全 文 ：China Pharmacy 2011 Vol. 22 No. 31 中国药房 2011年第22卷第31期
治疗的模型兔血清及软骨 NO含量显著低于模型组（P＜
0.05）；血液流变检查各项指标也显著低于模型组（P＜0.05）。
表明骨舒汤具有较好的镇痛、抗炎、消肿作用，在细胞因子的
参与刺激下产生大量NO，调节血液功能，维持软骨的形态和
功能的完整性。
综上，NO含量升高成为关节软骨退变和滑膜炎症的重要
病因之一，骨舒汤能够有效降低骨质疏松模型兔血清、关节软
骨中NO水平，同时可以引起血液流变学指标的下降，调节血
液功能，从而对关节软骨起到保护作用。
参考文献
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（收稿日期：2011-01-07 修回日期：2011-04-09）
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HPLC法测定蝙蝠葛碱与大鼠和人血浆蛋白的结合率
高秀蓉 1，2＊，蒋学华 1#，王 婷 1（1.四川大学华西药学院临床药学与药事管理学系，成都市 610041；2.成都医学
院药学院药剂教研室，成都市 610083）
中图分类号 R285；R969.1 文献标识码 A 文章编号 1001-0408（2011）31-2894-04
摘 要 目的：建立测定蝙蝠葛碱的高效液相色谱（HPLC）法，并研究蝙蝠葛碱与大鼠和人血浆蛋白的结合率。方法：采用平衡透
析法，HPLC法测定蝙蝠葛碱的浓度，计算蝙蝠葛碱大鼠及人血浆蛋白结合率。结果：透析外液中的蝙蝠葛碱检测浓度在0.24～
15.10 μg·mL-1范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系；大鼠血浆中的蝙蝠葛碱检测浓度在0.24～15.10 μg·mL-1范围内与其峰
面积积分值呈良好线性关系；人血浆中的蝙蝠葛碱检测浓度在0.24～15.10 μg·mL-1范围内与其峰面积积分值呈良好线性关系。
蝙蝠葛碱在高、中、低浓度下，其大鼠血浆蛋白结合率分别为（69.63±1.30）％、（68.64±1.10）％、（72.54±0.50）％，人血浆蛋白结合
率分别为（82.1±1.00）％、（84.96±0.70）％、（78.79±0.60）％。结论：HPLC法用于蝙蝠葛碱生物样品测定具有简便、灵敏与选择
性高的特点；蝙蝠葛碱具有较强的血浆蛋白结合率，且大鼠和人血浆蛋白结合率具有种属差异性，人血浆蛋白结合率高于大鼠血
浆蛋白结合率（P＜0.05）。
关键词 高效液相色谱法；蝙蝠葛碱；血浆蛋白结合率
Determination of Rat and Human Plasma Protein Binding Rate of Dauricine by HPLC
GAO Xiu-rong，JIANG Xue-hua，WANG Ting（Dept. of Clinical Pharmacy and Pharmacy Administration，West
China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China）
GAO Xiu-rong（Dept. of Pharmacy，Chengdu Medical College，Chengdu 610083，China）
ABSTRACT OBJECTIVE：To establish the HPLC method for the determination of dauricine，and to study the plasma protein
binding rate of it. METHODS：The equilibrium dialysis and HPLC were used to determine the concentration of dauricine，and rat
and human plasma protein binding rate of dauricine was calculated. RESULTS：The linear range of dauricine in extracellular fluid
microdialysis was 0.24～15.10 μg·mL-1；in rat plasma was 0.24～15.10 μg·mL-1；in human plasma was 0.24～15.10 μg·mL-1；At
high，middle and low concentrations，the rat plasma protein binding rates of dauricine were（69.63±1.30）％，（68.64±1.10）％，
（72.54± 0.50）％，respectively. The human plasma protein binding rates of dauricine were（82.1± 1.00）％，（84.96± 0.70）％，
（78.79±0.60）％，respectively. CONCLUSIONS：HPLC method is simple，sensitive and selective for the determination of biologi-
cal sample of dauricine. The plasma protein binding rate of dauricine is of a little high，and the human protein binding rate is high-
er than that of rat，there is difference among species（P＜0.05）.
