全 文 ：浙江中医药大学学报 2016 年 3 月第 40 卷第 3 期
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基金项目：浙江省自然科学基金项目（LY14H280006）；浙江省大学生科技创新项目（2014R410024）
Fund projects: Natural Science Foundation of Zhejiang Province(LY14H280006); Zhejiang Provincial undergraduate
technological innovation program(2014R410024)
通讯作者：赵伟春，E-mail：weichunzhao@hotmail.com
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2016
论
著
腹水草对人胃上皮细胞 GES-1的保护作用及其
对 PKA、CREB、AQP1的调控研究
徐艳山 1 赵伟春 1 王丹依 1 陈刚 2
1.浙江中医药大学生命科学学院 杭州 310053 2.西门菲莎大学化学系 温哥华 V5A 1S6 加拿大
摘要：[目的]研究腹水草（Veronicastrum axillare，V. axillare）含药血清对乙醇损伤的人胃上皮细胞（gastric epithelial cells-1，GES-1）的保护作用及其
对环腺苷酸依赖性激酶（protein kinase A，PKA）、环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）、水通道蛋白 1（aqua－
porin 1，AQP1）表达水平的调控作用。[方法]20只雄性 SD大鼠随机分为 5组（n=4），连续灌胃给药 14d，制备正常组（生理盐水 20 mL·kg-1）、雷尼替
丁组（0.027g·kg-1）以及 V. axillare低、中、高剂量组（0.7、1.4、2.8 g·kg-1）含药血清。MTT法检测体外培养的 GES-1细胞的活性，研究 V. axillare含药
血清及 PKA抑制剂 H-89（25μmol·mL-1）预处理对 5%乙醇诱导 GES-1细胞活力的影响。荧光定量 RT-PCR检测 PKA、CREB及 AQP1 mRNA的表
达水平，Western blot检测 AQP1蛋白表达水平。[结果]模型组和 H-89组 GES-1细胞活性低于正常组，差异有统计学意义（P<0.01）；乙醇造模处理
显著上调 PKA、CREB及下调 AQP1的表达水平，差异有统计学意义（P<0.01）；H-89处理显著抑制 PKA和 CREB mRNA表达水平（P<0.01）；加入
各剂量 V. axillare含药血清不能显著改善 H-89对 PKA、CREB和 AQP1 mRNA表达水平的抑制作用。V. axillare中、高剂量含药血清细胞活性高于
模型组，PKA、CREB mRNA表达水平低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01），而 V. axillare中、低剂量含药血清 AQP1表达水平高于模型组，差
异有统计学意义（P<0.01）。[结论]V. axillare含药血清显著减轻乙醇对 GES-1细胞的损伤，对 GES-1细胞具有保护作用，其保护机制与下调 PKA、
CREB及上调 AQP1的表达有关。
关键词：V. axillare；GES-1；cAMP-PKA-CREB信号通路；AQP1
中图分类号：R331 文献标识码：A 文章编号：1005-5509（2016）03-0173-06
DOI: 10.16466/j.issn1005-5509.2016.03.004
Protective Effect of Veronicastrum Axillare on Human Gastric Epithelial Cells(GES-1) and Its Modulation on the PKA, CREB and AQP1 Xu
Yanshan, Zhao Weichun, Wang Danyi, et al School of Life Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou(310053), China
Abstract: [Objective] To study the protective effect of Veronicastrum axillare on human gastric epithelial cells(GES-1) against ethanol damage, and its
modulation on the expression of PKA, CREB and AQP1. [Methods] 20 male SD rats were divided into five groups and prepared by 14 consecutive daily
intragastric administration of 0.9% saline, Ranitidine(0.18%, 0.027g·kg-1), and V. axillare decoction(0.7, 1.4, 2.8g·kg-1 respectively for low/mid/high dose
groups). The drug-loaded serums from different groups were prepared and used to culture GES-1 cells in vitro. Cell damage was induced by 5% ethanol,
and the effect of drug-loaded serums and PKA inhibitor H-89(25μmol·mL-1) pretreatment on cell viabilities were measured with MTT assays. The mRNA
expressions for PKA, CREB and AQP1 were measured with RT-PCR, and the AQP1 protein expression was measured with Western blot. [Results]
Compared with the normal group, 5% ethanol and H-89 significantly reduced cell viability(P<00.01). Ethanol treatment could significantly up-regulate
PKA, CREB, and down-regulate AQP1(P<0.01). H-89 treatment greatly inhibited the expression of PKA and CREB(P<0.01), and addition of V.
