全 文 ：浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2014，26(3):621-625 http:/ /www． zjnyxb． cn
杨婷，崔志刚，陈段芬． 不同处理方法对 3 种大丽花病毒的脱毒效果比较［J］．浙江农业学报，2014，26(3):621-625．
DOI:10. 3969 / j． issn． 1004-1524. 2014. 03. 15
收稿日期:2013-12-02
基金项目:河北省林业局资助项目(1118411)。
作者简介:杨婷(1988—)，女，河北定州人，在读硕士，主要从事
观赏植物组织培养研究。E-mail:yangting19880628@ sina． com
* 通讯作者，陈段芬，E-mail:chenduanfen@ 163． com
不同处理方法对 3 种大丽花病毒的脱毒效果比较
杨 婷1，崔志刚2，陈段芬1，*
(1 河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071000;2 河北农业大学 国土资源学院，河北 保定 071000)
摘 要:为了进一步完善大丽花脱毒技术，获得优质大丽花脱毒苗，以感染大丽花花叶病毒(DMV)、黄瓜花
叶病毒 (CMV-D2)和烟草花叶病毒(TMV)的大丽花为试材，采用茎尖结合热处理、化学处理方法对大丽花脱
毒效果进行了探讨。各培养单株经酶联免疫法(ELISA)检测，结果表明，茎尖结合热处理能有效脱除 DMV
和 CMV-D2，脱毒率分别达到 74. 7%和 66. 9%，但不能有效脱除 TMV，对 3 种病毒均脱除的比率为 10. 6%;茎
尖结合化学处理能有效脱除 DMV，CMV-D2 和 TMV，脱除率分别为 83. 1%，80. 5%和 77. 1%，对 3 种病毒的
脱除率为 24. 3%。
关键词:大丽花;茎尖;热处理;化学处理;脱毒
中图分类号:S 682. 261 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2014)03-0621-05
Comparison of different detoxification methods on three Dahlia virus
YANG Ting1，CUI Zhi-gang2，CHEN Duan-fen1，*
(1College of Horticulture，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，China;2College of Land Ｒesources，
Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，China)
Abstract:In order to improve the detoxification technology of Dahlia pinnata，acquire high-quality virus-free
seedlings，Dahlia pinnata infected with dahlia mosaic virus (DMV)，cucumber mosaic virus (CMV-D2)and
tobacco mosaic virus (TMV)were used as experimental material，the effects of heat treatment，chemical treatment
methods combined with stem tip culture on detoxification were studied in this paper． The results of enzyme-linked
immunoassay (ELISA)showed that stem tip in combination with heat treatment could effectively remove the DMV
and CMV-D2，and virus-free rate was 74. 7% and 66. 9% respectively，but it could not remove TMV effectively，
