全 文 ：第 24卷　第 2期　　　　
2009年 6月　　　　　　
　　　西　南　科　技　大　学　学　报　　　
JournalofSouthwestUniversityofScienceandTechnology
　　　Vol.24No.2
　　　　　June2009
　收稿日期:2009-02-23
　基金项目:西南科技大学人才引进基金(zk043081)。
　作者简介:韩颖(1977-),女 ,硕士 ,主要从事植物分子生物学研究。 E-mail:hanying197755@yahoo.com.cn。
北野豌豆及其近缘种基因组 DNA的提取和
RAPD稳定的反应体系的建立
韩　颖
(西南科技大学生命科学与工程学院　四川绵阳　621010)
摘要:采用改进的 CTAB法 ,成功提取了北野豌豆及其近缘种的基因组 DNA,电泳结果显示 DNA质量和产量均较
高 , 并以此 DNA为模板 ,成功建立了 RAPD稳定的反应体系:总体积 10 μL, 包括 10ng的 DNA, 1×的反应缓冲液 ,
1.5mmol· L-1 MgCl2 , 0.2 μmol· L-1引物 , 0.2 mmol· L-1 dNTP混合物和 1.0 U的 TaqDNA聚合酶。 RAPD扩增
程序为:先在 92 ℃下变性 3min,然后在 92℃下变性 1 min、40℃下复性 1 min、 72 ℃下延伸 2min反应 45个循环 ,
最后 72 ℃延伸 10min。
关键词:北野豌豆　RAPD　反应体系
中图分类号:Q949.751.9;Q78　　文献标识码:A　　文章编号:1671-8755(2009)02-0074-04
GenomicDNAExtractionandSetingupofReproducibleRAPD
ReactionSystemforV.ramulifloraandItsCloseSpecies
HANYing
(SchoolofLifeScienceandEngineering, SouthwestUniversityofScienceandTechnology,
Mianyang621010 , Sichuan, China)
Abstract:ThegenomicDNAofV.ramulifloraanditsclosespeciesweresuccessfulyextractedwithim-
provedCTABmethodandelectrophoresisindicatedthatthequalityandconcentrationofextractedDNA
wereveryhigh.Afterthat, wesuccessfulysetupreproducibleRAPDreactionsystemwithextractedDNA
astemplate.RAPDswereperformedinvolumesof10μL, containing10ngofDNA, 1×reactionbufer
(TaKaRaDalian), 1.5 mMMgCl2(TaKaRaDalian), 0.2 μMprimer(SBSBeijing), 0.2 mMmixture
ofdNTPs(TaKaRaDalian)and1.0 unitTaqDNAPolymerase(promegaShanghai).Thethermalcycler
(HYBAID)wasprogrammedfor1cycleof3minat92℃folowedby45cyclesof1minat92℃, 1min
at40℃ and2minat72℃, andfinalyby1 cycleof10minat72 ℃.