axillare could not effectively reverse this inhibition. Compared with the model group, V. axillare medium and high dose groups significantly increased cell
viability and down-regulated PKA, CREB(P<0.01), V. axillare medium and low dose groups significantly up-regulated AQP1(P<0.05, P<0.01). [Conclusion]
V. axillare-loaded serum significantly protected GES-1 cells against ethanol damage. The protection was related to the down-regulation of PKA, CREB,
and the up-regulation of AQP1.
Key words: V. axillare; Human gastric epithelial cell(GES-1); cAMP-PKA-CREB signal pathway; Aquaporin1
胃溃疡作为消化系统疾病的一种，其愈合的质
量与胃黏膜屏障修复密切相关，而胃黏膜屏障的修
复与胃上皮细胞的凋亡有着紧密联系，当胃上皮细
胞凋亡增加，则会导致胃溃疡难以好转 [1]，同时胃溃
疡的发生也与水液代谢有着密切关系。人的胃黏膜
中存在多种水通道蛋白（aquaporins，AQPs），AQPs作
为介导水跨膜运输的通道，在胃黏膜损伤和修复过
程中发挥着重要的作用[2-3]。近年来有文献报道环腺苷酸-
环腺苷酸依赖性激酶（cyclic adenosine monophosphate-
protein kinase A，cAMP-PKA）参与了 AQPs的表达[4]。
腹水草（Veronicastrum axillare，V.axillare）为玄
参科腹水草属植物，在民间常被用来治疗胸腔积水、
胃溃疡等相关疾病。前期的研究也发现，V.axillare能
显著降低无水乙醇对大鼠胃黏膜组织的损伤[5-7]。本
课题进一步采用体外培养人胃上皮细胞（gut esterase
gene-1，GES-1），制备乙醇损伤细胞模型，从 cAMP-
PKA-环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response
element binding protein，CREB）信号通路研究 V.
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浙江中医药大学学报 2016 年 3 月第 40 卷第 3 期
axillare对 GES-1的保护作用及其对 AQP1的调控机
制，为进一步明确 V.axillare水提液抗胃溃疡的分子
机制提供实验依据。
1 材料
1.1 实验动物 SPF级 SD雄性大鼠 20只，体质量
180～220g，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提
供，合格证号：SCXK（沪）2008-0016。大鼠于温度(23±
2)℃，湿度为 50%～70%的相同条件下饲养，自由采食
饮水。
1.2 药物及试剂 V.axillare全草采自浙江丽水，经
浙江中医药大学姚振生教授鉴定为玄参科腹水草属
植物。取 70g V.axillare粉末，用 8倍体积水加热回流
提取 3次，每次 1.5 h，合并 3次水提液，减压浓缩至
500mL，即得高剂量 V.axillare水提液（0.140g·mL-1），
将高剂量 V.axillare水提液分别稀释 1倍和 3倍，即
得中剂量水提液（0.070g·mL-1） 和低剂量水提液
（0.035g·mL-1）[6]。雷尼替丁胶囊，购自上海现代哈森
（商丘）药业有限公司，批号：14071604，临用前加蒸
馏水配制成质量分数为 0.18%的混悬液；无水乙醇，
购自杭州双林化工试剂厂，批号：20140820；GES-1
细胞株，购自南京市科佰生物科技有限公司；DMEM
高糖培养基，购自 HyClone公司，批号：AAE202588；
H-89（PKA抑制剂），购自 Selleck Chemicals公司；
AQP1兔源一抗，购自 Sigma公司，批号：3114546；
IRDye R 680RD荧光二抗，购自 LI-COR公司，批号：
C41009-01；IRDye R 800CW荧光二抗，购自 LI-COR
公司，批号：C41021 -04；PrimeScriptTM RT Master
Mix，购自 TakaRa公司，批号：RR036A；SYBR Premix
Ex TaqTMⅡ，购自 TakaRa公司，批号：RR820A。
1.3 仪器 Thermo3111型 CO2培养箱（Thermo公司），
TE2000-S 型倒置荧光相差显微镜（Nikon 公司），
Milli-Q型纯水仪（MILLIPORE公司），3K15型高速冷
冻离心机（Sigma公司），Tanon 2500型凝胶成像系统
（天能科技有限公司），Q5000型微量紫外可见分光光
度计（Quawell公司），StepOnePlusTM Real-Time PCR
System（ABI公司），Multiskan Flash型酶标仪（Thermo
公司），1703940 型半干转移系统（Bio-Rad 公司），
Odyssey双色红外激光成像系统（LI-COR公司）。
2 方法
2.1 含药血清的制备 将 20只大鼠随机分成正常
组（生理盐水）、V. axillare低剂量组（0.035g·mL-1）、V.
