全 文 ：收稿日期:2006-04-03
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39825126)
作者简介:赵燕燕(1972-),女(汉族), 辽宁盖州人, 讲师 ,博士, 主要从事天然产物活性成分的研究与开发 , Tel.0535
-6706030-8019 , E-mail zhaoyy@luye-pharm.com;孙启时(1945-), 男(汉族),吉林松源人 , 教授 ,主要从事中药
资源开发与利用的研究 , Tel.024-23986468 , E-mail sunqishi@sina.com。
文章编号:1006-2858(2007)02-0109-04
洋紫荆中菲醌化合物 bauhinione对
K562细胞的增殖抑制作用
赵燕燕1 , 崔承彬2 , 孙启时3
(1.烟台大学 药学院 , 山东 烟台 264003;　2.军事医学科学院 毒物药物研究所 , 北京 100850;
3.沈阳药科大学 中药学院 , 辽宁 沈阳 110016)
摘要:目的探讨从洋紫荆中分离得到的新的菲醌化合物 bauhinione对体外培养的人类慢性骨髓性白
血病 K562 细胞的增殖抑制作用。方法应用罗丹明 B法检测 bauhinione对癌细胞 K562 和tsFT210的
抑制作用;采用形态学观察以及流式细胞术(FCM)检测该化合物对 K562 细胞的细胞周期抑制和诱
导凋亡作用;通过倍量稀释法考察该化合物的最小抑制质量浓度及其质量浓度为12.5 mg·L-1时的
时效关系。 结果 Bauhinione 对两种癌细胞的 IC50值分别为(24.9 ±2.1)mg·L-1和(111.36 ±
3.5)mg·L-1 ,说明 K562细胞对 bauhinione的作用敏感;Bauhinione对 K562 细胞的最小抑制质量浓
度为 6.25 mg·L-1;对 K562 细胞的增殖抑制作用是通过G2-M 期抑制和诱导凋亡实现的, 并与时间
呈依赖关系。结论 Bauhinione在体外有抑制 K562细胞增殖的作用 ,为洋紫荆的抗癌活性成分之一。
关键词:洋紫荆;bauhinione;K562 细胞;人类慢性骨髓性白血病细胞
中图分类号:R 96　　　文献标志码:A
　　洋紫荆(Bauhinia variegate L.)为豆科羊蹄甲
属植物 ,是云南思茅地区民间的一种药用植物。作
者用小鼠乳腺癌温敏型 tsFT210细胞株和 K562细
胞株 ,对采自云南的 56种民用抗癌植物的乙醇提
取物进行体外抗癌活性的初筛和复筛时发现 ,洋紫
荆在两种细胞株上都表现出较强的细胞周期抑制
活性 ,因此 ,采用活性追踪方法对该植物进行了系
统分离 ,从其氯仿层浸膏中分离得到 3个生物碱和
2个醌类化合物(bauhinione和大黄素甲醚)[ 1-2] ,并
对新化合物 bauhinione(结构见图 1)体外抑制 K562
细胞增殖的活性进行了考察。
Fig.1　Structure of bauhinione
1　仪器与材料
酶标仪(Spect ra Maxplus , Molecular Devices
Co., USA),TE-B定时微量震荡器(江苏姜汇仪
器厂),Epicx XL 流式细胞仪和 Wincycle 计算机
分析 软件(Coulter Co., Hialeah , FL , USA),
Biofuge 22R冷冻离心机(Heraeus Co.,Germen),
Biofuge f resco冷冻超速离心机(Heraeus Co.,Ger-
men), CK40 相差倒置显微镜(Olympus Co.,
Japan),二氧化碳培养箱(Sanyo Co., Japan)超净
工作台(Sanyo Co., Japan), 1100磁力搅拌器(英
国 Jenway Ltd),EASY pure RF 纯水机(Millipore
Co., USA),Autoclave SM 52高压灭菌锅(Yamato
Co., Japan)。
人类慢性骨髓性白血病 K562细胞株(日本
国立癌研究所惠赠 , -80 ℃低温冷冻保存 ,用时
复苏),小鼠乳腺癌温敏型 t sFT210细胞株(日本
理化学研究所抗生物质研究室长田裕之博士提
供)。
磺基罗丹明 B(SRB)、碘化丙啶(PI)(美国Sigma
公司),三羟甲基氨基甲烷(Tris-hydroxymethyl-
aminomethane ,美国Bio-Raid公司),胎牛血清(FBS ,
Cat.No.A-1602-L , Lot.No.STF721 ,美国 Hyclone
第 24 卷 第 2 期
2 0 0 7 年 2 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol.24 　 No.2
Feb.2007 p.109
DOI :10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2007.02.011
公司),PRMI-1640培养基(批号 31800-022 ,美国
Gibcobrl公司),乙基酚聚乙二醇醚(Nonidet P-40 ,
英国 Fluka公司),乙醇(体积分数为 95%,天津化学
试剂厂),无水甲醇(天津化学试剂厂)。
洋紫荆茎皮 ,采自云南勐腊地区 ,由沈阳药科
大学中药学院孙启时教 授鉴定为洋紫荆
(Bauhinia variegate L.)的茎皮。
2　方法与结果
2.1　细胞株培养
K562细胞株用含质量分数为 10%胎牛血清
的 RPM I -1640 培养基 ,在 37 ℃、体积分数为
5%的二氧化碳培养箱中培养 , 2 、3 d继代 1 次。
小鼠乳腺癌温敏型 t sFT210细胞株用相同的培养
基在 32 ℃、体积分数为 5%的二氧化碳培养箱中
培养 ,2 、3 d继代 1次 。
2.2　样品溶液的制备
将 bauhinione 用二甲基亚砜配成溶液 , 用
0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后作为储备液 ,试验
时用 RPM I 1640 培养液稀释成所需质量浓度。
以二甲基亚砜的 RPM I1640培养液做空白 ,以顺
