4 和农院-11 毛葡萄品种为材料，研究
其离体培养与植株再生的适宜培养基，以期建立毛
葡萄茎尖离体培养及植株再生体系，为野生毛葡萄
种质资源超低温保存及无毒苗木培育奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
花溪-4 和农院-11 野生毛葡萄(Vitis heyneana
Ｒoem． et Schult)组培苗茎尖，由贵州省果树工程技
术研究中心组织培养室提供。
4611
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
2013 年 26 卷 3 期
Vol. 26 No. 3
DOI:10.16213/j.cnki.scjas.2013.03.072
表 1 U5(5
3)设计的因素水平表
Table 1 U5(53)factors and level design
处理
Treatments
IBA浓度(mg /L)
IBA concentration
x1
IAA浓度(mg /L)
IAA concentration
x2
1 0． 05(1) 0． 05(2)
2 0． 10(2) 0． 15(4)
3 0． 15(3) 0． 00(1)
4 0． 20(4) 0． 10(3)
5 0． 25(5) 0． 20(5)
1． 2 方法
1． 2． 1 茎尖的初代培养与增殖 在解剖镜下剥取
无菌苗茎尖 1 ～ 2 mm长，叶原基 1 ～ 2 个，接种到初
选并添加 BA 1． 5 mg /L和 IBA 0． 02 mg /L的 MS 茎
尖培养上，培养 7 d统计茎尖存活率(以茎尖萌发出
小叶片为存活标准)。选取初代培养存活茎尖接种
到 MS培养基上，并添加不同浓度的 BA(1． 0，1． 5，
2． 0 mg /L)和 IBA(0． 01，0． 02 mg /L)植物生长调节
剂进行茎尖增殖培养。试验于 2011 年 9 月至 2012
年 5 月在贵州省果树工程技术研究中心进行，采用
完全随机区组设计，每处理接种 36 个茎尖，30 d 统
计增殖率、增殖系数和生长情况。
1． 2． 2 生根培养 剪取茎尖增殖产生的 4 芽茎段
接种到生根培养基上诱导生根。以 1 /2MS 为基础
培养基，IBA 和 IAA 浓度的添加采取均匀设计法，
按 U5(5
3)方法［12］安排试验(表 1) ，x1 为 IBA浓度，
x2 为 IAA浓度。样本数 n = 36，14 d统计生根率、不
定根数、须根数和愈伤率。根据回归方程得出最优
激素配比，将优化配比进行验证试验(样本 n = 90) ，
14 d统计生根情况。上述培养基中均添加 3 %的蔗
糖和 0． 5 %的琼脂，pH为 5． 8 ～ 6． 0。培养温度(25
± 1)℃，光周期 16 h /8 h(光 /暗) ，光照强度为 40
mmol /(m2·s)。
1． 2． 3 试管苗移栽 按照潘学军等［13］方法进行。
1． 3 数据处理
按下列方法统计茎尖离体培养存活率，增殖过
程中的增殖率、增殖系数及生根过程中的生根率和
愈伤率。利用 DPS 软件对生根率进行逐步回归分
析［12］，得出回归方程及生根配方的最优组合。
存活率 = (萌发茎尖数目 /接种茎尖数目)×
100 %
增殖率 = (茎尖增殖数目 /接种茎尖数目)×
100 %
增殖系数 =培养增长节位数 /接种时节位数
生根率 = (诱导生根茎段数 /接种茎段数)×
100 %
愈伤率 =(诱导出愈伤组织的茎段数 /接种数
茎段数)× 100 %
2 结果与分析
2． 1 毛葡萄茎尖离体培养的存活率
由图 1-A看出，毛葡萄无菌茎尖接种培养到 MS
A．离体培养 3 d的无菌茎尖;B．离体培养 7 d无菌茎尖;C．增殖培养 30 d的试管苗;D．成苗植株;E．生根培养;F．植株移栽 15 d的生长情况
A． Sterile shoot-tips cultured in vitro for 3 days;B． Sterile shoot-tips cultured in vitro for 7 days;C． Shoot-tips multiplication at 30 d;D． Ｒegeneration
plant;E． Ｒooting culture;F． Status of transplanted seedling at 15 d
图 1 毛葡萄茎尖的离体培养与移栽成活的试管苗
Fig． 1 In vitro culture of shoot-tip and acclimation of V． heyneana