Keywords:V.ramuliflora;RAPD;Reactionsystem
北野豌豆(ViciaramulifloraOhwi,异名有贝加尔野豌豆 V.baicalensis,弯折野豌豆 V.deflexa和无萼齿野
豌豆 V.edentata)隶属于豆科 (Fabaceae)野豌豆族(Trib.ViceiaeBronn.)野豌豆属(ViciaLinn.)野豌豆组
(Sect.Vicila)。多年生草本 ,为欧亚大陆分布的林地植物 ,大多分布于东亚。在中国 ,其分布于东北 、华北 、
华东等地。生于海拔 700 ～ 2000m亚高山草甸 、混交林下 、林缘草地及山坡。日本 、俄罗斯西伯利亚及远东
亦有分布。
RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA)是 1990年 Wilianms等建立起来的一种分子标记技术 ,在过
去的十几年当中 ,这一技术被广泛应用于各个研究领域 , Clark等 [ 1]许多学者认为在 PCR反应基本组分稳定
的情况下 ,模板 DNA的质量和纯度差异是造成 RAPD不稳定的主要原因 ,因此进行 RAPD分析之前 ,首先就
要摸索出合适的 DNA提取方法 ,以获取高质量的待扩增模板。北野豌豆植物本身含有较多的蛋白质 、多糖 、
多酚和次生代谢产物 ,这些特性为 DNA提取带来了一定的麻烦 。本研究通过摸索最终确定了适合北野豌豆
的 DNA提取方法 —改良的 CTAB法 ,该方法所提取的 DNA不仅浓度高 ,且较一致 ,而且无降解 ,无蛋白质和
RNA残留 ,是理想的扩增模板 。同时 ,我们对引物浓度和退火温度进行了摸索 ,确定了最佳的引物浓度和退
火温度 。经过 RAPD稳定性检测试验 ,最终成功地建立了适合于野豌豆植物的稳定的反应体系 。
1　材料与方法
1.1　植物材料
植物材料采自东北地区 21个天然居群 ,每居群随机选取 10 ～ 15株 ,每株保持 15 ～ 20 m。
1.2　仪器与试剂
1.2.1　仪器
TGL-16G台式高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂), AmpGeneR凝胶成像分析系统(美国), HY-
BAIDPCR扩增仪(英国), DYY-II电泳系统(北京六一仪器厂), 721A型分光光度计(厦门分析仪器厂),
DYM-Ⅱ -S20L电脑压力蒸汽灭菌器(沈阳盛达), HANGPINGJA2003电子天平(上海天平仪器厂), PHS-
3C型酸度计(萧山市鑫龙医疗仪器有限公司),微量移液器(德国 eppendorf), 78-1型磁力加热搅拌器(国
华仪器厂)。
1.2.2　试剂
4种脱氧核苷酸(dNTP)(购自 TaKaRa)、TaqDNA聚合酶(购自上海 promega)、琼脂糖(购自 Spanish)、
DNAMarkerDL2000(购自 TaKaRa)、CTAB(购自 Sigama)、PVP-40(购自 Sigama)、巯基乙醇(购自 Sigama)、
抗坏血酸(购自 Sigama)、二乙基二硫氨基甲酸(购自 Sigama)、蛋白酶 K(购自 merck)、RNaseA(购自
Roche)、随机引物(购自北京赛百盛)。
1.3　基因组 DNA的提取
1.3.1　改良的 CTAB法
参照 JosephSambrook等的方法 [ 2]并作适当改良 ,进行基因组 DNA的提取 。具体方法如下:取约 300mg
叶片 ,在液氮中用研钵迅速研磨成粉末状 ,转入标记好的 1.5 mLEppendorf管中;加入预热的裂解缓冲液
[ 2% CTAB, 1.42mol· L-1 NaCl, 20 mmol· L-1 EDTA(pH8.0), 100 mmol· L-1 Tris-HCl(pH8.0), 2%
PVP-40, 0.1%抗坏血酸 , 0.1%二乙基二硫氨基甲酸 , 0.2%巯基乙醇 ] 700μL,混匀。 65℃水浴 30 min,
每隔 5 min取出轻轻混匀;加 700μL酚 /氯仿(1:1),混匀 , 13000rpm离心 15min;吸取 500 ～ 700 μL上清到
一个新 Eppendorf管中 ,加 700μLTris-饱和酚 /氯仿(1:1),混匀 , 13000rpm离心 8 min;吸取 500 ～ 700 μL
上清到一个新 Eppendorf管中 ,加入 50μL3 mol· L-1醋酸钠(pH5.2)and800 μL预冷的无水乙醇 , 4 ℃
13000 rpm离心 4min;弃上清 ,加入 500μL1×TE;加 3 ～ 5 μLRNaseA(10 mg/mL), 37℃, 30 min;加 3 ～
