全 文 ：第 23卷第 2期No.2Vol.23 内江师范学院学报JOURNALOFNEIJIANGNORMALUNIVERSITY
北野豌豆及其近缘种 ISSR反应条件的优化
韩　　　颖＊
(西南科技大学 生命科学与工程学院 , 　四川　绵阳　621010)
　　摘　要:采用改进的 CTAB法 ,成功地提取了北野豌豆及其近缘种的基因组 DNA, 电泳结果显示 DNA质量和
产量均较高 , 并以此DNA为模板 , 对 ISSR的反应条件进行了优化 ,最终确定 ISSR的反应体系为:总体积 10μl,包括
10ng的 DNA, 1倍的反应缓冲液 , 1.5mmol· L-1MgCl2 , 2×10-4mmol· L-1(引物 6和引物 8)或 2×10-3mmol· L-1
(引物 5, 10和 12)引物 , 0.2mmol· L-1dNTP混合物和 1.0U的 TaqDNA聚合酶.ISSR扩增程序为:先在 94℃下变
性 3min,然后在 92℃下变性 30s, 50℃(引物 5, 6, 10, 12)或 55.2℃(引物 8)下复性 30s, 72℃下延伸 1min,反应 30个
循环 ,最后 72℃延伸 5min.并基于此反应条件 , 最终筛选出 5条 ISSR引物用于进一步的研究.
关键词:北野豌豆;简单序列重复问题;反应体系
中图分类号:Q949;Q751.9 文献标识码:A 文章编号:1671-1785(2008)02-0051-04
　　北野豌豆(ViciaramulifloraOhwi)隶属于豆科
(Fabaceae)野豌豆族(Trib.ViceiaeBronn.)野豌豆属
(ViciaLinn.)野豌豆组(Sect.Vicila).大多分布于东
亚.在中国 ,其分布于东北 、华北 、华东等地 ,是东亚
地区野豌豆属植物的主要分布区 ,但是有关的系统
学和进化学研究与其它地区相比十分落后 ,有鉴于
此 ,我们打算应用 ISSR(Inter-SimpleSequenceRe-
peats),分子标记技术 ,对该属开展进一步的研究 ,解
决一些分类学上模棱两可的问题并进一步探讨其四
倍体物种的进化机制.
ISSR即简单序列重复间区 ,是由 Zietkiewicz等
人提出的一种以 PCR为基础的分子标记技术.它是
对位于两个 3′端相对的典型的微卫星重复序列之间
并且处在可扩增距离内的一段 DNA片段的扩增.目
前常用的分子标记技术有 RAPDs, AFLP和 SSRs.他
们都有一定的缺点 ,如 RAPDs重复性较低 , AFLP高
成本 , SSRs需要知道侧翼序列 ,以开发种特异性的引
物.ISSR技术则克服了他们的局限性 [ 1-4] .本文对北
野豌豆及其近缘种的基因组 DNA的提取方法及 IS-
SR反应条件进行了优化 ,为一步开展相关的研究奠
定基础.
1　材料与方法
1.1　植物材料
植物材料采自东北地区 11个天然居群 ,每居群
随机选取 10 ～ 15株 ,每株保持 15 ～ 20m.详细的植
物材料信息见表 1.
1.2　基因组 DNA的提取
取约 300mg叶片 ,在液氮中用研钵迅速研磨成
粉末状 ,转入标记好的 1.5mlEppendorf管中;加入预
热的裂解缓冲液 [ 2% CTAB(Hexadecyltrimethylam-
moniumbromide), 1.42mol· L-1 NaCl, 20mmol· L-1
EDTA(pH8.0), 100mmol·L-1 Tris– HCl(pH8.0),
2%PVP-40, 0.1%抗坏血酸 , 0.1%二乙基二硫氨基
甲酸 , 0.2%巯基乙醇 ] 700μl,混匀.65℃水浴 30min,
每隔 5min取出轻轻混匀;加 700μl酚 /氯仿(1∶1),
混匀 , 13000rpm离心 15min;吸取 500 ～ 700μl上清到
一个新 Eppendorf管中 ,加 700μl酚 /氯仿 (1∶1),混
匀 , 13000rpm离心 8min;吸取 500 ～ 700μl上清到一
个新 Eppendorf管中 ,加入 50μl3mol· L-1醋酸钠和
800μl预冷的无水乙醇.4℃13000rpm离心 4min;弃
上清 , 加入 500μl1 ×TE;加 3 ～ 5μlRNase(10mg/
ml), 37℃下反应 30min;加 3 ～ 5μl蛋白酶 K(10mg/
ml), 37℃下反应 30min;加 700μl酚 /氯仿 , 混匀.
