全 文 ：头花蓼对胃黏膜上皮细胞ＧＥＳ－１
细胞毒性的研究
　　温丽娜１　罗昭逊１△　张　姝１　谢小琴１　雷　萍１　莫　非２
　　（１．贵阳医学院医学检验学院，贵州 贵阳５５０００４；２．贵阳医学院医学检验学院临检教研室，
贵州 贵阳５５０００４）
　　摘　要　目的　探讨头花蓼对胃黏膜上皮细胞株ＧＥＳ－１增殖的影响。方法 体外培养人胃黏
膜上皮细胞株ＧＥＳ－１，采用 ＭＴＴ法连续监测７ｄ，以存活细胞数ＯＤ值对培养时间（ｈ）作图，即得生
长曲线。不同浓度头花蓼（１０２４μｇ／ｍＬ、５１２μｇ／ｍＬ、２５６μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ、６４μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、
１６μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ，）与对数期ＧＥＳ－１细胞共同培养４８ｈ，采用 ＭＴＴ法检测细胞增殖。结果 （１）体
外培养胃黏膜上皮细胞株ＧＥＳ－１，生长曲线显示：细胞于培养的４８ｈ进入对数生长期，１２０ｈ进入平
台期。本实验选９６ｈ加药进行后续实验；（２）ＭＴＴ实验表明：低于１２８μｇ／ｍＬ时，活细胞数量没有
明显变化，细胞增殖无影响。结论 头花蓼浓度高于１２８μｇ／ｍＬ时，对胃黏膜上皮细胞株ＧＥＳ－１的生
长有明显的抑制作用，头花蓼因细胞毒性较低具有潜在的临床应用前景，为头花蓼对 Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ相关
性胃炎的抗菌、抗炎机制奠定了实验基础。
　　关键词　头花蓼　　ＧＥＳ－１细胞　　ＭＴＴ法
Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｃａｐｉｔａｔｕｍ　ｉｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｓ　ＧＥＳ－１　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｗｅｎ　Ｌｉｎａ１，
Ｌｕｏ　Ｚｈａｏｘｕｎ１，Ｚｈａｎｇ　Ｓｈｕ１，Ｘｉｅ　Ｘｉａｏｑｉｎ１，Ｌｅｉ　Ｐｉｎｇ１，Ｍｏ　Ｆｅｉ２．１．Ｔｈｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｏｆ
Ｇｕｉｙａｎｇ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｃｈｉｎａ．２．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｇｕｉｙ－
ａｎｇ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｃａｐｉｔａｔｕｍ　ｉｎ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｅｐｉ－
ｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌ　ＧＥＳ－１．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｈｕｍａｎ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅ　ＧＥＳ－１ｗｅｒｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ，ＭＴＴ　ａｓ－
ｓａｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ　７ｄ，ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｎｕｍｂｅｒ　ｃｅｌ　ＯＤ　ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ（ｈ）ｍａｐｐｉｎｇ，ｔｈｅ
ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｃａｐｉｔａｔｕｍ （１０２４μｇ／ｍＬ，５１２μｇ／ｍＬ，
２５６μｇ／ｍＬ，１２８μｇ／ｍＬ，６４μｇ／ｍＬ，３２μｇ／ｍＬ，１６μｇ／ｍＬ，８μｇ／ｍＬ）ａｎｄ　ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ　ｐｈａｓｅ　ｏｆ　ＧＥＳ－
１ｃｅｌｓ　ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　４８ｈ，ｕｓｉｎｇ　ＭＴＴ　ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｃｅｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｇａｓｔｒｉｃ
ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅ　ＧＥＳ－１ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅ，ｇｒｏｗｔｈ　ｃｕｒｖｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｃｅｌｓ　ｅｎｔｅｒｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ
ｇｒｏｗｔｈ　ｐｅｒｉｏｄ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　４８ｈ，ｔｈｅ　ｐｌａｔｆｏｒｍ　ｐｅｒｉｏｄ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　１２０ｈ，Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ　９６ｈ
ｄｏｓｅｄ　ｆｏｒ　ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．ＭＴＴ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｂｅｌｏｗ　１２８μｇ／ｍＬ，ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｃｈａｎｇｅ　ｉｎ　ｔｈｅ
ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｌｉｖｉｎｇ　ｃｅｌｓ，ｎｏ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｃｅｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｗｈｅｎ　ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｃａｐｉｔａｔｕｍ　ｃｏｎｃｅｎ－
ｔｒａｔｉｏｎｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　１２８μｇ／ｍＬ，ｇａｓｔｒｉｃ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｓ　ｓｔｒａｉｎｓ　ＧＥＳ－１ｇｒｏｗｎ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ，
ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｃａｐｉｔａｔｕｍ　ｈａｓ　ｌｏｗｅｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｔｈａｔ　ｈａｓ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ　ｂｕｉｌｔ　ｔｈｅ　ｅｘ－
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｃａｐｉｔａｔｕｍ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｇａｓｔｒｉｔｉｓ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ａｎｔｉ－ｂａｃｔｅ－
ｒｉａｌ　ａｎｄ，ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ　ｃａｐｉｔａｔｕｍ　　ＧＥＳ－１ｃｅｌｓ　　ＭＴＴ　ｍｅｔｈｏｄ
　　注：本课题系高等学校特色专业建设点（ＮＯ：［２０１０］１５）；贵州省科
技厅、贵阳医学院联合基金资助项目［黔科合ＬＧ（２０１０）０５４
号］；贵州省科技厅、贵阳医学院联合基金资助项目［黔科合ＬＧ
［２０１２］０１２号］；贵州省科技计划课题［黔科合Ｊ字（２０１４）２０２７
号］；贵阳医学院附属医院博士基金（ＮＯ：２０１４）
△通信作者
　　中图分类号：Ｒ２８５　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１０００－７４４Ｘ（２０１４）１０－０８７８－０３
　　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ＩＳＳＮ．１０００－７４４Ｘ．２０１４．１０．００４
　　幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ，Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）感 染与慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌等发生密切相
关［１］，已被列为第Ⅰ类致癌原［２］，临床治疗常用三联
疗法。但随着抗生素耐药性的增加，需要筛选更为
安全高效的药物。头花蓼（Ｐｏｌｙｇｏｍｕｎ　ｃａｐｉｔｕｔａｍ）
对多种细菌具有抑菌作用［３］。本实验通过体外细胞
