全 文 ：药　物　生　物　技　术
Pharmaceutical Biotechnology　2003 ,10(2):102 ～ 104
鹅绒藤蛋白酶的提纯与性质研究
杨　怡 ,苏海翔 ,姚　侃
(兰州医学院生化教研室 , 甘肃 730000)
摘　要　从鹅绒藤(Cynanchum chinese R.Br.)茎干乳汁中用凝胶层析 , 离子交换层析纯化蛋白酶。经 SDS-
PAGE 、IEF鉴定 , 为均一条带。分子质量 18ku;pI 6.7;作用最适 pH 7.0 , 最适温度范围 60 ～ 80℃。对 Hb A-β 链
水解的Km 值为 1.59×10 -6 mol L。巯基酶抑制剂 、保护剂实验提示该酶为巯基蛋白酶。用五肽胃泌素做底物 ,
通过分配层析分离并用 DABITC PITC双偶合法对肽斑片段测序的结果表明 , 该蛋白酶的水解位点特异性较低。
结论:该酶是一种活性较强的巯基蛋白酶。
关键词　蛋白酶;鹅绒藤(Cynanchum Chinese R.Br.)
中图分类号:Q55　　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-8915(2003)02-0102-03
　　植物蛋白酶的研究有百余年历史 ,根据其结构的
不同可分为 4大类:半胱氨酸蛋白酶(即巯基蛋白
酶),丝氨酸蛋白酶 ,酸性蛋白酶和金属蛋白酶。植物
体内的蛋白酶除参与蛋白质的分解与迁移外 ,还和细
胞间信号传导有关。现在从植物中提取 、纯化的蛋白
酶已 广泛应用于临床用药 、食品及轻工业生产。
鹅绒藤(Cynanchum chinese R.Br.),俗称羊奶角
角、老牛肿 , 系萝摩科(Asclepiadaceae)鹅绒藤属
(Cynanchum)的一种 ,在我国有广泛分布 ,甘肃产鹅绒
藤在当地作为民间用药已有历史。民间认为其根能
祛风解毒 ,健胃止痛 ,主治小儿食积;茎乳汁外敷 ,治
疗疣赘(1)。药理学研究表明 ,整个鹅绒藤属植物具
有免疫调节 、抗肿瘤、抗癫痫 、消炎止痛及强心作用[ 8] ,
但对其蛋白酶性质的研究未见报道。鹅绒藤植株茎
叶部含有丰富乳汁 ,乳汁中主要成分为萜烯类物质 、
橡胶类物质 、蛋白质、糖类物质及挥发油等 ,其蛋白酶
含量较高且具有较强的蛋白水解活性 ,作为细胞外酶
易于分离纯化。对其化学成分进行分析 ,得到了一些
产物(2),但目前国内 、外尚无对鹅绒藤乳汁中蛋白酶
提取纯化的报道 ,本文报告从甘肃产鹅绒藤(Cynan-
chum chinese R.Br.)乳汁中分离 、纯化出一种蛋白酶 ,
并对其性质做了初步研究。
1　材料和方法
1.1　材料
在植物产乳期(5 ～ 6月)采集鹅绒藤植株折茎
去叶 ,取其白色乳汁 , -40℃冻存 。
1.2　试剂
Sephadex G-25 为 Pharmacia 产品;DEAE-纤维
素 DE-32为Whatman 产品;酪蛋白为 Serva 产品;
丙烯酰胺为Sigma 产品;DABITC 为 Pierce 产品;L-
天冬氨酸 、L-色氨酸为 Light 产品;DL-蛋氨酸为
Merck 产品;其它试剂均为国产 A.R级 ,所有试剂
均用无离子水配制 。
1.3　方法
1.3.1　蛋白质浓度测定　按改良Lowry 氏法进行[ 3]
1.3.2　蛋白酶活性测定 　酶活性单位规定:pH
8.0 、 37℃、30min ,催化酪蛋白产生 1μmol L 酪氨酸
所需的酶量为鹅绒藤蛋白酶的一个活性单位。
1.3.3　鹅绒藤蛋白酶的提取 、纯化
1.3.3.1　硫酸铵分段沉淀　取-40℃冻存的鹅绒
藤茎乳汁 ,离心收集上清液 50ml ,加固体硫酸铵至
85℅饱和度 ,静置。离心 ,弃上清。
1.3.3.2 　SephadexG-25 凝胶过滤 　用 PBS(pH
7.15 , 0.005 mol L)溶解沉淀至约 35ml ,4℃对同一
缓冲液透析 。浓缩至体积约为 15ml , 冰冻干燥 。
干燥后的样品用PBS(pH7.15 , 0.005 mol L)溶解上
Sephadex G-25柱(ф2.6 cm×80cm),以含NaCl 0.15
mol L 的 PBS洗脱 ,流速40 ml h。
1.3.3.3　离子交换层析　收集 SephadexG-25凝胶
过滤后活性峰 , 透析 、浓缩后上预先用 pH 8.6 ,
0.005 mol L PBS 平衡的 DEAE 纤维素 DE-32 柱
102
收稿日期:2002-10-23
作者简介:杨怡(1973-),女(回族),甘肃 ,讲师 ,兰州医学院硕士研究生 ,主要研究方向为蛋白质与酶 ,为论文第一联系人.联系地址:
宁夏银川胜利南街 75号 ,宁夏医学院生化教研室。邮编:750004。
(ф1.2cm×34cm)。平衡液洗脱 2个柱体积后进行
0 ～ 0.6 mol L NaCl梯度洗脱 ,得 2个活性峰。收集
高活性峰峰 2 ,透析 、浓缩 , 用同样方法再次进行
DEAE-纤维素 DE-32层析 ,得单一活性峰 ,透析 、浓
缩 、冻干保存。
1.3.4　分子质量测定　用常规PAGE和SDS-PAGE[ 4] 。
1.3.5　等电点测定　用常规等电聚焦 PAGE[ 5] 。
1.3.6　酶动力学测定 　用常规方法测定最适温
度 ,最适 pH ,激动剂 ,抑制剂 ,Km[ 6] 。
1.3.7　蛋白酶水解特异性位点的初步确定　以纯
化后的蛋白酶水解五肽胃泌素 ,取水解液做纸层析 ,
与标准氨基酸的迁移率(Rf)比较判断水解片段的组
成 ,无标准对应的片段经处理后进行 DABITC PITC
法[ 7] 测序进一步确定待测片段的氨基酸顺序。
2　结　果
2.1　鹅绒藤蛋白酶的提取 、纯化
结果见表 1 ,产率 26.32%;纯化倍数 199.74。
Tab 1　Purification of Proteinase from Cynachum chinese R.Br.Latex
Procedure Total vol.(ml) Protein conc.(mg ml)
Activity
(u ml)
Specific activity
(u mg pro)
Total activity
(u)
Yield
(%)
Purification
(folds)
Supernatant from Cynanchum
chinese R.Br.latex 50 4.78 32.6 6.820 1630
(NH4)2SO4 fractionation
with 85% saturation 35 2.47 42.3 17.13 1480.5 90.8 2.51
Gel filtration on Sephadex
G-25peak I 30 0.50 26.6 53.2 798 49 7.80
Ion-exchange chromatography
on DE-32 of peak I
from Sephadex G-25
50 0.01 8.73 873 436.5 26.8 128
Re-chromatography
of peak I
35 0.009 12.26 1362.2 429.1 26.33 199.74
　
2.2　分子质量测定
结果见图 1
Lane 1～ 3 Protein Std., Lane 4～ 8 Proteinase
Fig 1　Subunit molecular weight determination by SDS-PAGE
　　SDS-PAGE得到单一条带 ,说明此酶为单亚基
蛋白酶 。结合 PAGE结果 ,由低分子质量标准蛋白
电泳迁移率的标准曲线 ,得此鹅绒藤蛋白酶的分子
质量为18ku。
2.3　等电点测定
结果见图 2(A 、B)。由图 2A (pH 梯度标准曲
线)得该鹅绒藤蛋白酶的 pI为 6.7。
2.4　酶动力学测定　
以酪蛋白为底物 ,该酶的最适温度范围为 60
～ 80℃;最适 pH为 7.0;对Hb A -β链水解的 Km 值
为 1.59×10-6 mol L;碘代乙酸 、PMSF 对该酶活性
的抑制率分别为72%和20%,二硫苏糖醇(dithioth-
reitol , DTT)对该酶活性的保护率为 98.3%,提示为
巯基蛋白酶。
Fig 2A　pI determina-
tion of proteinase by
IEF pH gradient:3.5
～ 10
2.5　蛋白酶水解特异性位置
的初步确定
已知五肽胃泌素的氨基酸
顺 序 为 Boc-β-Ala-Trp-Met-Asp-
Phe-NH2 。以纯化后的鹅绒藤蛋
白酶水解五肽胃泌素 ,水解液纸
层析的结果表明 ,该蛋白酶将五
肽胃泌素水解为 4 个片段。片
段1的 Rf 值与 Asp相同;片段 2
的 Rf值与 β-Ala相同;片段 3的
Rf值与Phe 相同;片段 4无相应
标准氨基酸。DABITC PITC 双偶
合法测序结果表明片段 4的氨
基酸顺序为Trp-Met。
103杨怡等:鹅绒藤蛋白酶的提纯与性质研究
Fig 2B　Standard　curve　of　pH
根据以上结果推定其酶切位点为:
Boc—β—Ala —←Trp—Met —←Asp —←phe—NH2
3　讨　论
本实验从鹅绒藤乳汁中提取的这种蛋白酶 ,已