56113 期 甘 专等:毛葡萄茎尖的离体培养与植株再生
表 2 添加不同植物生长调节剂的毛葡萄茎尖增殖情况
Table 2 Multiplication status of V． heyneana with adding different plant growth regulators
单株
Individuals
BA
(mg /L)
IBA
(mg /L)
增殖率(%)
Ｒeproducibility
增殖系数
Multiplication
coefficient
组培苗生长情况
Growth of tissue
culture seedling
花溪-4 Huaxi-4 1． 0 0． 01 33． 3 3． 2 叶淡绿色，节间短，幼苗矮小
0． 02 45． 5 4． 3 叶绿色，植株生长健壮
1． 5 0． 01 59． 8 4． 0 叶绿色，植株矮小
0． 02 88． 6 6． 0 叶绿色，植株高，生长健壮
2． 0 0． 01 25． 0 2． 0 叶淡绿色，植株矮小，大量愈伤组织
0． 02 15． 8 1． 0 叶黄色，植株矮小，大量愈伤组织
农院-11 Nongyuan-11 1． 0 0． 01 30． 4 2． 2 叶淡绿色，幼苗矮小，有少量愈伤组织
0． 02 40． 8 4． 5 叶绿色，植株生长健壮
1． 5 0． 01 56． 5 4． 1 叶绿色，节间较短
0． 02 90． 0 5． 8 叶绿色，植株高生长健壮
2． 0 0． 01 22． 5 1． 1 叶黄绿色，植株矮小，有大量愈伤组织
0． 02 11． 7 1． 0 叶黄色，植株矮小或停止生长，有大量愈伤组织
培养基 3 d其茎尖顶端开始突起，7 d茎尖分化的芽
长为 5 mm 左右(图 1-B) ，茎尖萌发绿色小叶片，部
分茎尖基部产生愈伤组织，花溪-4 和农院-11 的初
代培养存活率分别为 93． 8 %和 95． 6 %，均可用于
增殖培养。
2． 2 植物生长调节剂对毛葡萄茎尖增殖的影响
由表 2 可知，不同浓度的植物生长调节剂可明
显影响毛葡萄茎尖的生长和增殖率。IBA 浓度一定
时，BA 浓度的提高有助毛葡萄茎尖增殖，当 BA 浓
度为 2． 0 mg /L 时，毛葡萄茎尖的增殖系数大幅降
低;当 BA 浓度为 1． 0 和 1． 5 mg /L 时，0． 02 mg /L
IBA的增殖率最高;当 BA 浓度为 2． 0 mg /L 时，低
浓度 IBA的增殖效果优于高浓度。说明，细胞分裂
素 BA对毛葡萄茎尖增殖的影响大于细胞生长素
IBA。综合 BA和 IBA各浓度配比可知，当 BA为 1．
5 mg /L、IBA为 0． 02 mg /L，即培养基为 MS + BA 1．
5 mg /L + IBA 0． 02 mg /L 时，毛葡萄茎尖的增殖率
和增殖系数最高，增殖率为 88． 6 %(花溪-4)和 90．
0 %(农院-11) ，增殖系数为 6． 0(花溪-4)和 5． 8(农
院-11) ，该培养条件下，培养 30 d，茎尖生长健壮，茎
尖分化的芽长为 3 cm 左右，节间明显，叶片颜色嫩
绿，茎尖底部有少量黄绿色愈伤组织，并有少量不定
根(图 1-C) ;当 BA 浓度为 2． 0 mg /L、IBA 为 0． 02
mg /L时，增殖率和增殖系数最低，增殖率为 15． 8 %
(花溪-4)和 11． 7 %(农院-11) ，增殖系数均为 1． 0，
此时，叶片为黄色或黄绿色，植株矮小甚至停止生
长，并伴有大量愈伤组织产生，已不适合毛葡萄茎尖
增殖。
2． 3 植物生长调节剂对毛葡萄生根的影响
由表 3 可知，不同浓度及配比的 IBA 和 IAA 植
物生长调节剂对毛葡萄茎尖再生植株生根的影响较
大，培养基中添加浓度为 0． 10 mg /L的 IBA和 0． 15
mg /L的 IAA时，2 个品种的生根率均达 90 %以上。
在 IAA和 IBA 浓度均为 0． 05 mg /L 时，农院-11 的
生根率超过 90 %，而花溪-4 的生根率仅为 33． 9 %;
培养基中添加 IBA浓度为0 ． 1 5 mg / L，不添加
表 3 添加不同植物生长调节剂的毛葡萄生根情况
Table 3 The rooting status of V． heyneana with adding different plant growth regulators
处理
Treatments
生根率(% )
Ｒooting rate
不定根(须根)数 /条