axillare中剂量组（0.07g·mL-1）、V. axillare高剂量组
（0.14g·mL-1）、雷尼替丁组（0.00135g·mL-1），每组 4
只，按 20mL·kg-1的剂量连续灌胃给药 13d，自由采食
饮水。于第 13d给药后，禁食不禁水，第 14d给药 2h
后，按 3mL·kg-1皮下注射 10%水合氯醛，待大鼠麻醉
后，切开腹部，腹主动脉取血，室温静置 1h，3500r/min
离心 10min，取上清液，即得正常血清，雷尼替丁和 V.
axillare低、中、高剂量含药血清。-20℃保存备用。
2.2 细胞的传代培养 采用含 10%胎牛血清（fetal
bovine serum，FBS）的 DMEM 培养液于 37℃、5%CO2
的条件下培养 GES-1细胞。隔天换液，当细胞长满瓶
底时，在 25T的培养瓶中加入 1mL 0.25%的胰蛋白
酶进行消化，并按 1:3的比例传代。
2.3 细胞分组及造模 将细胞分为 10组，即正常
组、模型组、H-89组、低剂量+H-89组、中剂量+H-89
组、高剂量+H-89组、雷尼替丁组（阳性对照组）、低
剂量组、中剂量组、高剂量组。各组血清在培养液中
的浓度均为 10%，H-89的浓度均为 25μmol·mL-1。取
对数生长期的 GES-1细胞接种于 6孔板或 96孔板
中培养，待细胞贴壁 24h后，吸出原有培养液。PBS清
洗 2次，换用含 10% FBS或各含药血清的培养液，继
续培养 24h后，除正常组外，其余各组分别加入无水
乙醇，并使培养液中乙醇终浓度为 5%[8]，继续培养
4h，收集各组细胞，进行后续实验。
2.4 细胞存活率检测 将 GES-1细胞悬液（4×104
个/mL）接种于 96孔板，每孔 100μL，每组 6个复孔。
细胞培养、给药和造模方法见 2.2和 2.3，以不加细胞
只加培养液为空白对照。造模并培养 4h后，每孔加
入 20μL MTT溶液（5mg·mL-1），继续培养 4h，每孔加
入 150μL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），检
测各孔在 490nm波长处的吸光度 A。
2.5 RT-PCR 检测 PKA、CREB 及 AQP1mRNA 的表
达 取对数生长期的 GES-1 细胞接种于 6 孔板
（1.2×106个/孔）中培养，每孔加 2mL 培养基，每组 3
个复孔，细胞的培养、给药和造模方法见 2.2和 2.3。
采用 Trizol试剂提取 GES-1细胞总 RNA，取 0.5μg
RNA采用 PrimeScriptTM RT Master Mix 试剂盒进行
逆转录，取 2μL 逆转录产物采用 SYBR Premix Ex
TaqTMⅡ Kit扩增目的基因 cDNA片段（引物见表 1），
PCR 的反应条件为：95℃预变性 30s，95℃ 5s，60℃
30s，共 40个循环，以 β-actin为内参基因，根据 2-ΔΔCt
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等
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腹
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人
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上
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细
胞
GES-1
的
保
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作
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及
其
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PKA
、CREB
、AQP1
的
调
控
研
究
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表 1 β-actin、PKA、CREB和 AQP1引物
Tab.1 Forward and reverse primers for β-actin, PKA, CREB and AQP1
基因 正向引物 5′-3′ 反向引物 5′-3′ 产物大小（bp）
β-actin
PKA
CREB
AQP1
CCTGGCACCCAGCACAAT