while the removal rate of three kinds of viruses was 10. 6% ． Stem tip method combined with chemical treatment could
effectively remove the DMV，CMV-D2 and TMV，and virus-free rate was 83. 1%，80. 5% and 77. 1% respectively，
while virus-free rate of all the three was 24. 3% ．
Key words:Dahlia pinnata;stem tip;heat treatment;chemical treatment;detoxification
大丽花(Dahlia pinnata)是菊科大丽花属多
年生球根花卉，原产于墨西哥和危地马拉地带，
因其品种繁多、花型多变、色彩丰富在世界各地
广为种植，是世界上品种最多的花卉植物之一。
目前栽培品种超过 3 万余个，分为单瓣型、卷瓣
型、圆球型、蜂窝型、装饰型、仙人掌型、托桂型
等。花色有红、黄、橙、紫、淡红和白色等单色以
及多种更为绚丽的复色［1］。其应用范围广泛，可
作花篱、花境、花坛，也可做盆花、切花之用，是世
界著名的球根名花之一，在我国被誉为“天竺牡
丹”［2 － 3］。
长期以来，大丽花一直采用块根分切或块
根萌发的嫩枝作扦插繁殖，加之蚜虫传播、汁液
接触等，导致病毒病在世界范围内发生严重。
我国广东、广西、内蒙古等省(自治区)及银川、
南京、沈阳和上海等市均有发生［4］。主要症状
表现为花叶、叶片畸形、植株黄化矮小、开花不
良等。
国外对大丽花病毒种类、分布及检测方面的
研究取得了许多进展。据报道，目前在大丽花上
发现的病毒有大丽花花叶病毒(DMV)、黄瓜花叶
病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)、凤仙花坏死
斑病毒 (INSV)、番茄斑萎病毒(TSWV)、烟草环
斑病毒(TＲSV)、番茄环斑病毒(ToＲSV)、烟草条
纹病毒(TSV)、番茄斑萎病毒 (TSWV)、烟草脆
裂病毒(TＲV)及马铃薯 y 病毒(PVY)等约 20 余
种。其中，影响最为普遍的有 DMV，CMV，TMV，
INSV，TSV，TSWV等［5］。
控制大丽花病毒病发展最有效的方法是使
用无毒材料进行繁殖，所以国内外主要围绕种
苗脱毒技术开展研究，常用的脱毒方法有茎尖、
花瓣组培脱毒。Naka 等［6］研究认为用普通的
茎尖分生组织栽培很难生产出完全的脱病毒苗
木，但是这样的苗木经 4 ～ 5 年繁殖后比分株而
来的苗木能更好地生长。Sediva 等［7］认为大丽
花花叶病毒可以用茎尖培养的方法根除，茎尖
大小在 0. 4 ～ 0. 5 mm 和 0. 9 ～ 1. 0 mm 时，DMV
的根除率分别为 50%和 9%。满贵武等［8］试验
也证明茎尖脱毒率与茎尖大小呈反比，但单纯
的茎尖脱毒操作困难，茎尖生长慢，且脱毒率不
高。廖晴等［9］认为，用花瓣脱毒生产出的无毒
苗，丛生基数大，获得无毒苗时间缩短，并使脱
毒苗的成功率提高 20%左右，但花瓣培育的试
管苗长势弱，生根难，且取材时间短，不利于生
产推广。
为了进一步完善大丽花脱毒技术，获得优质
大丽花脱毒苗，本研究采用茎尖结合物理、化学
的脱毒方法，对大丽花带病毒试材开展脱毒试
验，旨在建立一套操作简便、快速高效且效果稳
定的脱毒体系，对大丽花种苗产业的健康发展具
有积极的指导意义。
1 材料与方法
1. 1 初次无菌外植体的获得
取带病毒的大丽花外植体，将叶子剪掉，切
成 2 ～ 3 cm长的茎段，先用洗洁精浸泡 5 min，用
自来水冲洗 2 h，然后在超净工作台上用 70%酒
精浸泡 30 s，用无菌水冲洗 1 次，再用 0. 1%升汞
处理 4 ～ 7 min，用无菌水冲洗 4 次，并以无菌滤
纸吸干水分［10］。切取的顶芽和侧芽接种在 MS +
4 mg·L －1 6-BA + 0. 2 mg·L －1 NAA 的茎尖诱导
培养基上，蔗糖含量为 3%，琼脂浓度 0. 6%。培
养光强为 1 000 ～ 2 000 lx，光周期为 14 h∶ 10 h
(L /D)。培养室温度为(25 ± 2)℃。
1. 2 继代增殖培养