毒性实验，观察头花蓼对正常胃黏膜细胞增殖的影
·８７８· Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１４，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．１０
响，为临床治疗 Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ感染提供新药物。
１　材料和方法
１．１　材料　ＧＥＳ－１细胞：来源于人永生化胃黏膜
上皮细胞（ＧＥＳ－１），购于北京肿瘤研究所。头花蓼
浸膏由王子厚教授（原国家药检局新药审评中心研
究员）提供。
１．２　主要试剂及仪器　高糖ＤＭＥＭ 培养基（Ｈｙ－
ｃｌｏｎｅ），胎牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ），谷氨酰胺（Ａｍｒｅｓｃｏ
公司），四唑盐（北京奇华盛生物技术有限公司）；
三气培养箱（Ｔｈｅｒｍｏ），ＰＣＳ－１５０型 ＣＯ２细胞培养
箱（日本三洋株式会社），倒置显微镜（日本 Ｏｌｙｍ－
ｐｕｓ公司），酶标仪（ＢＩＯ－ｘＭａｒｋ）。
１．３　方法
１．３．１　胃黏膜上皮细胞ＧＥＳ－１的培养　人胃黏膜
细胞系ＧＥＳ－１细胞复苏后置于细胞培养瓶内，以
ＤＭＥＭ为培养液（含１０％胎牛血清，ｐＨ７．４），置
３７℃、５％ＣＯ２、９０％相对湿度培养箱中培养，隔天
更换培养液，每３ｄ按１∶２比例传代。
１．３．２　ＧＥＳ－１细胞生长曲线的测定　取生长状态
良好的ＧＥＳ－１细胞接种于９６孔板中，每孔１．６×
１０４ 个细胞，每隔 ２４ｈ 取出 一 板 加 入 浓 度 为
５ｍｇ／ｍＬ　ＭＴＴ　２０μＬ，培养４ｈ，吸弃孔内上清液，
每孔加入１５０μＬ　ＤＭＳＯ，振荡１０ｍｉｎ，在酶标仪上
测定各个孔在４９０ｎｍ处的ＯＤ值，共计７ｄ，以培养
时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制生长曲线。
１．３．３　用 ＭＴＴ法检测头花蓼对胃黏膜上皮细胞
ＧＥＳ－１的细胞毒性，计算细胞生长率　用胰酶消化对
数期细胞，制成细胞悬液，细胞计数调其浓度为１．６×
１０４ 个／孔。接种于９６孔培养板，每孔体积１００μＬ。
２４ｈ 后 小 心 吸 去 上 清，加 入 终 浓 度 分 别 为
１　０２４μｇ／ｍＬ、５１２μｇ／ｍＬ、２５６μｇ／ｍＬ、１２８μｇ／ｍＬ、
６４μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、１６μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ的头花蓼
溶液，每个浓度设６孔，每孔１００μＬ继续培养。培养
４８ｈ加入５ｍｇ／ｍＬ　ＭＴＴ　２０μＬ，继续培养４ｈ，用
１５０μＬ　ＤＭＳＯ溶解，置摇床上低速摇１０ｍｉｎ，在酶联
免疫检测仪４９０ｎｍ处测各孔的吸光度。并通过下列
公式计算细胞存活率：实验组Ａ值／阴性对照组Ａ
值×１００％。实验分为阴性对照组：未经药物处理的
胃黏膜上皮细胞ＧＥＳ－１组；头花蓼组：经不同浓度作
用的胃黏膜上皮细胞ＧＥＳ－１组。
１．４　统计学方法　统计学方法采用ＳＰＳＳ　７．０软件
进行数据统计分析，计量资料以珚ｘ±ｓ表示，以Ｐ
＜０．０５有统计学意义。
２　结　果
２．１　ＧＥＳ－１生长曲线　如图１所示，细胞于培养的
４８ｈ进入对数生长期，１２０ｈ进入平台期。在细胞
生长对数期１／３～１／２处加药，本实验选９６ｈ进行
后续实验。
图１　ＧＥＳ－１细胞生长曲线的趋势图
２．２　ＭＴＴ法检测不同头花蓼浓度作用ＧＥＳ－１细
胞４８ｈ增殖情况　如表１、图２所示，头花蓼对人胃
ＧＥＳ－１上皮细胞增殖的影响呈浓度依赖性；头花蓼
在低于１２８μｇ／ｍＬ作用于ＧＥＳ－１细胞时，对ＧＥＳ－１
细胞增殖没有明显作用，高于１２８μｇ／ｍＬ浓度时，
ＧＥＳ－１细胞数量明显降低，与空白对照组比较有统
计学差异﹙Ｐ＜０．０５）。
表１　 ＭＴＴ法检测不同头花蓼浓度作用ＧＥＳ－１
细胞４８ｈ增值情况 （珚ｘ±ｓ）
药物浓度 ＧＥＳ－１细胞ＯＤ（珚ｘ±ｓ）
０μｇ／ｍＬ　 ０．６６２３±０．０２５２
８μｇ／ｍＬ　 ０．６４４３±０．０１２６
１６μｇ／ｍＬ　 ０．６２１３±０．０３２１
３２μｇ／ｍＬ　 ０．５９７７±０．０７５７
６４μｇ／ｍＬ　 ０．５６１７±０．０７５７
１２８μｇ／ｍＬ　 ０．５０６０±０．０２７１★
２５６μｇ／ｍＬ　 ０．４０５７±０．０１２７★
５１２μｇ／ｍＬ　 ０．１７８３±０．０１７２★
１０２４μｇ／ｍＬ　 ０．１２２５±０．０２７２★
　　注：与空白对照比较，★Ｐ＜０．０５
图２　４８ｈ头花蓼对ＧＥＳ－１细胞增殖影响的趋势图
３　讨　论
自１９８２年 Ｍａｒｓｈａｌ 和 Ｗａｒｒｅｎ成功地培养并
·９７８·贵州医药２０１４年１０月第３８卷第１０期
分离出幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ，Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）