The number of taproot or fibrous roots
愈伤率(% )
Callus rate
花溪-4 农院-11 花溪-4 农院-11 花溪-4 农院-11
1 33． 9 90． 7 1． 0(0． 0) 1． 0(1． 1) 66． 7 0． 0
2 90． 0 96． 9 1． 0(3． 3) 1． 8(2． 9) 0． 0 0． 0
3 98． 3 68． 8 1． 6(4． 8) 1． 0(0． 2) 0． 0 0． 0
4 75． 0 45． 5 1． 0(0． 3) 1． 4(0． 3) 0． 0 0． 0
5 49． 4 39． 7 1． 0(0． 1) 1． 0(0． 0) 13． 7 7． 7
注:表中括号内数据表示须根数。
Note:Data in the bracket represented the number of fibres．
6611 西 南 农 业 学 报 26 卷
IAA时，花溪-4 的生根率最高，为 98． 3 %，而农院-
11 的生根率仅为 68． 8 %，说明植物生长调节剂及
浓度配比对毛葡萄茎尖再生植株的生根率有较大影
响，且不同品种间存在明显差异。
2． 4 生根培养基与生长调节剂的优化
为进一步优化毛葡萄品种的最佳生根的培养基
植物生长调节剂浓度配比，对其生根率进行逐步回
归分析结果表明，花溪-4 的生根率与植物生长调节
剂浓度的回归方程 Y生根率 = － 46． 86 + 1950． 23x1 －
6805． 43 x21 + 617． 00x1x2(x1 为 IBA 的浓度，x2 为
IAA的浓度，下同) ，相关系数 Ｒ = 0． 9804(P ＜ 0．
05) ;而农院-11 的回归方程 Y生根率 = 94． 33 － 1310．
33 x21 + 667． 96 x
2
2，相关系数 Ｒ = 0． 9943(P ＜ 0． 05) ，
说明 IAA和 IBA 对 2 个毛葡萄品种茎尖再生芽的
生根率均有较大影响。
由方程可知，在试验浓度范围内，花溪-4 的生
根率随 x1 的升高呈抛物线变化，且与 x2 呈正线性
相关关系。当 x1 为 0． 15，x2 为 0． 2 时，Y有最大值，
即 IBA浓度为 0． 15 mg /L，IAA浓度为 0． 2 mg /时的
生根率最高，为 111． 09 %。同样，农院-11 的生根率
与 x1 呈递减关系，与 x2 呈递增关系，即当 IBA 浓度
为 0． 05 mg /L，IAA 浓度为 0． 2 mg /L 时，其生根率
最高，为 117． 77 %。将拟合方程获得的结果进行验
证，将花溪-4 和农院-11 毛葡萄品种的再生茎段分
别接种到添加 IBA 浓度为 0． 15 mg /L、IAA 浓度为
0． 2 mg /L和 IBA浓度为 0． 05 mg /L、IAA 浓度为 0．
2 mg /L的培养基中进行生根培养，均在 7 d 开始生
根，10 d左右产生须根，14 d 生根率均达 100 %，试
验实际与调节剂优化组合相符。生根培养 30 d 时，
根长达 4． 5 cm，根系粗壮，没有愈伤组织产生，株高
7 cm 左右，叶片颜色浓绿(图 1-D，E)。经无菌炼
苗、培养室炼苗和温室炼苗，移栽成活率达 100 %。
移栽 15 d，植株生长健壮，不定根发达，须根较多，叶
色浓绿(图 1-F)。因此，花溪-4 和农院-11 毛葡萄品
种茎尖进行组织培养再生的适宜生根培养基分别为
1 /2MS + IBA 0． 15 mg /L + IAA 0． 2 mg /L 和 1 /2MS
+ IBA 0． 05 mg /L + IAA 0． 2 mg /L。
3 结论与讨论
(1)研究结果表明，毛葡萄茎尖离体培养与增
殖培养的适宜培养基为 MS + BA 1． 5 mg /L + IBA 0．
02 mg /L，离体培养存活率达 93． 8 %以上，增殖率和
增殖系数分别为 88． 6 %和 5． 8;茎尖生根培养的适
宜培养基为 1 /2MS + IBA 0． 05 ～ 0． 15 mg /L + IAA
0． 2 mg /L，生根成苗率为 100 %。
(2)植物器官的再生可分 5 类:短枝发生型、丛
生芽发生型、不定芽发生型、胚状体发生型和原球茎
发生型［14］。赵艳华等［15］在研究李离体茎尖的超低
温保存过程中，茎尖的再生为不定芽发生型;蒲艳吉
等［16］研究李茎尖离体培养与植株再生过程中，茎尖
的再生为短枝发生型。本试验过程中使用的毛葡萄
茎尖再生类型为短枝发生型，研究结果表明，植物生
长调节剂种类相同，但使用浓度差异较大，即不同植
