全 文 ：[ 基金项目] 国家自然科学基金资助项目(编号:30973864)　[ 作者简介] 黄晓华 ,女 , 博士研究生 , 电话:15172528867 , E-mail:xiao.hua.77 @
163.com 　[ 通讯作者] 阮金兰 ,男 ,教授 ,电话:027-83692311 , E-mai l:jinlan8152@163.com
普通针毛蕨黄酮类成分原芹菜素的血浆蛋白结合率的测定
黄晓华 ,蔡亚玲 ,熊朝梅 ,汪建平 ,阮金兰　(华中科技大学同济药学院 ,湖北省天然药物化学与资源评价重点实验室 ,湖
北 武汉 430030)
[ 摘要] 　目的:建立检测原芹菜素(pro to apigenone)在人与鼠血浆药物浓度的高效液相色谱法(HPLC), 测定原芹菜素在人与
鼠血浆的蛋白结合率。方法:采用平衡透析法 , 结合 H PLC 测定原芹菜素在人与鼠血浆的蛋白结合率。结果:原芹菜素人血
药透析袋内外平衡时间约为 10 h , 在低 、中 、高(200 , 500 , 1 000 μg·L -1)质量浓度下 , 其血浆蛋白结合率为(90.5±1.2)%,
(89.6±1.7)%,(91.4±1.4)%;鼠血药透析袋内外平衡时间约为 6 h ,在低 、中 、高(200 , 500 , 1 000 μg·L-1)质量浓度下 ,鼠血
浆蛋白结合率为(80.7±2.2)%,(81.1±1.8)%,(81.9±1.3)%。结论:原芹菜素在人 、鼠血浆蛋白结合率之间差异有显著性
(P<0.01),但同一样品低 、中 、高浓度间 , 蛋白结合率差异无显著性(P>0.05)。原芹菜素与人 、鼠血浆蛋白具有较强的结合。
[ 关键词] 　原芹菜素;血浆蛋白结合率;高效液相色谱法;平衡透析法
[中图分类号] R963 , R927.2　　[ 文献标识码] A　　[ 文章编号] 1001-5213(2010)09-0725-04
Determination of plasma protein binding rate of protoapigenone formMacrothely pteris torresi-
ana
HUANG Xiao-hua , CAI , Ya-ling , XIONG Chao-mei , WANG Jian-ping , RUAN Jin-lan(Key Labo rator y of
Na tur al Medicinal Chemistry and Resources Evaluation of Hubei Pr ovince , Co lleg e of Pha rmacy , Tongji Medical Center of
Huanzhong University of Science and Techno log y , H ubei Wuhan 430030 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To develop a HPLC me thod fo r the determination of proto apigenone in human/ rat plasma and study
the plasma pro tein binding rate of pr otoapig enone.METHODS　The equilibrium dialy sis combined with HPLC w as ca rried out
for the de te rmination of the plasma concentration and plasma pro tein binding rate of pr otoapig enone.RESULTS　H uman plasma
protein binding rates of pro toapig enone at low , middle and high concentrations(200 , 500 , 1 000 μg·L-1)w ere(90.5±1.2)%,
(89.6±1.7)% and(91.4±1.4)%, re spectively.Acco rding ly , ra t plasma protein binding ra tes of pr otoapig enone at low , mid-
dle and high concentra tions were(80.7±2.2)%, (81.1±1.8)% and(81.9±1.3)%, respec tively.CONCLUSION　The high
binding pow er o f pro to apigenone to human/ ra t plasma protein was confirmed by the proposed method of equilibrium dialy sis
combined with HPLC.Human or ra t plasma pro tein binding r ates of proto apigenone at low , medium and high concentra tions
show ed no significant difference(P>0.05).H ow ever , the plasma protein binding rates of pro toapig enone towa rds the human
plasma and rat pla sma w ere significantly diffe rent(P<0.01).
KEY WORDS:pro to apigenone;pla sma pro tein binding rate;high pe rformance liquid ch romato gr aphy;equilibrium dialy sis
　　普通针毛蕨 [ Macrothelypteris torresiana
(Gaud.)Ching]为金星蕨科针毛蕨属植物 ,其中含
有的主要黄酮类成分原芹菜素(protoapig enone)具
有抗肿瘤活性[ 1-2] 。本实验室通过体外四甲基偶氮
唑盐(MT T)法和体内抗肿瘤实验也初步证实了这
一点 ,此药对抗肿瘤具有较好的开发前景。目前 ,关
于该化合物的血浆蛋白结合率尚未见文献报道 , 故
本实验室建立了原芹菜素在人 、鼠血浆和透析液中
的含量测定方法[ 4-6] ,结合平衡透析方法考察其蛋白
结合率 ,为试验与临床上原芹菜素的血药浓度监测
和应用提供方法和依据。
1　材料
LC-9A 高效液相色谱仪(日本 Shimadze 公
司);SPD-10AVP 紫外检测器(Shimadzu 公司);
管状透析袋(直径 34 mm ,截留量12 000 ～ 14 000相
对分子质量 , 上海绿鸟科技发展有限公司 , 批号
041225);原芹菜素(pro to apigenone)由本实验室从
普通针毛蕨[ Macrothelypteris torresiana(Gaud.)