纯化至 SDS-PAGE 、IEF 均一 。酶活性的激活和抑
制实验表明该酶为巯基蛋白酶 ,这与目前的已知大
部分植物蛋白酶属巯基蛋白酶的规律相符 。有关
温度对此酶活性的影响实验表明 ,该酶在 40 ～
80℃范围内均有较高活性 ,在 90℃时仍保留有一
定活性 ,说明此酶有较好的耐热性。同时 ,在底物
特异性实验中发现该酶对天冬氨酸残基后的肽键
有特异水解作用 ,结合它的巯基蛋白酶性质可初步
推断该蛋白酶是一种胱天蛋白酶(caspase)。胱天
蛋白酶是一个对天冬氨酸有特异酶切位点的蛋白
酶家族 ,现已知该家族在动物的细胞凋亡中扮演中
心角色(9),而这种蛋白酶在植物体内是否也有同
样作用 ,以及乳汁的药理学作用是否与该种蛋白酶
有直接关系 ,尚待进一步的研究证实。鹅绒藤蛋白
酶具有取材容易 ,分离提取简便 ,活性强 ,耐热性
好 ,性质稳定等特点 ,作为一种新蛋白酶制剂在医
药 、工业领域具有一定的开发价值 。
参 考 文 献
[ 1] 　马毓泉主编 ,内蒙古植物志 [ M] .呼和浩特:内蒙古人民出
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[ 3] 　张龙翔 ,张庭芳 ,李令媛.生化实验方法和技术[ M] .北京:
高等教育出版社 , 1997 , 137.
[ 4] 　郭尧君.蛋白质电泳实验技术[ M] .北京:科学出版社 , 1999 ,
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[ 5] 　汪家政 , 范明.蛋白质技术手册 [ M] .北京:科学出版社 ,
2000 ,124.
[ 6] 　李建武 ,萧能庚 ,余瑞元 ,等.生物化学实验原理和方法[ M] .
北京:北京大学出版社 , 1994 , 327.
[ 7] 　张龙翔 , 张庭芳 ,李令媛.生物化学实验方法和技术[ M] .北
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[ 8] 　吴振洁.鹅绒藤属植物的化学成分和药理学作用[ J] .国外医
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[ 9] 　Cryns V , Yuan J.Protease to die for [ J] .Genes and development ,
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Purification and Properties of a Proteinase from Cynanchum Chinese R.
Br.
YANG Yi , SU Hai-xiang ,YAO Kan
(Department of Biochemistry and Molecular Biology , Lanzhou Medical College , lanzhou , 730000)
Abstract　To isolate and purify a proteinase from Cynanchum chinese R.Br.latex , the latex was purified by gel fil-
tration and chromatography on DEAE-cellulose DE-32.Results showed that the proteinase was a monomeric protein
with an approximate molecular mass of 18ku.The isoelectric point was 6.7 , optimum temperature range and pH were
60 ～ 80℃ and 7.0 , respectively.The enzyme activity was inhibited by iodoacetate ,protected by DTT.Mapping of the
specificity sites of proteinase indicated that the enzyme has broad substrate specificity.The proteinase is a cysteinase
with strong activity.
Key words　Proteinase ,Cynanchum Chinese RBr.
104 药 物 生 物 技 术 第 10 卷第 2期