13000rpm离心 8min;吸取 500 ～ 700μl上清到一个新
Eppendorf管中 ,加入 50μl3mol· L-1醋酸钠和 800μl
预冷的无水乙醇.4℃13000rpm离心 4min;70%乙醇
漂洗 DNA沉淀 1次;50μl灭菌三蒸水或 1×TE溶
·51·
＊ 　收稿日期:2007-05-07
　基金项目:国家自然科学基金(30070060);国家教育部优秀青年教师基金(1692);西南科技大学人才引进基金(zk043081).
　作者简介:韩颖(1977-), 女 ,西南科技大学讲师 , 硕士研究生 ,主要从事植物分子生物学研究.
内江师范学院学报 第 23卷第 2期
解 , -20℃保存.
表 1　植物材料的名称 、采集地点及染色体数
Table1　Name, colectionsitesandchromosome
numberofplantsamples
种群 采集地点 染色体数
V.ramulifloraPop1 (S) 凤 凰 山(辽宁省) 2n=2x=12
Pop2(T) 千　　山(辽宁省) 2n=2x=12Pop3(P) 塔　　源(黑龙江省) 2n=2x=12Pop4 (B) 横道河子 (黑龙江省) 2n=2x=12Pop5 (H) 带　　岭(黑龙江省) 2n=2x=12Pop6 (N) 松 江 河 (吉林省) 2n=2x=12Pop7(M) 长 白 山(吉林省) 2n=4x=24
V.unijugaPop8(U) 凤 凰 山(辽宁省) 2n=4x=24Pop9(F) 帽 儿 山(黑龙江省) 2n=4x=4Pop10(Q) 加　　北(黑龙江省) 2n=2x=12V.craccaPop11C) 横道河子(黑龙江省) 2n=2x=12
1.3　DNA浓度和质量的估测
将提取的 DNA样品稀释 5倍 ,然后上样 ,以已
知浓度的 λDNA为参照 ,估测所提取 DNA的浓度和
质量.
1.4　ISSR扩增及扩增产物的检测
(1)于冰上调制反应混合液 ,一般加样顺序为灭
菌的三蒸水 、 10倍的反应缓冲液 、MgCL2、dNTP、引
物 、Taq酶;(2)将反应混合液混匀 ,分装到 PCR反应
管中;(3)加入 DNA,并设空白对照;(4)进行 PCR
反应;(5)用 0.5倍的 TBE配 1.2%琼脂糖凝胶 ,加
溴化乙锭(EB)1μg/ml;(6)PCR结束后 ,将样品置于
4℃冰箱中保存 10min,然后电泳(电压 3V/cm),一
般为 2 ～ 3h;(7)电泳结束后用凝胶成像系统 ,记录
并保存电泳结果.
2　结果分析与讨论
2.1　基因组 DNA的提取
DNA提取的质量往往是决定 ISSR分析成功与
否的关键 ,因此在进行正式扩增之前 ,获取高质量的
DNA是非常重要的.野豌豆植物材料本身就含有较
多的蛋白质 ,再加上采样地点多 ,绝大多数采集到的
叶片都较老 ,因此次生代谢产物积累也较多 ,这些都
给 DNA的提取工作造成了很大的麻烦 ,基于此我们
在 DNA提取缓冲液中还额外加入了 2%PVP-40,
0.1%抗坏血酸 , 0.1%二乙基二硫氨基甲酸和 0.2%
巯基乙醇 ,这些试剂的加入使得材料中的次生代谢
产物 、多酚和多糖等较容易被去除 ,另外由于蛋白质
含量较多 ,所以我们在提取过程中加入了蛋白酶 K
进行消化 ,并且增加抽提次数至 3 ～ 4次 ,经过这样
一系列处理 ,经电泳检测本试验所提取的 DNA的浓
度高 ,无 RNA和蛋白质残留 ,其浓度和质量符合 IS-
SR试验要求(见图 1).
