全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 12 期 2015 年 6 月
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• 药材与资源 •
野豌豆属蒙药药用植物的 rDNA-ITS 序列分析
李 骁,赵 龙,王 佩,鞠爱华*
内蒙古医科大学药学院,内蒙古 呼和浩特 010110
摘 要:目的 比较研究野豌豆属中入蒙药的 8 种药用植物山野豌豆 Vicia amoena、北野豌豆 V. ramuliflora、广布野豌豆 V.
cracca、多茎野豌豆 V. multicaulis、黑龙江野豌豆 V. amurensis、东方野豌豆 V. japonica、大叶野豌豆 V. pseudorobus 和歪头菜
V. unijuga的 rDNA-ITS序列差异性及其规律,寻找 8种植物药之间的分子鉴别方法。方法 从野豌豆属蒙药材中提取总DNA,
用 PCR 法扩增 ITS,运用 Clustal X、MEGA 等软件比较和分析 ITS 的序列特征。结果 野豌豆属入蒙药的 8 种药用植物 ITS
序列长度为 598~611 bp,具变异位点 40 个,其中信息位点 33 个,特异性鉴别位点 29 个。序列已提交至 NCBI 数据库,登
录号为 JQ309787~JQ309794,KJ417905~KJ417931。其中 5 种野豌豆的 ITS 序列为国际首次获得,分别为黑龙江野豌豆
(JQ309789)、东方野豌豆(JQ309792)、多茎野豌豆(JQ309791)、大叶野豌豆(JQ309788)和北野豌豆(JQ309793)。
结论 ITS 序列对野豌豆属入蒙药的 8 种药用植物具有较好的分辨性,为野豌豆属蒙药药用植物分子鉴别提供了参考。
关键词:野豌豆属;蒙药;ITS 序列;山野豌豆;北野豌豆;广布野豌豆;多茎野豌豆;黑龙江野豌豆;东方野豌豆;大叶
野豌豆;歪头菜
中图分类号:R282.12 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2015)12 - 1814 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.12.020
rDNA-ITS Sequence analysis of traditional Mongolian medicinal plants in Vicia L.
LI Xiao, ZHAO Long, WANG Pei, JU Ai-hua
Department of Pharmacy, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China
Abstract: Objective To find the patterns of the rDNA ITS sequence variation of eight traditional Mongolian medicinal plants in Vicia
L. (including V. amoena, V. ramuliflora, V. cracca, V. multicaulis, V. amurensis, V. japonica, V. pseudorobus, and V. unijuga), and
establish the molecular biological method for the identification of the eight plants. Methods DNA was extracted from the dry leaves,
and the ITS gene fragments were PCR amplified and sequenced. The sequence features were compared and analyzed using Clustal X
and MEGA softwares. Results The length of ITS region varied from 598—611 bp with 40 variable sites, 33 parsimony information
sites, and 29 singleton sites among eight traditional mongolian medicinal plants in Vicia L. Sequences were submitted to NCBI
database with the registry numbers of JQ309787—JQ309794, KJ417905—KJ417931. And ITS sequences of five species among them
were first reported in the world, they were V. amurensis (JQ309789), V. japonica (JQ309792), V. multicaulis (JQ309791), V.
pseudorobus (JQ309788), and V. ramuliflora (JQ309793). Conclusion ITS sequences could be used to authenticate the eight species
in Vicia L. and also could provide a reference for molecular identification.
Key words: Vicia L.; traditional Mongolian medicinal plants; ITS sequence; Vicia amoena Fisch.; Vicia ramuliflora (Maxim.) Ohwi.;
Vicia cracca L.; Vicia multicaulis Ledeb ; Vicia amurensis Oett.; Vicia japonica A. Gray; Vicia pseudorobus Fisch. et C. A. Mey.; Vicia unijuga R. Br.