5 μLProteinaseK(10mg/mL), 37℃, 30 min;加 700μLTris-饱和酚 /氯仿 ,混匀。 13000 rpm离心 8min;吸
取 500 ～ 700μL上清到一个新 Eppendorf管中 ,加入 50μL3mol· L-1醋酸钠(pH5.2)和 800 μL预冷的无
水乙醇 , 4℃ 13000rpm离心 4min;70%乙醇漂洗 DNA沉淀一次;50μLdH2O或 1×TE溶解 , -20℃保存。
1.3.2　DNA浓度和质量的估测
将提取的 DNA样品稀释 5×,然后上样 ,以已知浓度的 λDNA为参照 ,估测所提取 DNA的浓度和质量。
1.4　RAPD扩增及扩增产物的检测
(1)于冰上调制反应混合液 ,一般加样顺序为 ddH2O、10×bufer、MgCl2、dNTP、 Primer、 Taq酶。(2)将
反应混合液混匀 ,分装到 PCR反应管中 。(3)加入 DNA,并设空白对照 。(4)进行 PCR反应。 (5)用 0.5 ×
TBE配 1.2%琼脂糖凝胶 ,加溴化乙锭 (EB)1 μg/mL。 (6)PCR结束后 ,将样品置于 4 ℃冰箱中保存 10
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min,然后电泳(电压 3 V/cm), 2 ～ 3 h。 (7)电泳结束后用凝胶成像系统记录并保存电泳结果。
2　结果与分析
2.1　基因组 DNA的提取结果与分析
DNA提取的质量往往是决定 RAPD分析成功与否的关键 ,因此在进行正式扩增之前 ,获取高质量的
DNA是非常重要的。目前国内外常用的 DNA提取方法有高盐缓冲液法(highsaltsbufer)、洗衣粉法(laun-
drydetergent)、CTAB法 、十二烷基肌氨酸钠法(Sarcosyl)、SDS法等 。各种方法各有优缺点 ,适合于不同的试
验材料 。本研究尝试了十二烷基肌氨酸钠法和 CTAB法 ,最终确定了适合野豌豆 DNA提取的方法即 CTAB
法 。野豌豆植物材料本身就含有较多的蛋白质 ,再加上采样地点多 ,绝大多数采集到的叶片都较老 ,因此次
生代谢产物积累也较多 ,这些都给 DNA的提取工作造成了很大的麻烦 ,基于此 ,我们在 DNA提取缓冲液中
还额外加入了 2%PVP-40, 0.1%抗坏血酸 , 0.1%二乙基二硫氨基甲酸和 0.2%巯基乙醇 ,这些试剂的加
入使得材料中的次生代谢产物 、多酚和多糖等较容易被去除。另外 ,由于蛋白质含量较多 ,所以在提取过程
中加入了蛋白酶 K进行消化 ,并且增加抽提次数至 3 ～ 4次 ,经过这样一系列处理 ,经电泳检测本试验所提
取的 DNA的浓度高 ,无 RNA和蛋白质残留 ,其浓度和质量符合 RAPD试验要求(见图 1)。
2.2　RAPD稳定的试验体系的建立
RAPD操作简单 、成本低 、检测快速 ,在生物学的许多领域都已
得到广泛应用 ,但此技术也有不足之处 ,即反应灵敏 ,因此在进行正
式试验之前 ,建立一个稳定的统一的试验体系至关重要 。本研究发
现在获取到高质量的 DNA之后 ,比较容易建立稳定的 RAPD反应
体系 。
事实上 RAPD这项分子标记技术在最近 10几年已经被广泛地
运用于生物学各个领域及各种植物材料当中 ,纵观这些年来国内外
不同学者的研究工作 [ 3-7] ,可以发现针对不同植物材料的 RAPD扩增体系中的主要组分的使用浓度变化不
大 ,如 MgCl2的使用浓度通常在 1.5 ～ 2.0 mmol· L-1 , dNTP的使用浓度通常在 150 ～ 200 μmol·L-1 , Taq
酶的使用浓度通常在 0.5 ～ 1 U,模板的使用浓度通常为 1ng· μL-1 ,而引物的浓度变化则较大 ,通常在 200
nmol· L-1 ～ 2 μmol·L-1之间变化 ,而且随着这项技术在国内外的广泛开展 ,很多植物材料均已经开展过相
关的工作。本研究在参考 Potokina, E., etal[ 8]和 Gustafsson, L., etal.[ 9]等在对 Viciasativaagg.和 Vicia
pisiformis这两种野豌豆的 RAPD研究的基础之上 ,对引物浓度和退火温度进行了筛选 ,其中引物浓度设置了
5个水平 , 最终在 200 nmol· L-1和 100 nmol· L-1这两个较好的浓度中 , 确定最佳的引物浓度为
200nmol· L-1(见图 2)。退火温度的筛选采用 PCR的高级编程程序进行初步的较大范围的筛选 ,之后又从
中挑选两个较适宜的温度 40 ℃和 45℃,再次重复试验一次 ,最终确定二者中扩增效果更好的一个即 40 ℃
(见图 3)。