KEY WORDS HPLC；Dauricine；Plasma protein binding rate
＊讲师，博士研究生。研究方向：药物新剂型设计与药动学。
E-mail：gaomuxouzi@126.com
#通讯作者：教授，博士研究生导师。研究方向：药物新剂型设计、
药动学与药事管理学。E-mail：jxh1013@163. com
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中国药房 2011年第22卷第31期 China Pharmacy 2011 Vol. 22 No. 31
北豆根为防己科蝙蝠葛属多年生藤本植物蝙蝠葛Menis-
permum dauricum DC的干燥根茎，1977年版《中国药典》始见
北豆根，具有抗炎、抗菌、抗癌、清热解毒、消肿利咽和止痛的
功效，以及心血管系统作用，目前临床用于治疗扁桃体炎、咽
喉肿痛、牙龈肿痛等[1]。北豆根主要成分为生物碱，现已知北
豆根中含有近20种生物碱，总碱含量为1％以上，其中含量最
高的为蝙蝠葛碱（Dauricine）[2，3]。蝙蝠葛碱是一种广谱的抗心
律失常药，适用于快速型心律失常，尤其对房性、交界性和室
性早搏效果较佳；对预激综合征伴室性心动过速效果也好[4，5]。
血浆蛋白结合率是药物重要的药动学参数，药物与血浆
蛋白结合后将不能被机体处置（如分布、代谢和排泄），仅游离
药物能发生这些药动学过程和发挥药理作用，所以血浆蛋白
结合率的高低将直接影响药物在血中游离药物的浓度，从而
影响药物药理作用的发挥和毒性作用[6]。蝙蝠葛碱属于双苄
基异喹啉类生物碱，属于毒性药物，治疗窗较窄，本课题组对
蝙蝠葛碱在大鼠体内药动学过程进行了研究，发现其口服生
物利用度低（约 15％），生物半衰期较长（大鼠血浆中约 5～7
h），对其血浆蛋白结合率进行测定将有助于解释这些体内药
动学参数和体内过程。而目前尚未见文献对蝙蝠葛碱血浆蛋
白结合率进行测定，故笔者采用高效液相色谱（HPLC）法对蝙
蝠葛碱的人和大鼠血浆蛋白结合率进行了测定，以期为临床
合理设计蝙蝠葛碱给药方案提供依据，也为蝙蝠葛碱制剂的
研发提供参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器
LC-2010C HT型高效液相色谱仪（日本 Shimdazu公司）；
BP210S型、CP235D型电子天平（德国 Sartorius公司）；Votex
Genius 3型旋涡混合仪（德国 IKA公司）；HGC-36AC型氮吹仪
（上海泉岛科贸有限公司）；CQ-205型超声清洗仪（上海超声波
仪器厂）；TDL-5型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；超纯水
机（成都品成科技有限公司）；透析袋（上海欧韦达仪器科技有
限公司，截留分子量8 000～15 000 Da）。
1.2 试药
蝙蝠葛碱原料药（纯度：＞98.0％）、蝙蝠葛碱标准品（纯
度：＞99.0％）均由深圳市维琪生物科技有限公司提供；粉防己
碱（内标，中国药品生物制品检定所，纯度：＞99.5％）；HPLC所
用试剂为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。
1.3 动物
SD大鼠10只，♂，体重220～250 g，由四川大学实验动物
中心提供（动物生产许可证号：SCXK（川）2005-02）；大鼠腹主
动脉取血，肝素抗凝，离心，分离血浆，－20℃贮藏，备用。人
血浆由成都市血液中心提供。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 空白透析液的制备 称取磷酸二氢钠 1.563 g，氯化钠
4.437 g，加超纯水溶解，用 1 mol·L-1的氢氧化钠调节 pH值至
7.4，定溶至 500 mL，0.45 μm的微孔滤膜过滤后，即得 0.02
mol·L-1、pH7.4的磷酸二氢钠缓冲液（含0.15 mol·L-1氯化钠）。
2.1.2 标准曲线工作溶液的制备 称取干燥至恒重的蝙蝠葛