野豌豆属 Vicia L. 植物为一年、二年或多年生草
本,全世界约 200 种;我国有 43 种 5 变种,广布全
国各地[1];内蒙古地区有 16 种 3 变种[2]。本属植物山
野豌豆 Vicia amoena Fisch. 始载于蒙医药专著《蒙药
正典》[3],蒙药名萨日德玛,地上部分入药,味涩、
苦,性平、涩、轻、稀、和、锐,有利尿、消肿、愈
伤之功效,主要用于水肿、创伤。经本草考证[2-7],与
其同等入药的本属植物还有广布野豌豆 V. cracca L.、
多茎野豌豆 V. multicaulis Ledeb、大叶野豌豆 V.
pseudorobus Fisch. et C. A. Mey.、北野豌豆 V.
ramuliflora (Maxim.) Ohwi. 、黑龙江野豌豆 V.
amurensis Oett.、东方野豌豆V. japonica A. Gray 和歪头
收稿日期:2015-02-02
基金项目:内蒙古科技厅科技计划项目(20080502);内蒙古医科大学科技百万工程项目(kjbw2012009)
作者简介:李 骁(1978—),男,内蒙古呼和浩特人,副教授,主要研究方向为中蒙药材鉴定及药用植物亲缘学。
*通信作者 鞠爱华(1955—),女,教授。Tel: (0471)6653132 E-mail: lx_leexiao@163.com
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菜 V. unijuga R. Br.。其中在东北歪头菜与山野豌豆、
黑龙江野豌豆、大叶野豌豆作为“透骨草”入药[8],
其中歪头菜能解热、利尿、理气、止痛,主治头晕、
浮肿、胃痛,外用治疔毒,功能主治与山野豌豆又有
区别。以上 8 种野豌豆亲缘关系相近,原植物形态、
药材性状及显微特征方面极为相似,故为了临床用药
准确,对其从分子水平上进行分类鉴别尤为重要。
DNA 分子标记技术用于中药材鉴定和品质评
价等方面的研究已有很多报道,关于植物核糖体
DNA 中的内转录间隔区(ITS)序列测定已广泛用
于中药材近缘属间、属内以及种内居群间的差异性
研究[9-10]。韩颖[11]对北野豌豆的基因组 DNA 提取方
法进行了研究,并对不同居群的北野豌豆进行了
RAPD 分析和 ISSR 分析[12]。但将 ITS 序列用于野
豌豆属上述 8 种药用植物的鉴别,尚未见这方面的
报道。本研究测定 8 种野豌豆属药用植物 rDNA ITS
序列,进行序列分析,通过构建系统发育树对 8 种
药用植物进行鉴定,为野豌豆属蒙药药用植物鉴定
及分子系统生物学研究提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料
于2009—2011年药材采收期采集8种野豌豆属
植物全草,置于阴凉通风干燥处储存,本实验采用
干燥药材叶片进行 DNA 提取。8 种原植物均经笔者
鉴定,凭证标本保存于内蒙古医科大学药学院药用
植物标本室,材料来源见表 1。
表 1 供试样品来源
Table 1 Source of materials
名称 凭证标本 采集地点 采集时间 NCBI 注册登记号
山野豌豆 SY20090713 呼伦贝尔市大青山避暑山庄 2009-07-13 JQ309794, KJ417905
SY20100705 呼伦贝尔市大青山避暑山庄 2010-07-05 KJ417906, KJ417907
北野豌豆 B20100818 呼伦贝尔市大兴安岭 2010-08-18 JQ309793, KJ417928, KJ417929
B20110819 呼伦贝尔市大兴安岭 2011-08-19 KJ417930, KJ417931
广布野豌豆 GB20100719 吉林省安图县长白山 2010-07-15 JQ309787, KJ417908, KJ417909
GB20100730 辽宁省丹东市凤凰山 2010-08-09 KJ417910, KJ417911
多茎野豌豆 DJ20090828 凉城县蛮汉山 2009-08-28 JQ309791, KJ417912, KJ417913
DJ20100809 凉城县蛮汉山 2010-08-09 KJ417914, KJ417915
黑龙江野豌豆 HLJ20100719 吉林省安图县长白山 2010-07-27 JQ309789, KJ417925
HLJ20100726 辽宁省鞍山市千山 2010-07-30 KJ417926, KJ417927
东方野豌豆 DF20100820 呼伦贝尔市大兴安岭 2010-08-20 JQ309792, KJ417920, KJ417921