AGGAGACCGGGAACCACTAT
AACCAGCAGAGTGGAGATGC
ATCTTCCGTGCCCTCATGTA
GGGCCGGACTCGTCATAC
GACGAGGAACGGAAAGTTGA
AGAGTTACGGTGGGAGCAGA
ACACCATCAGCCAGGTCATT
144
125
140
128
法[7]进行 mRNA表达量的相对定量分析。
2.6 Western blot 检测 AQP1 蛋白的表达 细胞接
种、复孔数、培养、给药和造模方法参考“2.2和 2.3”。
细胞用预冷 PBS 洗涤 3 次，加入终浓度为 1mM
PMSF 的 RIPA裂解液提取总蛋白，采用 BCA试剂盒
测蛋白浓度，每孔上样总蛋白 30μg，上样总体积为
18μL，电泳，然后采用半干法转膜 50min，3%脱脂牛
奶封闭 2h，PBST 洗涤 5 次，每次 5min，一抗（1:900）
4℃封闭过夜，PBST洗膜后加荧光二抗（1:2500）室温
避光孵育 1.5h，PBST洗膜后，采用 Odyssey双色红外
激光成像系统扫描，以 β-actin 为参照，结果用灰度
值比值表示。
2.7 统计学方法 数据分析采用 SPSS 18.0统计软
件，所有数据以均值±标准差（x±S）表示，组间差异采
用单因素方差分析，两两比较采用 Tukey HSD法，P<
0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 V.axillare含药血清对乙醇损伤后细胞活力的影
响 模型组、H-89组、V.axillare各剂量+H-89组、V.
axillare 低剂量组及雷尼替丁组细胞活力低于正常
组，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；而 V.axillare
中、高剂量组及雷尼替丁组的细胞活力高于模型组
和 H-89组，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；同
时 V.axillare中、高剂量组细胞活力也高于低剂量+
H-89 组，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。见
图 1。
3.2 V. axillare 含药血清对 PKA、CREB 及 AQP1
mRNA 表达的影响 模型组 PKA、CREB mRNA 表
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PKA
、CREB
、AQP1
的
调
控
研
究
达水平高于正常组，差异有统计学意义（P<0.01），
AQP1 mRNA表达水平低于正常组，差异有统计学意
义（P<0.01）；雷尼替丁组及 V.axillare中、高剂量组
PKA、CREB mRNA表达水平低于模型组，差异有统计
学意义（P<0.01），V.axillare中、低剂量组 AQP1 mRNA
的表达水平高于模型组，差异有统计学意义（P<0.01），
V.axillare各剂量组 PKA、CREB mRNA表达水平高于
H-89组和 V.axillare各剂量+H-89组，差异有统计学
意义（P<0.01），而 V.axillare中剂量组 AQP1 mRNA表
达水平高于 H-89组和 V.axillare各剂量+H-89组，差
图 1 V.axillare含药血清对乙醇诱导损伤的 GES-1细胞活力的影响
Fig.1 Effect of serum containing V. axillare on cell activity in GES-1 injured by ethanol
注:1. 正常组；2. 模型组；3.H-89组；4. 低剂量+H-89组；5. 中剂量+H-89组；6. 高剂量+H-89组；7. 雷尼替丁组；8. V. axillare低剂量组；9. V.
axillare中剂量组；10. V. axillare高剂量组。与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与 H-89组比较，▽P<0.05，▽▽P<0.01；与
低剂量+H-89组比较，○P<0.05，○○P<0.01。
Note: 1. normal; 2. model; 3. H-89; 4.low dosage of V. axillare+H-89; 5. medium dosage of V. axillare+H-89; 6. high dosage of V. axillare+H-89; 7.