以来，证实 Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ是慢性胃炎的主要致病因素
之一。幽门螺杆菌与多种疾病的发生、发展有关，尤
其是各种胃病发生的重要因素，因此能否成功根除
幽门螺杆菌可作为衡量胃药治疗效果的参照依据之
一［４－５］。有实验表明［６］有些中药具有治疗 Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ
相关性胃炎的作用，中药不仅具有明显抗 Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ
效果，还可通过提高免疫功能、改善胃黏膜微环境、
增强组织修复能力等对胃黏膜损伤起到修复作用。
中药是我国传统的医药材料，许多中药制剂与西药
抗生素类药物相比，不仅价格低廉，而且对细菌耐药
具有逆转作用，细菌较少对中药产生耐药性，为
Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ相关疾病治疗提供新的治疗方案。中药
作用于抗菌的各个环节，能逆转细菌耐药，具有较好
的前景［７］。
头花蓼作为贵州特有精选苗药，该植物以黄酮
类和酚酸类化合物为其主要有效成分［８－９］。头花蓼
在抗菌、抗氧化、镇痛以及抗炎等方面表现出良好的
药理作用。目前主要用于治疗肾盂肾炎、泌尿系统
疾病等疾病，但目前国内外没有关于头花蓼对幽门
螺旋杆菌具有抑菌作用的相关报道。前期实验研究
头花蓼对幽门螺杆菌ＳＳ２０００的抗菌活性，结果显
示头花蓼水提物作用于 Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　７２ｈ后最小抑菌
浓度为４ｍｇ／ｍＬ。比反式茴香烯、田基黄提取物、
舒肝和胃丸、苦参、金银花等对 Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ的抑菌效
果更佳［１０－１１］。提示头花蓼水提物对 Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ有较
好的抑菌效果，作为一种天然的抑菌制剂，有望成为
抗 Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ的新型中药。因此，有必要对头花蓼
的细胞毒性进行深入研究，本实验从细胞水平来研
究头花蓼对胃黏膜上皮细胞ＧＥＳ－１的生长抑制情
况，来探讨头花蓼的临床潜在应用前景。
细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方
法，也是判定细胞活力的重要指标，是细胞生物学特
性的基本参数之一［１２］。为了准确描述整个过程中
细胞数目的动态变化，需要用 ＭＴＴ法连续对活细
胞进行监测。通常计数７ｄ。以吸光度ＯＤ值对培
养时间（ｈ）作图，即得生长曲线。生长曲线常用于
测定药物等外来因素对细胞生长的影响。一般在指
数生长期的１／３～１／２处加药［１３］。所以，如果按照
此方法，应该在７２～９６ｈ对细胞进行药物处理，本
研究在后续的实验中将选择培养９６ｈ加药。实验
自始至终由一人完成，并且测多次取平均值，在一定
程度上降低了误差，具有一定的科学性，可为后续研
究以及类似研究作为参考。
本研究从细胞水平研究头花蓼对人胃黏膜上皮
细胞是否具有直接损害作用。利用 ＭＴＴ比色方法
了解头花蓼对ＧＥＳ－１细胞的毒性情况。实验结果
显示头花蓼高于１２８μｇ／ｍＬ时，对ＧＥＳ－１细胞增殖
有明显的抑制作用。其他的中医药对幽门螺杆菌抑
制作用的研究大多旨在探索和证实中药抗Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ
的有效性，但缺乏涉及分子、细胞、免疫学角度的研
究，研究尚缺乏深度。本实验从细胞水平探索了头
花蓼的细胞毒性较低，因此头花蓼具有潜在的临床
应用前景，值得进一步深入研究。
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ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＤＮＭＴ１ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｔｈ
ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ｃｅｌｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅ
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·０８８· Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１４，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．１０