将诱导成苗的大丽花切段快繁，接种在 MS
+1. 5 mg·L －1 6-BA + 0. 3 mg·L －1 NAA 的增殖
培养基上，10 d 后可长出 2 ～ 10 个丛生芽，30 d
后丛生芽可长到 3 ～ 10 cm。
1. 3 脱毒处理方法
1. 3. 2 茎尖结合热处理
大丽花的热处理脱毒在人工气候室内进行。
切取长度为 1 cm 的嫩尖于 25℃培养 3 d 后，将
30 瓶(每瓶接种 4 个嫩尖)试管苗放入人工气候
室中进行热处理。如图 1 所示，起始温度设置为
光照下 28℃;黑暗下 25℃，以后每 1 d 升高 1℃，
进行热锻炼。第 9 天时，光照下温度升至 36℃;
黑暗下温度升至 33℃，开始进行热处理。将热处
理 15，20，25 天即图 1 所示的第 23，28，33 天的组
培苗剥取茎尖约 1. 0 mm，接种 20 个茎尖转移到
MS +4 mg·L －1 6-BA + 0. 2 mg·L －1 NAA的茎尖
图 1 热处理时间变化图
Fig． 1 Temporal variation of heat treatment
·226· 浙江农业学报 第 26 卷 第 3 期(2014 年 5 月)
诱导培养基上于 25℃培养。一个月后转移到 MS
+1. 5 mg·L －1 6-BA + 0. 3 mg·L －1 NAA 的增殖
培养基上培养，待试管苗长到 5 ～ 10 cm 后，切取
叶片或幼嫩组织进行病毒检测。
1. 3. 3 茎尖结合化学处理
切取无菌苗嫩尖 1 cm，接种在添加不同浓度
病毒唑(三氮唑核苷)的培养基中，病毒唑浓度设
置为 0(CK)，5，10，15，20，25 mg·L －1，每个处理
接种 20 个茎尖，处理时间为 40 d。因病毒唑不
能经过高温灭菌，所以待培养基温度降至 50 ～
60℃后，将 5 种浓度梯度的病毒唑依次采用高温
灭菌后的注射器以 0. 22 μm 孔径的滤膜进行过
滤灭菌。40 d后切取 1. 0 mm茎尖转移到不含病
毒唑的茎尖诱导培养基上进行培养。一个月后
转移到增殖培养基上，待试管苗长到 5 ～ 10 cm
时，切取叶片或幼嫩组织进行检测。
1. 4 病毒检测
称取 500 mg 新鲜脱毒大丽花植株的叶片，
加 4. 5 mL pH 7. 4 的磷酸缓冲液，在冰浴下充分
研磨成匀浆，研磨所得汁液于 3 000 r·min －1离心
5 min，取上清液进行双抗原夹心酶联免疫法
(ELISA)检测。试剂盒(ELISA-Kits)由北京鑫方
程生物技术有限公司提供，分别为 FU-E11949 大
丽花花叶病毒(ELISA)试剂盒，FU-E11916 烟草
花叶病毒(ELISA)试剂盒，FU-E11918 黄瓜花叶
病毒(ELISA)试剂盒，具体试验步骤和操作方法
也严格按照其提供的相关技术资料实施。显色
反应相关参数的获得通过酶标仪(伯乐 680)测
定，在 405 nm波长下读取的样品吸光值，与阴性
对照吸光值比大于 2. 5 则认定为阳性反应，反之
为阴性反应。
2 结果与分析
2. 1 热处理时间对试管苗生长的影响
如表 1 所示，随着热处理时间的延长，试管
苗逐渐愈伤化，成活率逐渐降低，热处理 25 d后，
试管苗死亡现象严重增加。分别切取热处理 15，
20，25 d 的茎尖约 1 mm 转移到大丽花诱导培养
基上进行培养。热处理后茎尖较正常培养茎尖
萌动慢，15 d 后茎尖开始膨大变绿，25 d 后茎尖
再生出小苗，而未分化的茎尖则慢慢变褐枯死。
表 1 热处理时间对试管苗生长情况的影响
Table 1 Effect of heat treatment time on the growth of tube seedlings
热处理天数 /d 热处理芽个数 成活个数 成活率 /% 植株长势
15 100 98 98. 0 叶片较正常叶片变厚，无其他明显变化
20 98 75 76. 5 叶片明显愈伤化，部分叶片变黄
25 75 30 40. 0 植株全部愈伤化，部分植株死亡
2. 2 热处理时间对 3 种病毒脱除效果的影响
由图 2 可知，随着热处理时间的延长，3 种病
毒的脱除率均有所增加，但烟草花叶病毒(TMV)
脱除率增加不明显，均在 35% 以下，这是由于
TMV对热不敏感，应用热处理方法不易脱除。
DMV脱除率均高于 CMV-D2 脱除率，说明 DMV