物进行再生培养使用的调节剂浓度不同。
(3)茎尖进行离体培养时，其植物生长调节剂
是关键因子，对植物生长起着决定性作用。添加生
长素和细胞分裂素的比例决定着根、芽的分化
率［17］。研究结果表明，毛葡萄茎尖离体培养增殖过
程中的细胞分裂素起主要作用，在生根过程中起主
导作用。这与顾沛雯等［9］研究结果一致。
(4)在植物组织培养过程中，常常需要进行植
物生长调节剂种类和浓度的配比试验，工作量
大［18 ～ 19］，但刘彤等［20］利用均匀设计快速有效的提
高了香梨脱毒苗生根率。本试验在生根优化培养过
程中，采用均匀设计，并通过逐步回归分析，优化出
了适宜毛葡萄茎尖离体培养的激素浓度，经验证，其
生根率和生根系数均高，缩短了毛葡萄茎尖的培养
时间，提高了工作效率，且建立了毛葡萄茎尖离体培
养及植株再生的体系。
参考文献:
［1］潘学军，李德燕，张文娥．贵州葡萄属野生种植物资源调查分析
［J］．果树学报，2010，27(6) :898 － 901．
［2］潘学军，张文娥，杨秀永．贵州喀斯特山区野生葡萄实生苗抗旱
机理研究［J］．西北植物学报，2010，30(5) :955 － 961．
［3］仲伟敏，潘学军，周金忠，等．野生毛葡萄试管苗对 PEG胁迫的形
态及生理响应［J］．西北农林科技大学学报:自然科学版，2012，
40(6) :181 － 188．
［4］潘学军，李德燕，张文娥． 贵州葡萄属 3 个野生种浆果品质分析
［J］．西北农业学报，2010，19(8) :142 － 146．
［5］姜建福，魏 伟，樊秀彩，等．中国野生葡萄分布状况与保护空缺
分析［J］．果树学报，2011，28(3) :413 － 417．
［6］Callow J A，Ford L，Newbury H J． Biotechnology and Plant Genetic
Ｒesources［M］． London:CAB International，1997． 119 － 161．
［7］Kaviani B． Conservation of plant genetic resources by cryopreservation
［J］． Australian Journal of Crop Science，2011，5(6) :778 － 800．
［8］Barlass B Y M，Skene K G M，Woodham Ｒ C． Ｒegeneration of virus-
free grapevines using in vitro apical culture［J］． Annals of Applied
Biology，1982，101:291 － 295．
［9］顾沛雯，龚玉梅，关晓庆． 葡萄茎尖培养及快速繁殖技术研究
［J］．中外葡萄与葡萄酒，2002(4) :16 － 18．
［10］刘 伟，潘学军，张文娥，等． 贵州野生毛葡萄茎段离体快繁
［J］．山地农业生物学报，2009(4) :360 － 362．
［11］李 霞，潘学军，袁 彬，等． 野生毛葡萄单芽茎段的离体快繁
培养［J］．贵州农业科学，2010(7) :12 － 14．
［12］李云雁，胡传荣．实验设计与数据处理:第二版［M］．北京:化学
工业出版社，2008． 233 － 236．
76113 期 甘 专等:毛葡萄茎尖的离体培养与植株再生
［13］潘学军，王跃进，张剑侠．葡萄胚挽救苗移栽技术的研究［J］．西
北植物学报，2004，24(6) :1077 － 1082．
［14］王 蒂．植物组织培养［M］．北京:中国农业出版社，2004．
［15］赵艳华，吴雅琴，程和禾．李离体茎尖的超低温保存［J］．园艺学
报，2008，35(3) :423 － 426．
［16］浦艳吉，李国怀，姚延兴．李茎尖离体培养与植株再生［J］．华中
农业大学学报，2009，28(2) :214 － 217．
［17］王玉英，顾晓红，高新一． 6-BA 和 IAA 对葡萄试管苗快速繁殖
的影响［J］．中国农业科学，1988，21(3) :94 － 95．
［18］曹孜义，杨德龙，梁庆丰． 内 39 号葡萄株系的离体快繁技术研
究［J］．果树学报，2002，19(6) :427 － 429．
［19］张剑侠，王贺飞，徐 炎．中国野生葡萄组织培养研究［J］．西北
植物学报，2003，23(3) :460 － 463．
［20］刘 彤，魏 鹏，赵新俊．应用均匀设计优化香梨脱毒苗生根培
养基［J］．果树学报，2006，23(4) :635 － 637．
(责任编辑 陈 静)
8611 西 南 农 业 学 报 26 卷