DF20110822 呼伦贝尔市大兴安岭 2011-08-22 KJ417922, KJ417923
大叶野豌豆 DY20090828 凉城县蛮汉山 2009-08-28 JQ309788
DY20100809 凉城县蛮汉山 2010-08-09 KJ417924
歪头菜 WTC20090717 呼和浩特市小井沟 2009-07-17 JQ309790, KJ417916, KJ417917
WTC20100707 和林县南天门林场 2010-07-07 KJ417918, KJ417919
1.2 总 DNA 提取、纯化
采用改良 CTAB 法[13]进行药材 DNA 提取,并
做适当改进。产物于−20 ℃保存备用。
1.3 ITS 序列的扩增、纯化、测序
以提取的 DNA 为模板,ITS 的扩增引物参照陈
晓颖等 [14]和 Takaiwa 等 [15]的引物设计,ITS1:
5’-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’;
ITS4:5’-TTCTCCGCTTATTGATATGC-3’(均由大
连宝生物公司合成)。PCR 扩增体系总体积为 20
μL,包括 10×缓冲液 2 μL,10 mmol/L dNTP 0.5 μL,
10 μmol/L 正向引物和逆向引物各 1 μL,Taq 聚合酶
(5 U/μL)0.1 μL,DNA 模板(适宜浓度)2 μL,灭
菌三蒸水(3dH2O)13.4 μL。PCR 扩增 ITS 序列的
程序为 94 ℃预变性 4 min,94 ℃、1 min,50 ℃、2
min,72 ℃、2 min,循环 36 次,最后 72 ℃延伸 10
min。同时以 3dH2O 代替模板 DNA 作空白对照。扩
增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
将扩增的目的 ITS 序列进行琼脂糖凝胶电泳,
通过 DNA 胶回收试剂盒(北京康为世纪公司)对
凝胶目的条带进行回收纯化,将回收纯化产物送上
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海英俊公司直接测序,所有序列均进行双向测序。
1.4 数据处理
将测得的序列用CLC Sequence Viewer 6.3软件
反向互补、对位排序、手工校正,并将序列提交
NCBI 中 GeneBank 数据库。用 Clustal X1.8 软件[16]
进行 DNA 序列比对(alignment)。用 MEGA 6.06
分别计算各样品 ITS 序列的差异性,以 Kimura-2-
Parameter(K2P)双参数模型计算遗传距离[17-18],
分别采用 Neighbor Joining、Maximum Likelihood、
Minimun Evolution 和 UPGMA 法构建系统发育树,
并以 bootstrap 作 2000 次可信度分析。
2 结果
2.1 ITS 序列特点
所测 8 种野豌豆属蒙药药用植物 ITS 序列的
GeneBank 序列注册登记号见表 1。其中 5 种野豌豆
的 ITS 序列为国际首次获得,分别为黑龙江野豌豆、
东方野豌豆、多茎野豌豆、大叶野豌豆和北野豌豆,
首次获得序列的登录号分别为 JQ309789 、
JQ309792、JQ309791、JQ309788、JQ309793。依据
基因库中野豌豆属已报道的广布野豌豆序列资料
(GeneBank DQ312197)[19],确定 rDNA 内转录区
ITS1 和 ITS2 与 3 个编码区 18 S、5.8 S、26 S 的界
限。8 种蒙药药用植物 ITS 序列长度为 598~611 bp,
包括 40 个变异位点,其中信息位点 33 个,特异性
鉴别位点 29 个,GC 量为 49%~51%。该片段包括
ITS1、5.8 S 和 ITS2,其中 ITS1 长度为 235~238 bp,
GC 量为 52%~54%;ITS2 长度为 196~210 bp,
GC 量为 46%~48%;ITS1序列长于 ITS2 序列。ITS1
序列中 GC 量高于 ITS 序列和 ITS2 序列中的 GC 量
(表 2)。
表 2 ITS 序列长度及其 G+C 量
Table 2 Lengths of ITS and contents of G + C
ITS ITS1 ITS2 品种 长度/bp (G+C)/% 长度/bp (G+C)/% 长度/bp (G+C)/%
山野豌豆 609 50~51 235~236 52 209~210 48
北野豌豆 608~611 50~51 235~238 53 209 48