碱标准品，用甲醇溶解制备成浓度为302.00 µg·mL-1的蝙蝠葛
碱贮备液，吸取该贮备液 2 mL，甲醇定容于 10 mL容量瓶中，
得浓度为 60.40 µg·mL-1的工作溶液①，精密吸取工作溶液①
5 mL，置 10 mL量瓶中，以甲醇定容，得浓度为 30.20 µg·mL-1
的工作液②；依次往下稀释，分别得浓度为 15.10、7.55、3.78、
1.89和0.94 µg·mL-1的系列工作液，4℃贮藏，备用。
2.1.3 内标液的制备 称取粉防己碱 1.44 mg，用甲醇溶解并
定容至50 mL，得28.8 μg·mL-1的内标贮备液。
2.2 色谱条件
色谱柱：Sepax C18（250 mm×5.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-
水（78∶22，含 1％三乙胺和 0.21％磷酸）；流速：1.0 mL·min-1；
检测波长：284 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。
2.3 样品处理
2.3.1 透析内液样品的处理 精密吸取透析袋内液100 μL，加入
25 μL内标液，涡旋混匀后加入500 μL乙酸乙酯、100 μL 2 mol·
L-1的氢氧化钠溶液碱化，强力混旋 5 min，13 000 r·min-1离心
5 min，取上清液用N2吹干，用100 μL流动相复溶，混旋，13 000 r·
min-1离心5 min，取上清液于“2.2”项下色谱条件测定。
2.3.2 透析外液样品的处理 取透析袋外液100 μL，13 000 r·
min-1离心5 min，取上清液于“2.2”项下色谱条件测定。
2.4 方法学验证
2.4.1 方法专属性考察 分别取空白血浆、空白透析液及含
蝙蝠葛碱的血浆样品或透析液样品，按照“2.3”项下方法处理
样品，在“2.2”项下色谱条件测定，可见空白血浆、空白透析液
在此条件下对蝙蝠葛碱的测定无干扰。蝙蝠葛碱HPLC见
图 1。
2.4.2 标准曲线的制备 （1）透析外液：取标准曲线工作溶液
各 25 µL，加入 75 µL空白透析液，涡旋混匀，得蝙蝠葛碱溶液
浓度分别为 15.10、7.55、3.78、1.89、0.94、0.47、0.24 µg·mL-1的
透析外液标准溶液。按“2.3”项下方法进行样品处理和“2.2”项
下色谱条件测定。以蝙蝠葛碱的峰面积积分值（Y）为纵坐标，蝙
蝠葛碱浓度（X）为横坐标，进行线性回归，得蝙蝠葛碱回归方程为
Y＝34 026.70X+2 801.21（r＝0.999 6）。结果表明，透析外液中
的蝙蝠葛碱检测浓度在 0.24～15.10 μg·mL-1范围内与其峰面
积积分值线性关系良好。（2）透析内液（大鼠血浆）：取标准曲
线工作溶液各 25 µL，分别加入 75 µL空白大鼠血浆，涡旋混
匀，得蝙蝠葛碱溶液浓度分别为 15.10、7.55、3.78、1.89、0.94、
0.47、0.24 µg·mL-1的含药血浆，然后分别加入 25 µL内标液。
按“2.3”项下方法处理样品和“2.2”项下色谱条件进行测定。
以蝙蝠葛碱标准品和粉防己碱内标液的峰面积之比（Y）为纵
坐标，血浆中的蝙蝠葛碱浓度（X）为横坐标，进行线性回归，得
回归方程为Y＝0.155 8X+0.005 7（r＝0.998 8）。结果表明，大
鼠血浆中蝙蝠葛碱检测浓度在 0.24～15.10 μg·mL-1范围内与
蝙蝠葛碱标准品和粉防己碱内标液的峰面积之比线性关系良
好。（3）透析内液（人血浆）：取标准曲线工作溶液各 25 µL，加
入 75 µL空白人血浆，涡旋混匀，得蝙蝠葛碱浓度分别为
15.10、7.55、3.78、1.89、0.94、0.47、0.24 µg·mL-1的含药血浆，然
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后分别加入25 µL内标液。按“2.3”项下方法处理样品和“2.2”
项下色谱条件测定。以蝙蝠葛碱标准品和粉防己碱内标液的峰