图 1　基因组 DNA模板(稀释 5×)
Fig.1　TempleDNAdilutedby1∶5
2.2　ISSR稳定的试验体系的建立
ISSR—PCR是一个简单 、迅速 、有效的技术 ,它
的重复性很高 ,关于重复性的研究表明只有最弱的
条带是不可重复的 ,大约 92% ～ 95%被记录的条带
可以被重复 [ 5, 6] .本研究发现在获取到高质量的
DNA之后 ,比较容易建立稳定的 ISSR反应体系.事
实上 ISSR这项分子标记技术在最近 10年当中已经
被广泛地运用于生物学各个领域及各种植物材料当
中 ,例如 ISSR已经被成功地用于水稻[ 7] ,小麦 [ 8] ,豇
豆[ 9]等植物的遗传多样性评估 ,纵观这些年来国内
外不同学者的研究工作[ 10] ,可以发现针对不同植物
材料的 ISSR扩增体系中的主要组分如 MgCl2 ,
dNTP, Taq酶 ,模板的使用浓度变化不大 ,而引物的
浓 度 变 化 则 较 大 通 常 在
200nmol· L-1 ～ 2.5μmol· L-1之间变化 , 另外扩增
时退火温度的范围也有很大的变化 ,退火温度取决
于引物的 GC含量 ,通常在 45 ～ 65℃之间变化 [ 5, 6] .
有鉴于此 ,本研究主要对引物浓度和退火温度进行
了筛选.
2.2.1　物浓度的筛选
通过单因素多水平的考察 ,最终确定了最佳的
引物浓度为 2×10-3mmol· L-1(引物 5, 10, 12)(见
图 2)和 2×10-4mmol· L-1(引物 6, 8)(见图 3).
图 2　不同引物浓度的扩增结果(引物 2, 5, 10)
Fig.2　Theamplificationresultsusingdifferent
primerconcentration(primer2, 5and10)
·52·
2008年 2月 韩　颖:北野豌豆及其近缘种 ISSR反应条件的优化
图 3　引物 6不同浓度的扩增结果
Fig.3　Theamplificationresultsusingdifferent
primerconcentration(primer6)
2.2.2　退火温度的筛选
退火温度的筛选采用 PCR高级编程程序进行初
步的较大范围的筛选 ,之后又从中挑选几个较适宜
的温度 ,再次重复试验一次 ,最终确定一个最佳退火
温度 ,即引物 5, 6, 10 , 12的退火温度为 50℃,而引物
8的退火温度为 55.2℃(见图 4和图 5)最终筛选出
的 5条引物的核苷酸序列见表 2.
图 4　引物 8不同退火温度的扩增结果
Fig.4　Theamplificationresultsusingdifferent
annealingtemperatureforprimer8
表 2　筛选出的 ISSR引物的寡核苷酸序列
Table2　SequencesofoligonucleotideprimersusedforISSR
primer sequence
6 5′AGAGAGAGAGAGAGAGT3′
5 5′GACAGACAGACAGACA3′
10 5′GAGAGAGAGAGAGAGAT3′
8 5′ACACACACACACACACT3′
12 5′GAGAGAGAGAGAGAGAC3′
　　这 5条引物当中有 4条(引物 6, 8, 10, 12)为 2
核苷酸的重复序列 ,其中(GA)n序列占 2个 , (AG)n
和(AC)n各占 1个 ,且均是 3′端 1bp加锚 , 1条引物
(引物 5)为(GACA)n4核苷酸的重复序列 , 5′端和 3′
端均未加锚.通常 2核苷酸重复且 5′端或 3′端加锚
的引物扩增时多态性较高 [ 7, 8, 11] ,而且 3′端加锚的引
物比 5′端加锚的引物扩增的条带更加清晰 [ 8, 11, 12] .