Ching]的干燥根茎提取纯化而得 , HPLC 测定其纯
度>97%;甲醇 、乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析
纯;正常人血浆(武汉市红十字会血液中心 , 批号
20050410);鼠血浆由本实验室自行提取(摘取小鼠
眼球采血于肝素管内 , 4 000 r·min-1 ,离心 10 min ,
取血浆 ,于-20 ℃保存 ,备用);昆明种♀♂小鼠 ,
体质量 180 ～ 250 g(华中科技大学同济医学院实验
动物学中心 ,合格证号:00001554)。
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2　方法
2.1　试液的配制
2.1.1　缓冲液(空白透析液)　精密称取磷酸氢二
钾14 .11 g 、磷酸二氢钾2.59 g 、氯化钠1.99 g ,加入
1 000 mL 纯净水 ,制成 pH 7.4的缓冲液 ,备用 。
2.1.2　储备药液　精密称取原芹菜素 4 mg ,置入
100 mL 量瓶中 ,加入甲醇至刻度 ,摇匀 ,制成质量浓
度为 40 mg·L-1的储备液。用甲醇稀释成0 .5 ,1 ,2 ,
4 ,10 ,20 mg·L-1制成标准系列溶液 ,备用 。用空白
透析液将储备液稀释成质量浓度为 1 ,5 ,10 mg·L-1
的原芹菜素标准液 ,备用 。
2.2　高效液相色谱条件及样品的预处理
2.2.1　色谱条件　Eurospher C18色谱柱(250 mm
×4.6 mm ,5 μm);流动相:甲醇-乙腈-0 .2%磷酸(1
∶2∶7);流速:1.0 mL·min-1 ;柱温:30 ℃(柱温箱控
制);检测波长:248 nm;进样量:20 μL 。
2.2.2　透析液样品的预处理方法　取透析内液(含
药人 、鼠血浆)或透析外液(含药缓冲液)100 μL ,加
50%磷酸 200 μL 和醋酸乙酯 400 μL ,涡旋 1 min ,
静置 1 min ,取上层清液 200 μL ;重复 3 次。共取
600 μL 上清液于 EP 管内 。在65 ℃水浴恒温蒸干 ,
加 100 μL 乙腈 ,涡旋 1 min 使其溶解 ,并以12 000
r·min-1离心 10 min ,取上清液 50 ,20 μL 进样。
2.2.3　专属性试验　按“2.2 .1”项色谱条件 ,测得
原芹菜素在人 、鼠血药 、含药缓冲的保留时间均为
16.45 min ,理论塔板数在3 000以上 ,分离度在2 .2
以上 ,内源性物质对其检测无干扰。最低检测限为
250 μg·L-1 。结果见图 1 。
2.3　稳定性考察　分别取空白人 、鼠血浆0.9 mL
加入0.1 mL 原芹菜素标准系列溶液 ,配制成人 、鼠
血浆浓度均为 100 , 400 , 1 000 μg·L-1系列模拟血
浆样品;取空白缓冲液0.95 mL ,加入 50 μL 原芹菜
素标准系列溶液配制成质量浓度为 50 , 200 , 500 μg
· L-1系列模拟透析样品;按“2.2.2”项透析液样品
的预处理方法操作 ,考察上述样品在-20 ℃冻藏 1
周和预处理后室温下放置 48 h的稳定性 。结果表
明 ,各样品在上述条件下稳定性良好(RSD <5%)。
2.4　准确度与精密度考察
2.4.1　透析内液　按“2 .3”项的方法 ,将人 、鼠血浆
分别配成低 、中 、高(100 , 400 , 1 000 μg· L-1)3个质
量浓度 ,每个浓度 5个样本 ,按“2.2 .2”透析液样品
的预处理方法 ,连续测定 3 d准确度与精密度。
2.4.2　透析外液　按“ 2.2”的方法 ,将空白透析液
配成低 、中 、高(50 , 200 , 500 μg· L-1)3 个质量浓
度 ,每个质量浓度 5个样本 ,按“2.1 .2”透析液样品
的预处理方法 ,连续测定 3 d准确度与精密度 。
图 1　高效液相色谱图
A.人空白血浆样品;B.人透析内液样品;C.鼠空白血浆样品;D.