广布野豌豆 598 49~50 238 52~53 196 46
多茎野豌豆 609 51 236 53 209 48
黑龙江野豌豆 609~610 50 237 53 209 47
东方野豌豆 609 51 236 54 209 48
大叶野豌豆 609 51 236 53~54 209 48
歪头菜 609 51 236 53~54 209 48
2.2 ITS 序列特异性鉴别位点
野豌豆属 8 种蒙药药用植物的 ITS 序列上共有
29 个特异性鉴别位点,样本较多且位点稳定,见表
3。如位点 17(T/A)可将北野豌豆与其他 7 种野豌
豆区分开,位点 111(A/G)、117(C/T)、119(T/C)
可将山野豌豆与其他野豌豆区分开,位点 50(A/G)、
56(A/G)、81(C/T)、101(A/G)、104(G/A)、
106(A/T)、123(G/A)、124(A/T)、147(C/T)、
165(A/T)、168(T/A)、184(A/T)、240(A/−/T)、
395(A/G)、439(T/G)、562(T/G)、578(T/C)、
595(T/C)可将广布野豌豆与其他野豌豆区分开,
位点 92(T/C)、474(C/T)可将多茎野豌豆与其他
野豌豆区分开,位点 240(A/−/T)、589(T/C)可
将黑龙江野豌豆与其他野豌豆区分开。位点 70
(C/A)、436(T/A)、472(G/T)可将东方野豌豆、
大叶野豌豆、歪头菜和其他野豌豆区分开,同时又
可将 3 种野豌豆相互区分开。所以说,29 个特异性
鉴别位点能够将 8 种野豌豆属药用植物进行区分。
2.3 ITS 序列系统发育树
构建系统发育树是物种鉴定的方法之一。构建
系统发育树的目的不是为了研究物种间的系统进化
关系,而是为了检验每个物种的单系性,即同一物
种的不同个体能否紧密聚在一起[20]。对 8 种蒙药药
用植物的 ITS 序列分别用 Neighbor Joining、
Maximum Likelihood 、 Minimun Evolution 和
UPGMA 法构建系统发育树。其中广布野豌豆的 ITS
序列已有文献报道[19],因此本研究中将已报道的广
布野豌豆 ITS 序列(DQ312197)与本研究测得的所
有 ITS 序列共同构建系统发育树。通过分析发现 4
种分析方法均取得较为一致的结果(图 1)。从图 1
中可见,不同居群的 8 种蒙药药用植物均各自聚为
一类,分别聚成了 8 个组。通过构建系统发育树进
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表 3 野豌豆属蒙药药用植物的特异性鉴别位点
Table 3 ITS sequence singleton sites of eight plant in Vicia L.
位点 物种
17 50 56 70 81 92 101 104 106 107 111 117 119 123 124
山野豌豆 A G G A T C G A T A A C T A T
北野豌豆 T G G A T C G A T G G T C A T
广布野豌豆 A A A A C C A G A A G T C G A
多茎野豌豆 A G G A T T G A T G G T C A T
黑龙江野豌豆 A G G A T C G A T G G T C A T
东方野豌豆 A G G C T C G A T G G T C A T
大叶野豌豆 A G G C T C G A T G G T C A T
歪头菜 A G G C T C G A T G G T C A T
位点物种
147 165 168 184 240 395 436 439 472 474 562 578 589 595
山野豌豆 T T A T — G A G T T G C C C
北野豌豆 T T A T — G A G T T G C C C
广布野豌豆 C A T A T A A T T T T T C T
多茎野豌豆 T T A T — G A G T C G C C C
黑龙江野豌豆 T T A T A G A G T T G C T C
东方野豌豆 T T A T — G A G T T G C C C
大叶野豌豆 T T A T — G A G G T G C C C
歪头菜 T T A T — G T G G T G C C C
图 1 基于 ITS 序列的野豌豆属蒙药药用植物 NJ 系统树
Fig. 1 NJ phylogenetic tree from ITS of eight species in
Vicia L.