图 5　引物 5, 6, 10, 12不同退火温度的扩增结果
Fig.5　Theamplificationresultsusingdifferent
annealingtemperatureforprimer5, 6, 10and12
总的来说具有(AG), (GA), (CT), (TC), (AC)和
(CA)重复的引物比其他的 2核苷酸 , 3核苷酸和 4
核苷酸重复的引物显现出更高的多态性.尽管(AT)
重复在植物基因组中分布最广泛 ,但是基于(AT)重
复的引物会发生自身退火 ,导致不能扩增.
2.2.3　影响 ISSR稳定试验体系建立的其他因
素
PCR反应非常灵敏 ,因此获得一个好的扩增结
果不仅与反应体系和扩增程序有关 ,试剂的质量和
PCR仪的质量 ,甚至 PCR反应管的质量均会影响到
最终的扩增结果.基于此 ,本研究建议采购 PCR的试
剂要选择好的生产商 ,本研究所购试剂均来自宝生
物(引物在北京赛百盛购买),扩增在英国生产的
HYBAIDPCR仪上进行.
3　结论
经过以上的试验我们最终确定的适合于北野豌
豆及其近缘种的基因组 DNA提取方法为改良的
CTAB法 ,即在裂解缓冲液中额外加入 2% PVP-
40, 0.1%抗坏血酸 , 0.1%二乙基二硫氨基甲酸和 0.
2%巯基乙醇.ISSR反应体系为:总体积 10μl,包括
10ng的 DNA, 1倍的反应缓冲液 , 1.5mmol· L-1
MgCl2 , 2×10-4mmol· L-1(引物 6和引物 8)或 2×
10
-3mmol· L-1(引物 5, 10和 12)引物 , 0.2mmol·
L-1dNTP混合物和 1.0U的 TaqDNA聚合酶.ISSR
扩增程序为:先在 94℃下变性 3min,然后在 92℃下
变性 30s, 50℃(引物 5, 6, 10, 12)或 55.2℃(引物 8)
下复性 30s, 72℃下延伸 1min,反应 30个循环 ,最后
72℃延伸 5min.筛选出的 5条 ISSR引物所扩增的条
带清晰 ,且多态性较好.
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OptimizationofISSRReactionConditionforViciaramuliflora
OhwiandItsCloseSpecies
HANYing
(ColegeofLifeScienceandEngineering, SouthwestUniversityofScienceandTechnology, Mianyang, Sichuan621010, China)
　　Abstract:ThegenomicDNAofVicia.ramulifloraOhwianditsclosespeciesweresuccessfulyextractedwithimprovedCTAB
methodandelectrophoresisindicatedthatthequalityandconcentrationofextractedDNAwereveryhigh.Afterthat, weoptimizedISSR
reactionconditionwithextractedDNAastemplate.TheoptimalISSRsystemwasasfolows:10μlreactionscontaining:10ngofplantge-
nomicDNA, 1×bufer(TaKaRaDalian), 1.5mmol· L-1 ofMgCl
2
(TaKaRaDalian), 0.2mmol· L-1 ofeachdNTP(TaKaRaDalian),
2×10-4mmol· L-1(primer6 and8)or2×10-3mmol· L-1(primer5, 10 and12)ofprimer, and1.0 unitofTaqDNAPolymerase
(promegaShanghai).AmplificationwasachievedinaHYBAIDthermalcyclerprogrammedfor1 cycleof3minat94℃ followedby30
cycleswiththefollowingtemperatureprofile:92℃for30 s, 50℃or55.2℃(primer8)for30sand72℃for1 minfolowedbyafinal
extensionat72℃ for5 min.Finally, fiveISSRprimerswhichgaveclearpolymorphicbandswereselectedforfurtherstudies.
　　Keywords:ViciaramulifloraOhwi;ISSR;reactionsystem
(责任编辑:胡　蓉)
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