鼠透析内液样品;E.空白缓冲液;F.透析外液
Fig 1　HPLC chromatogram s
A.hum an blank plasm a;B.H uman dialysi s inside f luid sample;C.rat
blank plasma sam ple;D.rat dialysi s inside f luid sample;E.Blank
buf fer fluid;F.dialy si s outside f luid
2.4.3　透析内 、外液的日内 、日间准确度与精密度
　结果见表 1。
表 1　透析内 、外液的准确度与精密度(n=5)
Tab 1 　Accuracy and precision of determina tion of pr o-
toapig enone in dialy sis inside and outside fluid(n=5)
分类 剂量/μg·L -1
准确度
RE/ %
精密度 RSD/ %
日内 日间
100 3.36 5.23 7.31
人血浆 400 5.72 2.46 3.64
透析内液 800 4.49 2.62 3.46100 4.23 5.31 8.53
鼠血浆 400 7.19 1.91 3.42
800 2.65 2.27 3.82
50 4.68 2.31 8.15
透析外液 缓冲液 200 2.52 2.34 4.93
400 2.59 3.27 3.83
2.5　提取回收率的检测
2.5.1　透析内液提取回收率检测　按“2.2”的方
法 ,将人 、鼠血浆均配成低 、中 、高(100 , 400 , 1 000
μg· L-1)3个质量浓度 ,每个质量浓度 5 个样本。
按“2.2.2”透析液样品预处理方法检测 ,以测得峰面
积和同一浓度(标准系列溶液甲醇稀释而得)直接进
样的峰面积之比 ,考察样品的绝对回收率。
2.5.2　透析外液提取回收率检测　按“2.3”的方
法 ,将空白缓冲液配成为 50 ,200 ,500 μg·L-1 3个质
量浓度 ,每个质量浓度 5 个样本 ,按“2.5.1”方法考
察样品的绝对回收率。
·726· 中国医院药学杂志 2010年第 30卷第 9期 Chin H osp Pharm J , 2010 May , Vol 30 , No.09
2.5.3　提取回收率测定结果　见表 2。
表 2　透析内 、外液中原芹菜素的提取回收率(n=5)
Tab 2 　Recovery o f pr otoapig enone in dialysis inside and
outside fluid(n=5)
分类 原芹菜素/μg·L -1 回收率/ %
100 80.9±7.3
人血浆 400 85.4±8.1
透析内液 800 89.2±4.6100 81.3±8.5
鼠血浆 400 83.5±2.3
800 85.4±4.7
50 85.1±2.9
透析外液 缓冲液 200 88.9±2.6
400 90.1±5.3
2.6　标准曲线和定量下限
2.6.1　透析内液-人血浆标准曲线和定量下限　按
“2.3”项方法 ,将人血浆制成浓度为 50 , 100 , 200 ,
400 , 1 000 , 2 000 μg·L -1系列模拟血浆样品。按
“2.2 .2”透析液样品的预处理方法操作 ,连续 3 d ,每
天做 2条标准曲线 ,记录色谱图和峰面积 ,以血浆中
原芹菜素浓度作横坐标 ,以峰面积作纵坐标 ,求曲线
的回归方程。
2.6.2　透析内液-鼠血浆标准曲线和定量下限　按
“2.3”项方法 ,制成鼠血浆浓度为 50 , 100 , 200 ,400 ,
1 000 ,2 000 μg· L -1系列模拟血浆样品。其余按
“2.5 .1”项方法进行操作 。
2.6.3　透析外液-缓冲液标准曲线定量下限　按
“2.3”项方法 ,将空白缓冲液制成 25 , 50 ,100 , 200 ,
500 , 1 000 μg· L-1系列原芹菜素溶液 。其余按
“2.6 .1”项方法进行操作 。
2.6.4　标准曲线和定量下限　以原芹菜素的浓度
作横坐标 ,以峰面积作纵坐标 ,求得曲线的回归方程
为透析外液Y =93 .834X +349.46 , r =0.999 7(n =
6),原芹菜素在 25 ～ 1 000 μg· L-1之间线性关系良
好 ,方法的定量下限为 25 μg· L-1 ;透析内液人血
药)Y =44.003X -263.84 , r =0 .999 2(n =6),鼠血