铂(cis-diaminedichlo roplatinum , CDDP)为阳性
对照药 ,用二甲基亚砜水溶液(二甲基亚砜体积分
数<10%)配制成 10.0 g·L-1的溶液 ,现用现配 ,
按需要稀释给药。
2.3　磺基罗丹明 B(SRB)试验
按文献[ 3]方法 ,利用酶标仪于 520 nm 处检测 ,
得每孔溶液的吸光度(OD)值 ,求出抑制率 ,并计算
IC50值。Bauhinione 对两种癌细胞的 IC50值见表 1。
结果表明 ,bauhinione在体外有抑制 K562和tsFT 210
细胞增殖的作用 ,K562细胞对 bauhinione的作用敏
感 ,而 tsFT210细胞对bauhinione的作用不敏感。
Table 1　Proliferation inhibitory effects of bauhinione on two cell lines
Compound IC50(K562)/(mg·L-1) IC50(tsFT210)/(mg·L-1)
CDDP　　 33.3±4.5 >100　
Bauhinione 24.9±2.1 　111.36±3.5
　　CDDP— cis-Diaminedichloroplatinum
2.4　细胞周期各时相中细胞分布
将 bauhinione倍量稀释为 6个质量浓度 ,按文
献[ 4] 25-30方法 ,先在倒置显微镜下观察细胞的形
态学变化 ,再用流式细胞仪测试并分析细胞周期各
时相中的细胞分布 ,同时测得该化合物对 K562细
胞的最小抑菌浓度(MIC)。相同实验重复 3次 ,实
验结果用平均值±标准偏差表示[ 5-7] 。结果表
明 ,随着 bauhinione 质量浓度的增加 , Sub-G1 期
细胞的百分含量增大 。当质量浓度为 25 mg·L-1
时 ,细胞大量凋亡 , Sub-G1 期含量达到最高点 ,
倒置显微镜下观察细胞核皱缩 ,呈现花瓣状凋亡
小体[ 8] 。流失细胞仪计数结果仅为对照组细胞
数的 1/4。在剂量为 50 mg·L-1时 ,化合物在溶
液中析出结晶 ,因而作用强度下降。在质量浓度
为 1.56 ～ 12.5 mg·L -1时 ,G0-G1 期和 S 期细胞
百分含量降低 ,G2-M 期细胞百分含量逐渐增
多 ,但是幅度不大。化合物的 M IC值为 6.25 mg
·L-1(表 2)。
Table 2　Distributions of K562 cells within cell cycle and apoptosis( x±s , n=3)
Compounds
ρ(bauhinione)/
(mg·L -1)
φ(cells distribution in cell cycle)/ %
Sub-G1 G0-G 1 S G2-M
Control 1.23±0.15 51.93±4.40 20.20±0.75 27.87±4.06
Bauhinione 50 54.93±3.16 37.27±1.76 5.77±2.63 1.63±0.38
Bauhinione 25 63.70±3.83 22.73±3.04 6.13±2.10 7.7±0.26
Bauhinione 12.5 8.93±1.33 40.07±2.28 16.27±1.25 35.37±1.87
Bauhinione 6.25 3.63±0.68 56.40±2.65 13.87±0.42 26.00±1.57
Bauhinione 3.125 1.27±0.27 62.03±1.80 16.03±0.70 21.37±1.46
Bauhinione 1.56 0.97±0.12 53.87±0.91 18.57±0.31 27.53±0.78
2.5　时效关系考察
按照 文 献 [ 4 ] 25-30 方 法 , K562 细 胞 用
12.5 mg·L-1 bauhinione 分别处理 4 、8 、12 、16 、20 、
24 、36 、48 h ,先在倒置显微镜下观察细胞形态学变
化 ,再用流式细胞仪绘制细胞周期各时相中的细胞
分布的直方图(图 2),并绘制时效关系曲线。
110 　　　沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 24卷
A —Control;B—8 h;C—16 h;D—20 h;E—24 h;1—Sub-G1;2—G 0-G1;3—S;4—G2-M
Fig.2　Flow cytometric histograms of K562 cells treated by bauhinione within 24 h
　　4 、12 h 镜下观察 ,细胞变大变形 ,直方图显
示S 期细胞比例增加;16 、20 、24 h ,镜下可见变形
细胞增多 ,部分细胞出现凋亡 ,直方图显示S 期细
胞比例减少 ,G2-M 期和Sub-G1 期细胞比例增
加;36 、48 h的细胞 ,其直方图与 24 h的直方图类
似 ,细胞数减少 80%,说明 bauhinione 将细胞阻
滞在G2-M 期并使细胞不断的走向死亡(图 2)。
时效曲线清晰可见G2-M 期和Sub-G1 期细胞
百分含量的变化趋势(图 3)。
3　结论
从天然产物中寻找抗癌化合物或其先导化合
物是开发抗癌新药的一条捷径。作者利用体外活
性追踪的方法从云南植物洋紫荆中分离得到新化
合物bauhinione 。Bauhinione在体外有抑制 K562细
胞增殖的作用 ,为洋紫荆的抗癌活性成分之一 ,该
化合物为细胞周期抑制剂增添了新的结构类型。
◇—Sub-G 1;○—G 2-M
Fig.3　Dose-dependent effects of bauhinone on cell cycle
of K562
Bauhinione对 K562 的细胞增殖抑制作用是通过
G2-M 期抑制和诱导凋亡实现的 ,其作用随着剂
量的增加而增强 ,在 25 mg·L-1时达到最大值 ,随
着时间的增加而增强 。
由于 bauhinione 得到的量很少 ,其细胞周期
抑制的机制有待进一步研究。
111第 2 期 赵燕燕等:洋紫荆中菲醌化合物 bauhinione对 K562细胞的增殖抑制作用　　　
参考文献:
[ 1] ZHAO Yan-yan , CUI Cheng-bin , SUN Qi-shi.Isola-