Ranitidine; 8.low dosage of V.axillare; 9.medium dosage of V. axillare; 10.high dosage of V. axillare. Compared with normal, *P<0.05, **P<0.01; compared with
model, △P<0.05, △△P<0.01; compared with H-89, ▽P<0.05, ▽▽P<0.01; compared with low dosage of V. axillare+H-89, ○P<0.05, ○○P<0.01.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
A(
49
0n
m
)
组别
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胃溃疡是发生于贲门与幽门之间的炎性坏死性
病变，是我国人群中最为常见、多发的疾病之一。其
表现为中央部位炎性坏死和典型的水肿。项目组的
前期研究发现，V.axillare水提液显著减轻无水乙醇对
大鼠胃黏膜组织的损伤[5-7]。为了进一步明确 V.axillare
抗胃溃疡的作用机制，本实验在体外培养 GES-1细
胞的基础上，采用 MTT法检测各剂量 V.axillare含药
血清对 5%乙醇诱导 GES-1细胞活力的影响。结果表
明，V.axillare含药血清显著降低乙醇对 GES-1细胞
的损伤，这一结果与动物实验结果相一致[5-7]，并首次
在细胞水平上证明 V.axillare水提液具有抵抗乙醇对
GES-1造成损伤的作用。
cAMP-PKA-CREB信号通路在细胞内有着重要
的调节作用。cAMP对转录的调控主要通过 PKA，活
化的 PKA催化 CREB磷酸化，磷酸化的 CREB与CRE
结合，从而激活 CRE调控的基因转录[9]。为了探讨该信
号通路在胃黏膜损伤中的作用及 V.axillare抗胃溃疡
的作用机制，本实验采用该信号通路的抑制剂 H-89
预处理 GES-1细胞，再通过检测细胞活力探讨该信
号通路与胃上皮细胞损伤及修复的关系。实验结果
表 2 V. axillare含药血清对 PKA、CREB及 AQP1 mRNA表达的影响
Tab.2 Effect of serum containing V. axillare on PKA, CREB and AQP1 mRNA in GES-1 injured by ethanol
组别 给药剂量[g/(kg·d)] PKA CREB AQP1
正常组
模型组
H-89组
低剂量+H-89组
中剂量+H-89组
高剂量+H-89组
雷尼替丁组
V. axillare低剂量组
V. axillare中剂量组
V. axillare高剂量组
-
-
-
0.7
1.4
2.8
0.027
0.7
1.4
2.8
1
1.36±0.27**
0.11±0.04**△△
0.24±0.03**△△
0.16±0.05**△△
0.26±0.04**△△
1.05±0.10△△▽▽○○◆◆■■
1.42±0.07**▽▽○○◆◆■■
0.97±0.07△△▽▽○○◆◆■■●●
1.04±0.13△△▽▽○○◆◆■■●●
1
1.25±0.13**
0.10±0.04**△△
0.09±0.01**△△
0.08±0.01**△△
0.10±0.04**△△
0.78±0.11**△△▽▽○○◆◆■■
0.49±0.10**△△▽▽○○◆◆■■
0.98 ±0.04△△▽▽○○◆◆■■●●
0.86±0.08△△▽▽○○◆◆■■●●
1
0.40±0.10**
0.18±0.06**
0.12±0.05**
0.72±0.25○
0.26±0.16**
0.62±0.11○
1.21±0.22△△▽▽○■■
1.67±0.87*△△▽▽○◆◆■■
0.64±0.19○●
注:与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01；与 H-89组比较，▽▽P<0.01；与低剂量+H-89组，○P<0.05，○○P<0.01；与中剂量+H-89
组，◆◆P<0.01；与高剂量+H-89组，■■P<0.01；与低剂量比较，●P<0.05，●●P<0.01。
Note: Compared with normal, *P<0.05, **P<0.01; compared with model, △△P<0.01; compared with H-89, ▽▽P<0.01; compared with low dosage of V. ax－
illare+H-89, ○P<0.05, ○○P<0.01; compared with medium dosage of V. axillare+H-89, ◆◆P<0.01; compared with high dosage of V. axillare+H-89, ■■P<0.01;
compared with low dosage of V. axillare, ●P<0.05, ●●P<0.01.