药Y =53 .123X -602.61 , r=0.999 9(n=6),原芹
菜素在两者均于 50 ～ 2 000 μg· L -1之间线性关系
良好 ,方法的定量下限为 50 μg· L-1 。
2.7　平衡时间的观察　取空白透析液0.9 mL 加
0.1 mL 原芹菜素标准液稀释成为低 、中 、高 3 个质
量浓度(100 ,500 ,1 000 μg· L -1)的透析外液 ,每个
质量浓度按时间点各设 5个平行样本。将浸泡过的
透析袋 10 mL(长约 10 cm),一段折叠扎紧 ,加入 2
mL 空白人 、鼠血浆 ,留少许空气 ,把开口折叠扎紧 ,
置于装有 20 mL 前述各浓度透析外液的广口瓶中 ,
在37 ℃恒温震荡箱内震荡(80 r·min-1),分别于 1 ,
2 ,4 ,6 ,8 ,10 h按“2.1 .2”项透析液样品的预处理方
法 ,检测透析袋内浓度与透析袋外浓度 ,以两者浓度
比与时间的关系分析达到平衡时间。结果是空白缓
冲液袋内外的平衡时间约为 4 h 。
2.8　透析袋吸附率　将 2 mL(V1)空白缓冲液装
入透析袋内 ,放入 20 mL(V 2)浓度为 200 μg· L-1
(CA)透析外液中 , 在恒温振荡箱中 37 ℃、80 r·
min-1震荡条件下 ,于 4 , 8 , 12 h 每个时间点取 5个
平行样品 ,按“2.2 .2”透析液样品的预处理方法 ,检
测透析外液的药物浓度(CE),透析膜对药物的吸附
率(X)用以下方法计算:X =[ CA ×V2 -CE(V 1 +
V2)] /CA ×V2 。结果显示 ,透析袋对药物的吸附很
微弱 ,低 、中 、高(100 , 500 , 1 000 μg· L-1)3个质量
浓度的吸附率分别为3.47%, 1.16 %, 2.84%,对蛋
白结合率的检测结果没有明显的影响 。
2.9　蛋白结合率的检测　取标准液 1 , 5 , 10 mg·
L -1以空白缓冲液稀释成低 、中 、高(100 ,500 , 1 000
μg·L-1)3个质量浓度。依据“2.6”项测定的平衡时
间设 5个时间点 ,每个时间点设 3个质量浓度(100 ,
500 ,1 000 μg·L-1)、5个平行样品观测人 、鼠血浆
的蛋白结合率 。按“2.2 .2”透析液样品的预处理方
法 ,检测透析袋内血浆药物浓度(总浓度 D t)和透析
袋外的药物浓度(游离药物浓度 D f),根据下列公式
计算蛋白结合率:血浆蛋白结合率 =[ 1 -(袋外浓
度/袋内浓度)] ×100 %)。结果运用 SPSS 软件进
行分析。结果见表 3 ,表 4 ,显示人血药平衡时间约
为 10 h ,鼠血药平衡时间约 6 h 。人血浆平均蛋白
结合率为(90 .5±1.9)%,鼠血浆平均蛋白结合率为
(81 .9±1.7)%。 t检验结果表明 ,正常人和正常鼠
血药浓度不同时 ,原芹菜素血浆蛋白结合率差异无
显著性(P >0.05)。但人 、鼠血浆蛋白结合率差异
有极显著(P<0.01)[ 7] 。
表 3　原芹菜素在正常人血浆的蛋白结合率测定结果(n=5)
Tab 3　Results of de temination no rmal human plasma pro-
tein binding rate of pro toapig enone(n=5)
原芹菜素
/μg·L -1
蛋白结合率/ %
4 h 8 h 10 h 12 h 14 h
100 75.1±1.8 90.7±1.3 90.5±2.2 90.3±2.3 91.8±3.4
500 78.2±3.1 88.3±2.7 89.6±2.3 92.2±2.1 91.3±2.6
1 000 83.2±2.1 87.4±2.6 91.4±1.8 92.8±1.3 92.5±2.2
表 4　原芹菜素在正常鼠血浆的蛋白结合率测定结果(n=
5)
Tab 4 　Results o f determination o f norma l human plasma
pro tein binding rate of pro toapig enone(n=5)
原芹菜素
/μg·L -1
蛋白结合率/ %
2 h 4 h 6 h 8 h 10 h
100 72.4±1.9 74.5±1.3 80.7±2.3 81.7±1.9 82.2±2.2
500 74.4±1.8 79.8±2.4 81.1±2.2 82.2±2.6 82.9±2.1
1 000 73.7±2.0 75.7±1.9 81.9±1.3 82.3±2.2 83.2±2.3