面积之比（Y）为纵坐标，血浆中的蝙蝠葛碱浓度（X）为横坐标，进
行线性回归，得回归方程为Y＝0.172 3X+0.004 0（r＝0.998 9）。
结果表明，人血浆中蝙蝠葛碱检测浓度在 0.24～15.1 μg·mL-1
范围内与蝙蝠葛碱标准品和粉防己碱内标液的峰面积之比线
性关系良好。
2.4.3 血浆样品提取回收率考察 精密吸取大鼠血浆（或人
血浆）75 μL，加入25 μL标准曲线工作溶液，配制蝙蝠葛碱高、
中、低浓度（7.55、1.89、0.47 µg·mL-1）样品，以提取后的蝙蝠葛
碱峰面积与未经提取直接进样所获得色谱峰面积之比，考察样
品的绝对提取回收率，每个浓度平行测定 5份。结果表明，蝙
蝠葛碱在大鼠和人血浆中提取回收率较高，基本达到 80％以
上。蝙蝠葛碱和内标在大鼠和人血浆中的萃取回收率见表 1
（表中 IS为内标）。
2.4.4 精密度和方法回收率考察 （1）透析外液精密度考察：
按“2.4.2”项下方法操作，测定蝙蝠葛碱高、中、低（7.55、1.89、
0.47 µg·mL-1）浓度样品，测定日内精密度和一周内3 d的日间
精密度，每个浓度平行 5份，结果见表 2。（2）大鼠血浆精密度
考察：按“2.4.2”项下方法测定蝙蝠葛碱高、中、低（7.55、1.89、
0.47 µg·mL-1）浓度样品，测定日内精密度和一周内3 d的日间
精密度，每个浓度平行 5份，结果见表 2。（3）人血浆精密度考
察：按“2.4.2”项下方法测定蝙蝠葛碱高、中、低浓度（7.55、
1.89、0.47 µg·mL-1）样品，测定日内精密度和一周内3 d的日间
精密度，每个浓度平行5份，结果见表2。
表2 精密度试验结果
Tab 2 Results of precision tests
加入浓度/mL-1
透析外液中7.55
透析外液中1.89
透析外液中0.47
鼠血浆中7.55
鼠血浆中1.89
鼠血浆中0.47
人血浆中7.55
人血浆中1.89
人血浆中0.47
日间RSD
检测浓度
/g·mL-1
7.271±0.008
1.864±0.015
0.485±0.009
6.516±0.056
1.845±0.089
0.504±0.032
6.818±0.065
1.86±0.079
0.513±0.031
方法回收率
/％
96.3
98.6
103.2
86.3
97.6
107.2
90.3
98.4
109.2
RSD
/％
0.11
0.80
1.86
0.86
4.82
6.35
0.95
4.25
6.04
日内RSD
检测浓度
/g·mL-1
7.429±0.014
1.933±0.025
0.495±0.011
6.697±0.042
1.824±0.090
0.501±0.035
6.893±0.012
1.848±0.100
0.505±0.037
方法回收率
/％
98.4
102.3
105.4
88.7
96.5
106.5
91.3
97.8
107.5
RSD
/％
0.19
1.29
2.22
0.63
4.93
6.99
0.17
5.41
7.32
2.4.5 蝙蝠葛碱稳定性考察 （1）蝙蝠葛碱在透析外液和透
析内液中稳定性考察：按“2.4.2”项下方法配制蝙蝠葛碱高、低
（7.55、0.47 µg·mL-1）浓度样品，于 4℃放置，分别于 0、12、24、
36 h取样进行测定。结果，RSD＝2.63％，表明4℃条件下蝙蝠
葛碱在透析外液中放置36 h稳定。（2）蝙蝠葛碱在大鼠血浆中
的稳定性考察：按“2.4.2”项下方法，配制蝙蝠葛碱高、低（7.55、
0.47 µg·mL-1）浓度样品，于 4℃放置，分别于 0、12、24、36 h取
样进行测定。结果，RSD＝3.13％，表明 4℃条件下蝙蝠葛碱
在大鼠血浆中放置36 h稳定。（3）蝙蝠葛碱在人血浆中的稳定
性考察：按“2.4.2”项下方法，配制蝙蝠葛碱高、低（7.55、0.47
µg·mL-1）浓度样品，于4℃放置，分别于0、12、24、36 h取样进
行测定。结果，RSD＝4.25％，表明 4℃条件下蝙蝠葛碱在人
血浆中放置36 h稳定。