异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；并且 V.axillare中、
高剂量组对 PKA、CREB mRNA表达的调节作用强于
低剂量组（P<0.01），见表2。
3.3 V.axillare含药血清对 AQP1蛋白含量的影响
模型组及 H-89组 AQP1蛋白表达低于正常组，差异
有统计学意义（P<0.01）；V.axillare各剂量组及各剂量+
H-89组 AQP1蛋白高于模型组，差异有统计学意义
（P<0.05，P<0.01）。V.axillare中、高剂量组及 V.axillare
中、高剂量+H-89 组 AQP1蛋白高于 H-89 组，差异
有统计学意义（P<0.05，P<0.01），见图 2、图 3。
4 讨论
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图 2 AQP1蛋白含量的Western blot检测结果
Fig.2 Western blot analysis of AQP1
注:1.正常组；2.模型组；3.H-89组；4.低剂量+H-89组；5.中剂量+H-89组；6.高剂量+H-89组；7.雷尼替丁组；8. V. axillare低剂量组；9. V. axillare
中剂量组；10. V. axillare高剂量组。
Note: 1. normal; 2. model; 3. H-89; 4. low dosage of V. axillare+H-89; 5. medium dosage of V. axillare+H-89; 6. high dosage of V. axillare+H-89; 7.
anitidine; 8. low dosage of V. axillare; 9. medium dosage of V. axillare; 10. high dosage of V. axillare.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
AQP1
β-actin
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表明，H-89组的细胞活力低于 V. axillare各剂量组，
差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；同时加入 H-89
和各剂量 V.axillare含药血清后，各组的细胞活力均
不同程度地低于不加 H-89而只加对应剂量 V. axil－
lare含药血清的各组，低剂量+H-89 组的细胞活力
低于 V.axillare中、高剂量；而与单独加 H-89组相比
较，同时加 H-89和 V.axillare含药血清各组细胞活
力略有上升，尽管差异无统计学意义。上述结果表
明，H-89 在一定程度上降低了 V.axillare 抗 GES-1
细胞损伤的作用，从而首次揭示了 V.axillare含药血
清抗乙醇对 GES-1损伤的作用与 cAMP-PKA-CREB
信号通路相关。
AQP1在机体的组织中广泛分布，特别在液体分
泌和吸收功能旺盛的上皮细胞中含量丰富。研究发
现，用病毒感染诱导急性肺损伤后，小鼠肺水肿且肺
内 AQP1 的 mRNA和蛋白表达量均下降，在肺部炎
症开始减轻后 AQP1 的 mRNA和蛋白表达量有所恢
复[10]；肺泡内灌注脂多糖 4~12h后出现明显的肺水肿
且 AQP1蛋白表达明显减少[11]。本实验结果表明，无水
乙醇可下调 AQP1 mRNA和蛋白的表达。这一结果
与以往肺部炎症和肺水肿的研究结果相一致[10-11]。本
研究还发现，V.axillare 含药血清上调 AQP1 mRNA
和蛋白的表达，这一结果表明，V.axillare含药血清减
轻乙醇对 GES-1细胞的损伤可能与上调 AQP1的表
达进而调节细胞的水液代谢有关。
有报道发现 AQPs的磷酸化依赖于 cAMP，同时
AQP1、AQP3、AQP4 等都含有 PKA 磷酸化的同源序
列，这些 AQPs都受磷酸化作用的直接调节，而磷酸
化与 AQPs的运输、门控等有关，在某些因素作用后，
cAMP增加，进而 PKA被活化，活化的 PKA在催化
CREB 磷酸化的同时，也催化 AQPs 上丝氨酸磷酸
化，增加细胞膜对水的通透性[4]。有研究表明，cAMP-
PKA信号通路能够通过 CREB磷酸化途径参与大鼠
鼻黏膜细胞 AQP5的调控[12]。同时可逆的蛋白质磷酸
化是 AQP1功能调节的一种主要方式，且其活性会受
cAMP-PKA信号通路的调控。将 AQP1的 cDNA转入
爪蟾卵母细胞，AQP1 的水转运活性能够被 PKA 的
激动剂 cAMP和 Forskolin显著提高[13]，利用离体的人
羊膜上皮细胞实验，AQP1 可在 mRNA 水平上被