·727·中国医院药学杂志 2010年第 30卷第 9期 Chin H osp Pharm J , 2010 May , Vol 30 , No.09
3　讨论
研究药物血浆蛋白结合率的常规方法是平衡透
析法 、超滤法 、超速离心法 、凝胶过滤法等。近年来 ,
随着药动学及临床药理学的飞速发展 ,也产生了微
透析法 、高效亲和色谱法(HPAC)、高效前沿分析
(HPFA)[ 8-9] 等新的测定方法。平衡透析法基于药
物与血浆蛋白结合的平衡原理 ,具有操作简单 、经济
实用 、干扰因素小等优点 ,是研究药物血浆蛋白结合
率的经典方法。
在实验中必须严格控制血浆和缓冲液的 pH 值
以及离子强度;要考虑到稀释作用 、Gibbs-Donn 舳
效应以及体积迁移效应对蛋白结合率的影响以及非
特异性的透析设备表面的药物吸附效应 。
在本实验中要严格防止透析袋贴壁 、广口瓶封
闭不严 、透析袋内外液水平不一致 、恒温箱的温度 、
震荡次数不恒定 、透析袋蛋白外泄等情况的发生 ,一
旦发生 ,作废处理。
当药物与血浆蛋白结合率在 80%以上时 ,可延
缓进入细胞外液 ,影响药物的体内分布;但有利于药
物转运到全身各组织器官而发挥作用 ,并延缓药物
经肾的排泄;由于原芹菜素人 、鼠血浆蛋白结合率
均较高 ,若是强而可逆的结合 ,会使药物的作用时间
延长 ,导致半衰期较长。
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[收稿日期] 2009-09-15
[ 基金项目] 广东省高等学校中药有效性与安全性重点实验室开放基金(编号:kf07007)　[ 作者简介] 和凡 , 男, 博士 , 主管药师 ,电话:020-
81330652 , E-mail:hefan yh@tom.com 　[ 通讯作者] 黄民 ,男 ,教授 ,电话:020-87334521 , E-mai l:huangmin@m ail.sysu.edu.cn
槲皮素 、山奈酚 、芦丁对大鼠肝微粒体细胞色素 P450酶的诱导作用
和凡1 ,钟国平2 ,赵立子2 ,毕惠嫦2 ,黄民2 　(1.广州市妇女儿童医疗中心 , 广东 广州 510120;2.中山大学药学院 , 广东
广州 510080)
[ 摘要] 　目的:研究槲皮素 、山奈酚 、芦丁对大鼠细胞色素 P450 酶 6 种亚型的诱导作用。 方法:槲皮素组 10 , 50 , 250 mg·
kg -1 ;山奈酚组 10 , 50 , 250 mg·kg-1 ;芦丁组 90 mg·kg-1 , 雄性 SD大鼠连续灌胃 10 d , 取肝脏组织 ,应用液质联用 , 反转录-聚
合酶链反应 ,免疫印迹杂交方法分别检测 CYP450 酶活性 , 基因表达和蛋白表达的变化。结果:槲皮素 10 , 50 , 250 mg·kg-1组
对 CYP1A2 蛋白表达的诱导作用呈剂量依赖型 ,分别提高了31.1%, 82.4%, 119.3%;250 mg·kg-1组使 CYP1A2的基因表达
提高了86.3%, CYP1A2 的活性增加了44.2%, CYP2E1 蛋白表达提高了54.3%, CYP2E1 的活性提高 36.7%。 山奈酚 50 , 250
mg·kg -1组诱导 CYP1A2 的基因和蛋白表达 , 分别提高了36.2%, 86.8%, 110.5%, 204.1%;3 个剂量组使 CYP1A2 的活性分
别提高18.3%, 30.1%, 53.9%。芦丁 90 mg·kg -1组能诱导 CYP1A2 的活性和基因 、蛋白表达 , 分别提高了62.1%, 90.7%,
176.2%;也使 C YP2C11 的活性增加30.6%。结论:槲皮素 、山奈酚 、芦丁对大鼠多种 CYP450 亚型有诱导作用 ,提示有发生药
物相互作用的可能性。
[ 关键词] 　槲皮素;山奈酚;芦丁;细胞色素 P450 酶
[中图分类号] R285.6　　[ 文献标识码] A　　[文章编号] 1001-5213(2010)09-0728-04
Inductive effect of quercetin , kaempferol and rutin on liver microsomal cytochrome P450 en-
zymes in rats
·728· 中国医院药学杂志 2010年第 30卷第 9期 Chin H osp Pharm J , 2010 May , Vol 30 , No.09