较 CMV-D2 对热更敏感、更容易脱除。大丽花花
叶病毒(DMV)和黄瓜花病毒大丽菊株系(CMV-
D2)随着热处理时间的增加，脱除率显著增加，最
高分别为 74. 7%和 66. 9%，对 3 种病毒均脱除的
比率最高为 10. 6%。
2. 3 不同病毒唑浓度对大丽花试管苗生长情况
的影响
由图 3 可以看出，当浓度为 5 mg·L －1时，对
试管苗生长无明显影响(图 3-b);15 mg·L －1的病
毒唑对试管苗生长情况有轻微影响，茎尖生长较
慢(图 3-d);当病毒唑浓度达到 25 mg·L －1时，试
图 2 热处理时间对脱毒率的影响
Fig． 2 Effect of heat treatments time on the detoxification
rate
·326·杨 婷，等．不同处理方法对 3 种大丽花病毒的脱毒效果比较
a．对照;b． 5 mg·L －1病毒唑处理;c． 10 mg·L －1病毒唑处理;d． 15 mg·L －1病毒唑处理;e． 20 mg·L －1病毒唑处理;f． 25 mg·L －1病毒
唑处理。
图 3 病毒唑浓度对大丽花试管苗生长情况的影响
Fig． 3 Effect of ribavirin concentrations on the growth of dahlia test-tube seedlings
管苗生长受到了抑制，茎尖生长缓慢，甚至畸形
生长(图 3-f)。
2. 4 不同病毒唑浓度对 3 种病毒脱除效果的
影响
由图 4 可知，随着病毒唑浓度的增加，3 种病
毒的脱除率均呈增加趋势。25 mg·L －1病毒唑处
理试管苗，3 种病毒的脱除率最高，分别为
83. 1%，80. 5%和 77. 1%，且 DMV较其他 2 种病
图 4 病毒唑浓度对脱毒率的影响
Fig． 4 Effect of ribavirin concentrations on virus-free
rate
毒更容易脱除。3 种病毒均脱除的比率为
24. 3%。
2. 5 两种脱毒方法对试管苗脱毒效果比较
通过试验发现，热处理与化学药剂处理均能
脱除 DMV，CMV-D2 和 TMV。热处理对 TMV 脱
除效果不显著，最高仅为 32. 4%;相比较而言，茎
尖结合化学药剂处理能更有效地脱除 3 种病毒，
当病毒唑浓度为 25 mg·L －1时，3 种病毒脱除率
达到了 80%左右，因此，用 25 mg·L －1病毒唑处理
1 cm茎尖 40 d后切取 1 mm 茎尖培养，脱毒率最
高，DMV 脱除率可达 83. 1%，TMV 脱除率达到
80. 5%，CMV-D2脱除率达到 77. 1%。
3 讨论
单纯的茎尖培养脱毒法很难生产出完全的
脱病毒苗木，且操作困难［11］，一般要求剥取的茎
尖长度小于 1 mm［12］。满贵武等［8］通过大丽花茎
尖脱毒，其脱毒率最高仅为 53. 4%。本试验采用
茎尖结合热处理、茎尖结合化学处理方法，可以
显著提高大丽花的脱毒率，剥取的茎尖可达
1 mm，大大降低了操作难度。两种处理方法的脱
·426· 浙江农业学报 第 26 卷 第 3 期(2014 年 5 月)
除率已经可以达到脱毒苗生产要求。
茎尖结合热处理能有效脱除 DMV 和 CMV-
D2，但对 TMV的脱除效果不显著。明艳林
［13］对
大丽花病毒的鉴定结果表明，DMV 和 CMV-D2
均为球状病毒，TMV 为杆状病毒，而热处理对球
状病毒和线状病毒有效果，而对杆状病毒不起作
用或效果不明显［14］。这一结论与本研究结果
一致。
本研究表明，低浓度病毒唑(5 mg·L －1及
10 mg·L －1)对大丽花试管苗生长无明显的抑制
作用，但对 DMV，CMV-D2 和 TMV 脱除效果不理
想。高浓度(25 mg·L －1)病毒唑处理虽然可以有
效脱除 DMV，CMV-D2 和 TMV 三种病毒，但对材
料的生长有一定的抑制作用，导致大丽花试管苗
茎尖生长变缓，部分有畸形苗出现，本试验中，以
15 mg·L －1病毒唑处理为宜。这与许传俊等［15］关
于病毒唑对大花蕙兰病毒病脱除效果的研究结
果一致。
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(责任编辑 张 韵)
·526·杨 婷，等．不同处理方法对 3 种大丽花病毒的脱毒效果比较