cAMP 上调[14]，而胃炎、胃溃疡、腹泻、便秘等胃肠疾
病的发生、发展和转归均与 AQPs参与的水液跨膜运
输密切相关[15]。本研究发现，无水乙醇可诱导上调 GES-
1细胞的 PKA、CREB mRNA的表达，下调 AQP1 mR－
NA和蛋白的表达；而 V.axillare含药血清可以下调
PKA、CREB mRNA的表达，并上调 AQP1 mRNA和
蛋白的表达。当加入 PKA 抑制剂 H-89 后，PKA、
CREB及 AQP1的 mRNA表达均显著降低，表明 PKA
成功被抑制，使 CREB不能被磷酸化，进而影响转录
过程的正常进行，AQP1的磷酸化水平亦降低，进而
影响了水液的跨膜运输，加剧了对 GES-1细胞的损
伤作用；同时 V.axillare各剂量+H-89组 PKA、CREB
及 AQP1的 mRNA的表达相比 V.axillare各剂量组也
显著降低，这一结果与 V.axillare在cAMP-PKA-CREB
被阻断后，其对无水乙醇诱导的 GES-1细胞的保护
徐
艳
山
，
等
：
腹
水
草
对
人
胃
上
皮
细
胞
GES-1
的
保
护
作
用
及
其
对
PKA
、CREB
、AQP1
的
调
控
研
究
图 3 V. axillare含药血清对 AQP1蛋白含量的影响
Fig.3 Effect of serum containing V. axillare on expression of AQP1 in GES-1 injured by ethanol
注:1.正常组；2.模型组；3.H-89组；4.低剂量+H-89组；5.中剂量+H-89组；6.高剂量+H-89组；7.雷尼替丁组；8.低剂量组；9.中剂量组；10.高剂量组。
与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与 H-89组比较，▽P<0.05，▽▽P<0.01。
Note: 1. normal; 2. model; 3. H-89; 4. low dosage of V. axillare+H-89; 5. medium dosage of V. axillare+H-89; 6. high dosage of V. axillare+H-89; 7.
Ranitidine; 8.low dosage of V. axillare; 9. medium dosage of V. axillare; 10. high dosage of V. axillare. Compared with normal, *P<0.05, **P<0.01; compared
with model, △P<0.05, △△P<0.01; compared with H-89, ▽P<0.05, ▽▽P<0.01.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
组别
0.008
0.007
0.006
0.005
0.004
0.003
0.002
0.001
0
AQ
P1
/β
-a
ct
in
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浙江中医药大学学报 2016 年 3 月第 40 卷第 3 期
徐
艳
山
，
等
：
腹
水
草
对
人
胃
上
皮
细
胞
GES-1
的
保
护
作
用
及
其
对
PKA
、CREB
、AQP1
的
调
控
研
究
作用降低的结果相一致。上述结果表明，V.axillare含
药血清能够保护 GES-1细胞免受无水乙醇造成的损
伤，其保护机制可能与 cAMP-PKA-CREB信号通路
中相关因子及 AQP1的表达有关。实验结果显示，与
V.axillare低、中剂量+H-89组相比较，V.axillare低、
中剂量组 AQP1的 mRNA合成增多，但 AQP1蛋白含
量在 V.axillare低、中剂量组与低、中剂量+H-89组间
无显著差别，可能是因为 cAMP-PKA 信号通路对
AQP1蛋白的调控作用主要是通过磷酸化活化 AQP1
蛋白，而并非调节 AQP1蛋白的合成数量，亦可能是
因为同时受细胞内其他因子或其他通路比如 NF-κB
信号通路的调控，也可能是因为 V.axillare 各剂量+
H-89组细胞 AQP1蛋白的消耗减小等因素共同作用
的结果；而 AQP1的 mRNA与 PKA表达呈负相关，可
能是由于细胞内其他信号通路比如 NF-κB信号通路
等与 cAMP-PKA信号通路在转录水平上共同作用的
结果，具体的作用机制有待于进一步研究。
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（收稿日期：2015-10-30）
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