2.5 透析膜物理吸附的考察
2.5.1 蝙蝠葛碱供试液的制备 称取蝙蝠葛碱 2.59 mg，用稀
盐酸溶解后用1 mol·L-1氢氧化钠调节pH值至6～7，用PBS定
容至250 mL，得10.36 μg·mL-1高浓度供试液；取高浓度供试液
50 mL，用 PBS定容至 100 mL，得 5.18 μg·mL-1的中浓度供试
液；取高浓度供试液10 mL，用PBS定容至100 mL，得1.04 μg·
mL-1低浓度供试液。
2.5.2 考察透析膜对药物的物理吸附作用 先将透析袋预处
理后在空白透析液中室温浸泡24 h。取一端扎紧的透析袋，除
去袋内外水分，透析袋内加入2 mL（V1）空白透析液，将其放人
盛有 20 mL（V2）含药（药物浓度为 c1）透析液的广口瓶中，4℃
10
5
0
mV
0 5 10 min
A
0 5 10 min
B
10
5
0
mV
1
1
10
5
0
mV
0 5 10 min
C
0 5 10 15 min
F
1
10
5
0
mV
1
2
2
1
10
5
0
mV
0 5 10 15 min
E
10
5
0
mV
0 5 10 15 min
D
10
5
0
mV
0 5 10 15 min
G
10
5
0
0 5 10 15 min
H
mV
0 5 10 15 min
I
10
5
0
mV
1
2
图1 蝙蝠葛碱的HPLC图
A.空白透析外液；B.空白透析外液+蝙蝠葛碱；C.透析外液样品；D.空
白大鼠血浆；E.空白大鼠血浆+蝙蝠葛碱+内标；F.大鼠血浆样品（袋
内）；G.空白人血浆；H.空白人血浆+蝙蝠葛碱+内标； I.人血浆样品
（袋内）；1：蝙蝠葛碱；2：粉防己碱（内标）
Fig 1 HPLC chromatograms of dauricine
A. blank extracellular fluid microdialysis；B. blank extracellular fluid
microdialysis+dauricine；C. extracellular fluid microdialysis sample；D.
blank rat plasma；E. blank rat plasma + dauricine + IS；F. rat plasma
sample（inner bag）；G. blank human plasma；H. blank human plasma+
dauricine + IS；I. human plasma sample（inner bag）；1. dauricine；2.
tetrandrine（IS）
2
表 1 蝙蝠葛碱和内标在大鼠和人血浆中的萃取回收率（％，
n＝4）
Tab 1 Extraction recovery rates of dauricine and IS in rat
and human plasma（％，n＝4）
样品浓度/μg·mL-1
7.55
1.89
0.47
IS
鼠血浆
回收率/％
95.41±0.086
80.60±0.069
77.18±0.035
80.63±0.056
RSD/％
9.0
8.5
4.5
7.0
人血浆
回收率/％
86.46±0.056
82.34±0.067
80.17±0.047
82.33±0.048
RSD/％
6.7
7.8
6.9
6.5
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中放置 36 h至其平衡，然后测定透析袋外的药物浓度（c 外）
（n＝3）。透析膜对药物的吸附率用下式计算：
X％＝[c1×V2－c外×（V1+V2）]/c1×V2×100％…………（公式1）
结果，蝙蝠葛碱在高、中、低（10.36、5.18、1.04 μg·mL-1）浓
度下的吸附率分别为 4.1％，3.3％，1.61％，表明透析袋对蝙蝠
葛碱几无吸附作用。
2.6 大鼠血浆中平衡时间的考察及血浆蛋白结合率的测定[7]
试验前先将透析袋预处理后在空白透析液中室温浸泡24
h。取一端扎紧的透析袋，除去袋内外水分，精密吸取2 mL空