tion , identification of the chemical constituents from
Bauhinia variegata L [ J] .Chinese Journal of Medici-
nal Chemistry , 2004 , 14(5):294-297.
[ 2] ZHAO Yan-yan , CUI Chen-gbin , SUN Qi-shi.A new
phenanthraquinone from the stems of Bauhinia varie-
gate L [ J] .Journal of Asian Natural P roducts Re-
search , 2005 , 7(6):835-838.
[ 3] HAN Yue.Research and development o f anticancer
drugs and experiment techniques [ M] .Beijing:Peking
University Health Science Center and Peking Union
Medical College P ress , 1997:286-287.
[ 4] SONG Gen-ping , LI Su-w en.Principle and application
of flow cy tometry [ M ] .Beijing:Beijing Normal Uni-
versity P ress , 1992.
[ 5] HERNANDEZ M M , HERASO C , VILLARREAL M
L , et al.Bio logical activities of crude plant ex tracts from
vitex trifolial(verbenaceae)[ J] .J Ethnopharmaco ,
1999 , 67:37-44.
[ 6] KING R W , DESHAIES K J , PETERS J M , et al.How
pro teolysis drives the cell cy cle [ J] .Science , 1996 , 274:
1652-1665.
[ 7] YUSUF A , HUANNUN N.Apoptosisan and dilemma of
cancer chemotherapy[ J] .Blood , 1997 , 89(6):1845-1853.
[ 8] 姜泊.细胞凋亡基础与临床 [ M] .北京:人民军医出
版社 , 1999:145-155.
Cell proliferation inhibitory effect on human
myeloid leukemia K562 of bauhinione from
Bauhiniae variegata L.
ZHAO Yan-yan1 , CUI Cheng-bin2 , SUN Qi-shi3
(1.School of Pharmacy , Yantai University , Y antai　264003 , China ;　2.Inst itute of Pharmacology
and Toxicology , Academy of Mili tary Medical Sciences , Beij ing 　100850 , China;　3.School of Tradi-
tional Chinese Materia Medica , Shenyang Pharmaceutical University , Shenyang　110016 , China)
Abstract:Objective To investigate the cell proliferation inhibito ry effect on human myeloid leukemia K562
of bauhinione ,which obtained from the plant of Bauhiniae variegata L.Methods IC50 values were detected
by SRB assay.The cell cy cle inhibi tion and apoptosis inducing effect w as analy zed by flow cy tometry(FCM)
accompanied w ith mo rphological observation under light microscope.The minimal inhibi tory concentrat ion
(MIC)was assayed wi th the multiple dilut ion method.The time-ef fect relation at 12.5 mg·L -1 was de-
tected.Results The IC50 value of bauhinione on the tw o cell lines were(24.9±2.1)mg·L-1 and(111.36±
3.5)mg·L-1 respectively.The M IC value of bauhinione w as 6.25 mg·L-1.The cell proliferat ion inhibito-
ry effect of bauhinione w as due to its G2-M phase inhibi tion and apoptosis induct ion.The time-effect re-
lation curve was given.Conclusions Bauhinione has the cell proliferation inhibitory effect on K562 cell.
Key words:Bauhiniae variegata L.;bauhinione;K562 cell;human myeloid leukemia
112 　　　沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 24卷