行聚类分析,可将 8 种蒙药药用植物进行鉴定区分。
3 讨论
近年来,分子标记技术和 DNA 特异片段分析
技术的迅猛发展及其广泛应用,为揭示药用植物的
遗传差异和鉴定中药材的真伪优劣提供了新的方法
和手段[21-24],其中核糖体 DNA(nrDNA)ITS 区(包
括 ITS1、5.8 S 和 ITS2)序列已被广泛用于植物属
内、近缘属间及同一物种不同居群间的系统发育分
析等。ITS 序列等分子标记直接根据生物 DNA 的多
态特征,通过序列比对分析得到相当稳定的信息位
点,结果更为客观和准确。通过序列比对与同源性
分析相结合,可以准确鉴定每一种药用植物。因此
建立合理的检测方案对于不同药材尤其是易混药材
的鉴别具有重要意义[25-26]。
本研究以野豌豆属入蒙药的 8 种药用植物为材
料,运用 PCR 技术分离并测定了各自的 ITS 序列,
将其提交至 NCBI 数据库,登录号为 JQ309787~
JQ309794、KJ417905~KJ417931。其中 5 种野豌豆
的 ITS 序列为国际首次获得,分别为黑龙江野豌豆
(JQ309789)、东方野豌豆(JQ309792)、多茎野豌豆
(JQ309791)、大叶野豌豆(JQ309788)和北野豌豆
(JQ309793)。本研究中 8 种蒙药药用植物 ITS 序列
长度为 598~609 bp,包括 40 个变异位点,其中信
息位点 33 个,特异性鉴别位点 29 个,通过序列特
歪头菜(JQ309790)
歪头菜(KJ417919)
歪头菜(KJ417918)
歪头菜(KJ417916)
歪头菜(KJ417917)
大叶野豌豆(JQ309788)
大叶野豌豆(KJ417924)
东方野豌豆(JQ309792)
东方野豌豆(KJ417923)
东方野豌豆(KJ417920)
东方野豌豆(KJ417921)
东方野豌豆(KJ417922)
黑龙江野豌豆(JQ309789)
黑龙江野豌豆(KJ417927)
黑龙江野豌豆(KJ417926)
黑龙江野豌豆(KJ417925)
北野豌豆(KJ417928)
北野豌豆(KJ417930)
北野豌豆(KJ417931)
北野豌豆(JQ309793)
北野豌豆(KJ417929)
多茎野豌豆(KJ417914)
多茎野豌豆(JQ309791)
多茎野豌豆(KJ417912)
多茎野豌豆(KJ417913)
多茎野豌豆(KJ417915)
山野豌豆(JQ309794)
山野豌豆(KJ417907)
山野豌豆(KJ417905)
山野豌豆(KJ417906)
广布野豌豆(DQ312197)
广布野豌豆(JQ309787)
广布野豌豆(KJ417909)
广布野豌豆(KJ417910)
广布野豌豆(KJ417908)
广布野豌豆(KJ417911)
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征及同源性分析,ITS 序列具有丰富的特异性鉴别位
点,可作为 8 种蒙药药用植物之间鉴定的分子标记。
同时,通过基于 ITS 序列遗传距离计算而构建系统
发育树,野豌豆属 8 种药用植物不同居群的植物
rDNA-ITS 序列均能各自聚为一类,从而能将 8 种药
用植物进行鉴别区分。ITS 序列对野豌豆属 8 种药用
植物具有较好的分辨性,为野豌豆属蒙药药用植物
鉴别提供了有力的依据。
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