白大鼠或人血浆加至透析袋中，扎紧袋口，悬浮于盛有 20 mL
含药透析液的广口棕色瓶中，调整透析袋位置使袋内外液面
保持同一水平，并避免贴瓶壁，密封瓶口，置于4℃中放置，分
别于 6、12 h取透析袋内外样品 100 µL，待测。待 24 h透析结
束时，吸取透析外液，加入三氯醋酸溶液，若有白色絮状物出
现，则证明有血浆蛋白漏出，该样品作废；无血浆蛋白漏出者，
分别取透析袋内外样品并测定药物浓度，计算血浆蛋白结合
率。血浆蛋白结合率的计算公式如下：
血浆蛋白结合率＝（袋内药物浓度－袋外药物浓度）/袋内
药物学×100％…………………………………………（公式 2）
结果表明，蝙蝠葛碱在 24 h时在大鼠或人血浆中透析已
达到平衡；在高、中、低（10.36、5.18、1.04 μg·mL-1）浓度下，蝙
蝠葛碱大鼠血浆蛋白结合率分别为（69.63±1.3）％、（68.64±
1.10）％、（72.54±0.50）％，人血浆蛋白结合率分别为（82.10±
1.00）％、（84.96±0.70）％、（78.79±0.6）％，经过 t检验分析，同
种属内高、中、低浓度下无显著性差异（P＞0.05）。表明在
1.04～10.36 μg·mL-1浓度范围内，蝙蝠葛碱的大鼠或人血浆
蛋白结合率无浓度依赖性，蝙蝠葛碱具有中等偏强的血浆蛋
白结合率。蝙蝠葛碱的大鼠和人血浆蛋白结合率测定结果
见表 3。
表3 蝙蝠葛碱的大鼠和人血浆蛋白结合率测定结果（n＝3）
Tab 3 Results of binding rate of dauricine to rat and human
plasma protein（n＝3）
透析液浓度
/μg·mL-1
10.36
5.18
1.04
鼠蛋白血浆结合率/％
6 h
62.53±1.2
60.65±0.8
67.10±0.7
12 h
69.58±1.0
67.62±0.8
75.22±1.1
24 h
69.63±1.3
68.64±1.1
72.54±0.5
人血浆蛋白结合率/％
6 h
80.52±1.5
84.79±1.1
88.1±0.7
12 h
83.47±1.0
88.73±0.9
73.87±0.8
24 h
82.1±1.0
84.96±0.7
78.79±0.6
经过 t检验分析，比较蝙蝠葛碱在大鼠和人血浆中蛋白结
合率，蝙蝠葛碱血浆蛋白结合率具有种属差异性（P＜0.05），且
人血浆蛋白结合率较大鼠血浆蛋白结合率高。
3 讨论
目前，血浆蛋白结合率最常用的方法为平衡透析法，与其
他方法比较，该方法具有简单、快速和成本较低的特点，但同
时也存在一些缺点，如通常平衡时间较长、血浆和药物在37℃
下长时间放置易不稳定或变质、透析膜可能对药物存在吸附
等问题。为克服血浆变质的问题，有许多选择在低温条件下
（如 4℃）进行试验，本试验在预试验时发现蝙蝠葛碱在 37℃
条件下长时间放置（放置12 h）不稳定，血浆蛋白也易变质，故
选择在4℃条件下进行试验。
本研究结果表明，蝙蝠葛碱在 1.04～10.36 μg·mL-1范围
内，蝙蝠葛碱的大鼠或人血浆蛋白结合率无浓度依赖性，说明
蝙蝠葛碱在该浓度下与血浆蛋白的结合未达到饱和。本课题
组在前期的对蝙蝠葛碱在体实验中研究发现，蝙蝠葛碱大鼠 iv
后半衰期期较长（约5～7 h），推测与其较高强度的血浆蛋白结
合率有直接关系。
由于体外试验条件（透析温度、药物浓度和缓冲液 pH值
等）均不能完全模拟药物在体内的环境，故体外试验结果不能
完全代表药物的体内血浆蛋白结合率，该结果可作为体内真
实血浆蛋白结合率的参考。可进一步进行体内实验，研究蝙
蝠葛碱在组织中（如血浆、心、肝、脾、肺、肾、脑等）的分布，比
较药物在血浆和组织中浓度差异，从而判断其与血浆蛋白结
合的程度，体内、外研究结果结合起来，结果将更为可靠。
参考文献
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（收稿日期：2011-01-17 修回日期：2011-04-24）
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