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　　PCR反应非常灵敏 ,很多学者认为 RAPD扩增结果较不稳
定 ,本研究也对本反应体系的稳定性进行了初步的监测 ,监测结
果显示本反应体系的稳定性很好(见图 4)。
3　结语
经过以上的试验我们最终确定的适合于北野豌豆及其近缘
种的 RAPD反应体系为:总体积 10μL, 包括 10ng的 DNA, 1×
的反应缓冲液 , 1.5 mmol·L-1 MgCl2 , 0.2 μmol· L-1引物 , 0.2
mmol·L-1 dNTP混合物和 1.0U的 TaqDNA聚合酶 。RAPD扩
增程序为:先在 92 ℃下变性 3 min,然后在 92下变性 1 min、40
℃下复性 1min、72℃下延伸 2min反应 45个循环 ,最后 72 ℃延伸 10 min。
参考文献
[ 1] 　Clark, M.S.PlantMolecularBiology—aLaboratoryManual[ M] .Berlin:Springer-Verlag, 1997.242.
[ 2] 　Sambrook, JosepH., DavidW.Bussell.MolecularCloning:ALaboratoryManual[ M] .ColdSpingHarberLaboratoryPress,
2001.898 ～ 915.
[ 3] 　VanHeusden, A.W., K.Bachmann.GenotypeRelationshipsinMicroserisElegans(Asteraceae, Lactuceae)Revealedby
DNAAmplificationfromArbitraryPrimers(RAPDs)[ J] .PlantSystematicsandEvolution, 1992, 179:221 ～ 233.
[ 4] 　Mattioni, C., M.Casasoli, M.Gonzalez, etal.ComparisonofISSRandRAPDMarkerstoCharacterizeThreeChilean
NothofagusSpecies[ J] .TheorApplGenet, 2002, 104:1064 ～ 1070.
[ 5] 　Gimenes, M.A., C.R.Lopes, M.L.Galgaro, etal.GeneticVariationandPhylogeneticRelationshipsBasedonRAPDA-
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[ 6] 　Potokina, E., A.V.Duncan, E.E.Eggi, etal.PopulationDiversityoftheViciasativaagg.(Fabaceae)intheFloraof
theFormerUSSRDeducedfromRAPDandSeedProteinAnalyses[ J] .GeneticResourcesandCropEvolution, 2000, 47:171
～ 183.
[ 7] 　Iruela, M., J.Rubio, J.I.Cubero, etal.PhylogeneticAnalysisintheGenusCicerandCultivatedChickpeaUsingRAPDand
ISSRMarkers[ J] .Theor.Appl.Genet., 2002, 104:643 ～ 651.
[ 8] 　Potokina, E., N.Tomooka, D.A.Vaughan, etal.PhylogenyofViciasubgenusVicia(Fabaceae)BasedonAnalysisofRAP-
DsandRFLPofPCR-amplifiedChloroplastGenes[ J] .GeneticResourcesandCropEvolution, 1999, 46:149 ～ 161.
[ 9] 　Gustafsson, L., P.Gustafsson.LowGeneticVariationinSwedishPopulationsoftheRareSpeciesViciapisiformis(Fabaceae)
Revealedwithrflp(rDNA)andRAPD[ J] .PlantSystematicsandEvolution, 1994, 189:133 ～ 148.
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